吴军 孙洋 宫兵
（黑龙江省医院 150036）
【摘要】 目的：探索不同浓度牛磺酸对成年雄性大鼠脊髓胶状质（substantia gelatinosa, SG; lamina II of Rexed）神经细胞的作用机制。方法： 用乌拉坦（1.5g/kg，腹腔注射）向成熟雄性Wistar大鼠（6～7周）施以全身麻醉，随后行腰骶部椎板切除术。取出腰骶部的脊髓（L1-S3），利用振动微切片机切取 500-600 μm厚度的脊髓切片，放置于标本记录槽内的尼龙网托上。然后利用全细胞膜片钳技术记录 SG神经元的生物电信号。用不同浓度牛磺酸、荷包牡丹碱以及士的宁等溶液灌注记录槽。结果：牛磺酸在作用于SG神经元甘氨酸受体所引起的效应远大于甘氨酸：本研究中当牛磺酸和甘氨酸应用浓度相同时，牛磺酸的诱发电流振幅（ITau）都比甘氨酸的诱发电流(IGly）振幅大。牛磺酸所引起的电流可能与氯离子的电导率增加有关。牛磺酸在0.3mM时可以激活甘氨酸受体，在3mM时不仅激活甘氨酸受体并且激活γ氨基丁酸A（GABAARS）受体。结论：牛磺酸在SG神经元中可能扮演一种重要的神经递质或调节器，并且可能具有镇痛作用。
【关键词】γ-氨基丁酸A受体；氯离子电流；甘氨酸受体；胶状质；牛磺酸；全细胞膜片钳
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）27-0069-02
脊髓背角的Ⅱ层，又称为胶状质（substantia gelatinosa, SG；lamina II of Rexed），在显微镜下为半透明的弧状，在脊髓背角处最为明显。SG 细胞层是伤害性传入神经元的主要终点，同时它也是调控疼痛的关键部位[1]。SG神经元在接受来自外周性躯体性痛觉信号的初级传入神经纤维信号投射的同时也受到抑制性生物活性物质的调控，通过整合各种信号以达到镇痛的目的[2]。因此，抑制这一特殊部位的痛觉信息传递是镇痛的关键。但是由于SG的结构形式特殊、神经元排列层次多、细胞小、联系复杂，因而多年来神经生物学界对SG本质的探索进展缓慢。
牛磺酸又名牛胆酸，是一种在组织中都含量丰富的氨基酸，尤其在脑和脊髓中[3]。牛磺酸是甘氨酸和GABA结构类似物，而甘氨酸和GABA又在疼痛的脊髓抑制通路中扮演重要角色。既往研究对牛磺酸在体内的镇痛作用有一定了解[4.5],但牛磺酸在镇痛机制中的确切作用尚未完全清楚。
本研究主要是应用全细胞式膜片钳记录方法来研究和探讨牛磺酸对成年大鼠SG细胞的影响和其可能的作用机制，即牛磺酸作用部位是否为大鼠SG神经元，作用效应是否与甘氨酸系统或GABA神经系统有关，从而完善痛觉调控理论，并为临床寻找新的镇痛药物提供理论基础。
1.材料与方法
1.1 实验动物成年雄性 Wistar 大鼠（6～7周），体重为 300±20g。
1.2 主要实验仪器及设备
振动微切片机 DTK-1500，Dosaka有限公司，京都，日本
玻璃微电极吸管 欧米茄，瑞士
膜片钳 MD USA
1.3 主要实验材料和试剂
乌拉坦深圳市欧氏浩达科技有限公司；氯化钠，氯化钾，氯化钙，氯化镁，磷酸氢二钠，碳酸氢钠，葡萄糖
1.4 实验方法
1.4.1配置主要溶液Krebs溶液
1.4.2实验方法
（1）制备脊髓切片本实验采用成年（6～7周）Wistar大鼠。深度乌拉坦（1.5g/kg）麻醉后快速断头，手术取出脊髓 ,选取腰骶膨大部（L1～L6，保留腹根）段脊髓。振动切片机，快速切取脊髓冠状面切片若干（厚度为 500～600μm）,将切片快速放置在记录槽中的一个尼龙网上，以15毫升/分钟的流速灌注36℃的 Krebs溶液，随后进行全细胞膜片钳记录。
（2）全细胞膜片钳记录
首先在显微镜下对第二层的脊髓背角（胶状质，SG）神经元进行全细胞膜片钳记录,观察脊髓SG神经元接受刺激之后的全细胞膜电流变化。
本研究中长时程灌流不同浓度牛磺酸，施加甘氨酸和γ-氨基丁酸受体拮抗剂：士的宁和荷包牡丹碱。除了反转电位进行检查，在整个实验中细胞膜电位在0 mV进行。为探究牛磺酸引起电流的离子成分，将不同的钳制电位应用恒定浓度牛磺酸（0.3mM）来研究ITau的反转电位；
1.4.3数据采集
模拟信号经放大器放大之后通过数模转换器数字化后进行数据分析。
1.4.4数据统计分析
实验所得所有数据均以平均值±标准误表示。数据统计分析SPSS 17.0统计软件使用t检验和方差分析处理。P<0.05,表示结果有统计学意义，P<0.01,被认为有显著性差异。
2.结果
2.1牛磺酸与甘氨酸对SG神经元作用效果比较
图1示：当牛磺酸和甘氨酸应用浓度相同时，牛磺酸的诱发电流振幅（ITau）均比甘氨酸的诱发电流振幅(IGly）大，统计结果显示当二者浓度均为10mM时，ITau（151.1±4.9pA）与IGly（96.7±8.1pA）之间差异最大（P<0.05）。因此，牛磺酸比甘氨酸对于SG神经元的甘氨酸受体作用效果更显著。
