1.威海市立二院泌尿外科 2.威海市立二院中医科 3.威海市立二院病案科 山东威海 264200
摘要：目的 探讨华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊对膀胱癌荷瘤小鼠瘤体的生长抑制作用机制。方法 建立膀胱癌荷瘤小鼠模型，随机分为空白对照组、对照组及实验组，肿瘤生长1周时开始给药，实验组给予华蟾素注射液及复方斑蝥胶囊，对照组给予注射用吡柔比星，并设空白对照（仅用生理盐水），给药量均以临床常用量为标准，给药4周后，取血清分别测量、记录白细胞介素-2（IL-2）含量，取脾脏研碎，分别测量、记录淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）活性。结果 空白对照组、对照组、实验组裸鼠血清IL-2含量分别是（39.15±1.06 U/ml、36.08±1.89 U/ml、57.22±3.64 U/ml），组间差异均具有统计学意义（P<0．05）；LAK杀伤活性分别是（22.24±1.34%、19.67±0.39%、25.91±1.48%），组间差异均具有统计学意义（P<0．01）。结论 华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊抑制膀胱癌肿瘤生长作用，其机制主要为提高机体免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡。
关键词：华蟾素；复方斑蝥胶囊；膀胱癌；荷瘤小鼠；IL-2；LAK
膀胱癌是泌尿系统威胁人类健康最常见的恶性肿瘤，肌层浸润性膀胱癌危害尤甚，目前对浸润性膀胱癌最有效的治疗是采用根治性全膀胱切除，但是在根治术后2年内约有50%的患者会发生复发、转移，并最终死于肿瘤[1]。然而，对复发、转移，失去手术机会的中晚期膀胱癌患者，如何改善其症状、提高生存质量、延长生存期，依然是个难题。华蟾素注射液是我国传统药材中华大蟾蜍阴干全皮加工制成的水溶性注射剂，具有清热解毒、利水消肿、化瘀溃坚等作用[2]。华蟾素注射液已广泛用于肝癌等多种恶性肿瘤的治疗，但华蟾素对泌尿系肿瘤的应用特别是基础研究较少。复方斑蝥胶囊的主要成分为斑蝥、熊胆粉、人参、黄芪、刺五加、半枝莲等，具有破血散结、祛淤解毒、抗癌的功效，临床上主要用于治疗原发性肝癌[3]、肺癌[4]、直肠癌、恶性淋巴瘤等。尚未有复方斑蝥胶囊治疗泌尿系肿瘤的报道。本实验采用华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊对膀胱癌荷瘤小鼠瘤体的生长抑制作用，探讨其抗膀胱癌作用机制。
材料与方法
l动物 BALB／c裸小鼠，4—6周龄，雌性，体重17—20 g，购自中国科学院上海动物研究所，SPF条件饲养。
2药物 华蟾素注射液（5mL／支），安徽金蟾生化股份有限公司产品，批号041016；复方斑蝥胶囊（0.25g/粒），陕西方舟制药股份有限公司产品，批号050701；注射用吡柔比星（10mg/支），深圳万乐药业有限公司产品，批号H10930105。
3 动物模型的制备、实验分组及药物处理 参照赵培等研究[5]，T24细胞采用200ml大玻璃培养瓶于含10% FCS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，待细胞长至瓶底80%～90%后，用0.25%的胰酶将贴壁生长的细胞用直接吹打法传代，待传代足够数量后取对数生长期细胞配制成细胞悬液，台盼蓝染色，牛鲍计数板计数，活细胞数达3×107个后，调整细胞浓度为1×107 /ml，准备接种至裸鼠身上，在18只裸鼠右后腿背侧同一部位内接种膀胱癌T24细胞200ul共2×106个，肿瘤生长1周时开始给药。将18只裸鼠随机分为三组，每组6只，即空白对照组（生理盐水组），腹腔注射等体积生理盐水（0.2ml／只）；对照组（注射用吡柔比星组），腹腔注射吡柔比星注射液25mg／（㎡•d）（加生理盐水稀释至0.2ml/只）；实验组，腹腔注射华蟾素注射液5ml／（kg•d）（加生理盐水稀释至0.2 ml／只），每只裸鼠口服复方斑蝥胶囊25mg/d。
4 检测指标及方法
4.1 免疫功能试验 对荷瘤小鼠IL-2水平、LAK细胞杀伤活性的影响：取各组小鼠血清，按文献[6]方法检测IL-2的含量；取出脾脏研碎，分离脾细胞培养、以乳酸脱氢酶释放法[6]测定LAK杀伤活性。
4.2 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行相关数据分析，计量数据以（ ±S）表示，采用单因素方差分析法检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
空白对照组、对照组、实验组裸鼠血清IL含量间差异均具有统计学意义（P<0．05）；LAK杀伤活性间差异均具有统计学意义（P<0．01）。
讨论