2.2 牛磺酸引起电流的离子成分分析
为了探究SG神经元中负责ITau的离子，将不同的钳制电位应用牛磺酸（0.3mM）来研究ITau的反转电位。ITau的电流—电压关系曲线（图2）表明当反转电位约为-70mV，其最接近于在目前实验条件下使用能斯特方程计算出的氯平衡电位的理论值，表明了ITau主要与氯化物电导的增长有关。
2.3 甘氨酸和GABA受体拮抗剂对牛磺酸作用效果的影响
基于这些（图3）结果，当灌注士的宁（浓度为2 μM）后，ITau（牛磺酸浓度为0.3mM）被抑制至基态水平的8.07±1.6%（P <0.01，n=12）。但荷包牡丹碱（浓度为20μM）对其无影响（为基态水平的100.1±5.3％，P =0.94，n=12）。
牛磺酸在浓度为0.3mM激活GlyRs，而在浓度为3mM时同时激活GlyRs和GABAARs（图3）
图1.牛磺酸（TAU）和甘氨酸（Gly）对SG神经元的作用效应。
图2. ITau的电流—电压关系曲线。
3.讨论
在本研究中，我们首次证明牛磺酸似乎比甘氨酸作用效果更好，并且对SG神经元的甘氨酸受体具有完全激动作用。本研究结果表明，只有相对较高浓度的牛磺酸可以激活GABAARs，表明牛磺酸对SG神经元GABAARs只是一种效果较弱的受体激动剂。
既往有研究报告指出，在正常生理条件下大鼠脊髓中的牛磺酸浓度与甘氨酸浓度几乎相同。此外有研究表明，在免疫组化中类似牛磺酸阳性表达物质主要集中在脊髓背角I-II层纤维，剩余各层纤维未见明显表达。牛磺酸在脊髓背角的特殊分布解释了为什么其在骶髓后连合核神经元作为GlyRs的部分受体激动剂，而在SG神经元中作为完全受体激动剂。牛磺酸在假定抑制轴突末端的特殊分布提高了牛磺酸在SG神经元中对伤害性处理可能有着显著重要性的可能性。这符合早前研究：在电、化学或疼痛刺激后，脊髓背角可见大量牛磺酸释放。因此，牛磺酸，很可能在这一区域主要作用于GlyRs，通过对疼痛传导通路进行调整发挥作用。已有研究证明，通过食补牛磺酸可以减弱神经性疼痛，并且前扣带皮层是牛磺酸起镇痛作用的主要部位。这个重要的发现使牛磺酸成为一种治疗神经性疼痛的可能性药品。我们的研究结果表明，除了前扣带皮层，SG神经元可能是牛磺酸起镇痛作用的另一个部位。对于此种推断，我们尚需要进一步的行为学实验研究来验证。
【参考文献】
[1] Yoshimura M, Jessell T. Amino acid-mediated epsps at primary afferent synapses with substantia gelatinosa neurones in the rat spinal cord[J]. J Physiol, 1990, 430: 315-335.
[2] Huxtable R J. Taurine in the central nervous system and the mammalian actions of taurine[J]. Prog Neurobiol, 1989, 32(6): 471-533.
[3] Banerjee R, Vitvitsky V, Garg S K. The undertow of sulfur metabolism on glutamatergic neurotransmission[J]. Trends Biochem Sci, 2008, 33(9): 413-419.
[4] Yan L P,Wu X T,Yin Z Y, et al.[effect of electroacupuncture on the levels of amino acid neurotransmitters in the spinal cord in rats with chronic constrictive injury][J].Zhen Ci Yan Jiu,2011,36(5):353-356, 379.
[5] Terada T, Hara K, Haranishi Y, et al. Antinociceptive effect of intrathecal administration of taurine in rat models of neuropathic pain[J]. Can J Anaesth, 2011, 58(7): 630-637.
本研究为黑龙江省留学归国科学基金项目(LC201015)
图3.灌注GABAAR受体拮抗剂士的宁对ITau的影响。
论文作者:吴军,孙洋,宫兵
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第27期供稿
论文发表时间:2015/11/2
标签：牛磺酸论文; 甘氨酸论文; 神经元论文; 脊髓论文; 受体论文; 浓度论文; 作用论文; 《医药前沿》2015年第27期供稿论文;