机体的免疫状态与肿瘤的发生、发展密切相关，而机体的抗肿瘤效应以细胞免疫为主。华蟾素能提高机体的免疫功能，增强免疫作用有助于其抗肿瘤作用的发挥。实验研究发现，华蟾素注射液不仅可诱使健康献血者PBMC产生IL- 2，还可增加LAK细胞的杀伤活性[7]，IL- 2主要是由Ｔ辅助细胞（Th）产生的细胞因子，具有很强的免疫增强作用，对巨噬细胞、Ｋ细胞、Ｔ细胞、Ｂ细胞等多种免疫效应细胞都能促其活化和增强对肿瘤细胞的杀伤能力。LAK细胞则是一种由淋巴因子活化的杀瘤谱最广、效应最强的杀伤细胞，它只杀伤肿瘤、不杀伤正常细胞[8]。华蟾素可能是通过增强机体对肿瘤的免疫功能而实现其抗癌作用。这与近年来在现代分子生物学和基因工程技术飞速发展的推动下，以免役治疗为基础而来的生物治疗[9]有异曲同工之妙。传统的肿瘤治疗模式为手术、放疗和化疗，这些治疗方法基本都着眼于直接杀伤肿瘤细胞，常难彻底消灭肿瘤细胞，又易损伤正常组织，特别是伤害在机体抗肿瘤防御中占重要地位的免役系统，尤其是细胞免役，而肿瘤患者本身免疫监视就有缺陷，存在免疫逃避现象。免疫治疗主要靠主动或被动的调动机体的免疫系统，对肿瘤进行杀伤或抑制。而华蟾素中的蟾毒灵（二羟蟾毒二烯酸内酯）则可抑制Na+-K+-ATP酶引发钙内流从而激活蛋白激酶C（protein kinase c PKC）和细胞外信号调节激酶（ERK），后两者可介导白细胞介素-1 （IL-1 ）和肿瘤坏死因子- （TNF- ）的表达[10]。复方斑蝥胶囊方中含有斑蝥、熊胆粉、半枝莲等活血化瘀、解毒消肿类中药，还有人参、黄芪、刺五加等补益类中药。现代药理研究证实，斑蝥、半枝莲等均有良好的抗肿瘤作用。半枝莲具有解热、抗癌、护肝、免疫调节、抑菌、抗病毒等药理作用[11]。人参中的人参皂苷、人参多糖等除对机体具有强壮和增强免疫力的作用外，对肿瘤细胞也有直接的抑制作用[12]；刺五加皂苷（ASS）对胃癌细胞凋亡的体外诱导实验显示，ASS促进体外培养胃癌细胞凋亡的作用明显强于维甲酸[13]；黄芪多糖在体内可显著增强刀豆蛋白诱导的淋巴细胞增殖，增加荷瘤小鼠脾细胞总数，可通过增强机体的免疫活性提高抗肿瘤功能[14]。以上成分综合作用的结果，可能导致复方斑蝥胶囊对肿瘤的抑制。
本实验中对照组膀胱癌荷瘤小鼠注射用吡柔比星化疗后LAK细胞活性和IL-2水平较空白对照组显著低下，差异具有统计学意义，而华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊组较空白对照组LAK细胞活性和IL-2水平显著升高，差异具有统计学意义，说明华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊显著提高膀胱癌荷瘤小鼠LAK细胞活性和IL-2水平，促进机体抗肿瘤免疫，增强机体抗肿瘤能力。
总之，华蟾素注射液配伍复方斑蝥胶囊通过提高膀胱癌荷瘤小鼠LAK细胞活性和IL-2水平，从而增强机体细胞免疫功能，进一步诱导膀胱癌细胞凋亡，达到治疗膀胱癌的目的。
参考文献：
[1]Hussain SA，Nicholas DJ.The systemic treatment of advanced and metastatic bladder cancer[J].Lancet Oncol，2003，4（8）：489-97.
[2]《中医药大辞典》编辑委员会.中医大辞典.中药分册[M].北京：人民卫生出版社，1982：419
[3]曲震，史彦芬，王义善.HLF方案合并复方斑蝥胶囊治疗原发性肝癌30例近期疗效观察[J].中国中医药科技，2002，9（6）：336.
[4]江洪，张太君，邓小玲.复方斑蝥胶囊治疗原发性肺癌临床总结[J].实用中医药杂志，2006，22（3）：166-167.
[5]赵培，罗春丽，吴小候，等.藏红花素对人膀胱移行细胞癌T24细胞裸鼠移植瘤的实验研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2008，（6）：308-312.
[6]柳忠辉，吕昌龙.免疫学常用实验技术[M].北京科学出版社，2002：125-130.
[7] 赵兴梅，陈晓明，杨祖贻，等.华蟾素注射液对人IL -2水平及LAK细胞活性的影响[J].中药药理与临床，1999，15（6）：33-35
[8] 文立民.白细胞介素2治疗癌症的评价[J].国外医学肿瘤学分册，1993；20（5）∶302
[9] Rosenberg SA.Principles of cancer management：biologic therapy.in：DeVita VT Jr，Hellman S，Rosenberg SA.eds.Cancer：Principles & practice of oncology[M].5th ed.Philadelphia：Pippincott-Raven，1997，349~373.
[10] Masahiro Kurosawa，Satoshi Numazawa，Yoshihiro Tani，and Takemi Yoshida.ERK signaling mediates the induction of inflammatory cytokines by bufalin in human monocytic cells[J].Am.J.Physiol：Cell Physiology，2000，3（278）：500-508
[11]邹箴蕾，吴启南.半枝莲的化学成分及药理作用研究进展[J]时珍国医国药，2005，16（2）：149-150.
[12]王海南.人参皂苷药理研究进展[J]中国临床药理学与治疗学，2006，11（11）：1201-1206.
[13]王志睿，林敬明，张忠义.刺五加化学成分与药理研究进展[J]中药材，2003，26（8）：603-606.
[14]张蕻，梁小军，朴晋华，等.复方斑蝥胶囊体内外抗肿瘤作用的实验研究[J]山西中医学院学报，2003，4（3）：17-19.
论文作者:孙荣生1,邢惠芝2,逄建议1 郑兰凤3 李祖广 1
论文发表刊物:《健康世界》2014年23期供稿
论文发表时间:2016/4/5
标签：斑蝥论文; 细胞论文; 膀胱癌论文; 复方论文; 注射液论文; 肿瘤论文; 胶囊论文; 《健康世界》2014年23期供稿论文;