刘慧松[1]2003年在《酒精性股骨头坏死的发病机理及相关研究》文中研究指明人类饮用酒精类饮料已经有数千年的历史，如今，酒精类饮料的消耗量日益增多，而由于过量饮酒所致的骨坏死病例也渐见增多。目前在非创伤性骨坏死的发病率中，酒精性骨坏死仅次于激素性骨坏死。酒精性骨坏死患者多为有多年酗酒史的中青年，致残率极高，严重破坏生产力，已引起广泛关注。有关其发病机制，仍存在有较大争议，对该病防治尚缺乏有效的手段。针对以上问题，本课题开展了以下研究：一、酒精性骨坏死动物模型的研制及组织病理学变化的实验研究(1)目的：制作股骨头坏死的动物模型，观察骨及相关组织的在酒精作用下的病理改变，从而探讨其发病机理。(2)方法：采用中国大耳白兔55只，分叁组。全量实验组以50度饮用白酒按10ml/kg／d剂量灌胃；半量实验组以5ml／kg／d剂量灌胃；对照组以50％葡萄糖液，按10ml／kg／d剂量灌胃。于第二、四、六、八周时分批处死(第二、四、六周叁组动物各处死两只，第八周时全部处死)，观察动物双侧股骨头、双侧肱骨头骨质变化情况；取动物内脏(心、肝、肺、肾)及肌肉标本行光镜观察；取股骨近、远端及肱骨近端骨标本，行光镜及透射电镜观察组织细胞结构病理改变。根据有无骨坏死表现，计算各组动物骨坏死发生率。采用高倍显微镜，观察各期骨标本上空骨陷窝出现的百分率。对所得数据进行统计学处理。(3)结果：全量实验组动物骨坏死发生率较半量组明显增高(83.3％：63.6％)。组织病理学观察见坏死的骨病灶多出现于股骨头软骨下区，骨髓造血组织减少，出现空泡样变性；骨小梁稀疏变细，有溶解现象，骨小梁内空骨陷窝增多。(4)结论：采用大剂量高浓度白酒灌胃方法，可以成功制造出酒精性骨坏死动物模型，其发病率与剂量相关。二、酒精性股骨头缺血性坏死血生化、血凝指标变化的研究(1)目的：探索长期应用酒精所致股骨头缺血性坏死的高危因素，寻求筛选酒精性股骨头坏死高危群体的检测手段。(2)方法：采用酒精灌胃方法制造动物模型共23只(同第一部分)，分别于实验前后空腹心内取血，检测血脂成分(CHOL、TRIG、HDL-C、LDL-C)、肝功(ALB、ALT、AST、ALP)、凝血系统指标(APTT、PT、TT、Fbg)及血栓前状态指标(PAI、D-Dimer、t-PA、AT-Ⅲ)。再按骨组织酒精性股骨头坏死的发病机理及相关研究摘要病理学观察结果将动物分为两组，即骨坏死组(ON)及非骨坏死组(NON)，分别比较两组动物上述指标在实验前后的差异。(3)结果:两组动物血CHOL指标于实验后明显升高(P<0.01)，ON组升高较多，与NON组比较有显着性差异(P<0.05);实验后两组动物血ALT、ALP指标都有升高，与实验前比较有统计学意义(P<0.001)，但实验后两组动物该指标比较差异无统计学意义;实验后两组动物血ALB、刀G值降低，与实验前比较有统计学意义(P<0.001)，但实验后两组动物该指标比较差异无统计学意义;两组动物血t一PA、Al’-m指标降低，其中ON组实验后与实验前比较(P<0.01)，NON组实验后与实验前比较 (P<0 .05)，实验后两组动物Al’-m指标比较有显着性差异(P<0.01)，t一PA指标比较也有显着性差异(P<0.05);实验后两组动物血PAI指标较实验前都有升高，其中ON组实验前后数据比较有非常显着性差异(P<0.001)，NON组该指标升高(P<0.05)。实验后两组动物该指标比较有显着性差异(P<0.05);实验后两组动物血D一Dimer指标较实验前都有升高，其中ON组升高有显着性差异(P<0 .01)，NON组该指标升高无统计学意义。实验后两组动物该指标比较无显着性差异。 (4)结论:长期酗酒可以导致肝功受损，血脂升高(胆固醇升高明显)，长期酗酒还可以导致血凝状态的改变(高凝低纤溶状态)。酒精导致的血脂、血凝状态改变，而后出现骨组织微循环代谢异常，是股骨头缺血坏死的可能发病机理。血液学指标(CHOL、t一队、Al飞m、PAI)的测定可用于筛选骨坏死高危群体，有助于股骨头缺血性坏死的早期预测。叁、二磷酸盐、藻酸双醋钠对酒精性股骨头缺血性坏死预防作用的实验研究 (l)目的:探索二磷酸盐、藻酸双酷钠联合应用对酒精性骨坏死的预防作用。 (2)方法:采用22只健康中国大耳白兔，随机分为两组。A组(酒精组)12只，同第一部分制作股骨头缺血性坏死动物模型全量实验组;B组(药物预防组)10只，在50度饮用白酒按10ml/k酬剂量灌胃的同时，每日分别口服:藻酸双脂钠(Pss)药物50mg、氨轻亚丁基二磷酸盐(Alendronate，天可)2.smg。持续8周。分别于实验前后行心内取血，检测血脂成分(CHOL、T犯G、HDL一C、LDL一O、凝血系统指标(妙TT、PT、TI’、Fbg)及血栓前状态指标(PAI、D一D加er、t一PA、Al’-m)，比较两组动物上述指标的差异，对所得数据行统计学处理。动物实验后处死，取心、肺、肝、肾及肌肉等标本，行光学显微镜观察其组织病理学酒精性股骨头坏死的发病机理及相关研究摘要改变;取股骨近、远端及胧骨头标本，行光学显微镜检查其组织病理学改变。根据标本上有无骨坏死表现，计算两组动物骨坏死发生率。(3)结果:实验结束后，两组动物血CHOL、T刃G指标都有
宋旸[2]2015年在《骨代谢相关基因标签SNPs与ONFH发病风险及临床表型的相关性研究》文中研究表明股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂病。ONFH病理过程复杂，病因及发病机理尚不完全清楚，早期诊断困难，最终不得不进行人工关节置换,一直是骨科临床难治性疾病之一。鉴于近年来ONFH发病率呈逐年增加的趋势，及早阐明ONFN分子病因学及其分子发病机理，使其防治时段前移，是控制ONFH发病率的关键。近年来ONFH分子发病机理研究进展的重要标志之一，是陆续提出了纤溶酶原激活/抑制系列、血管生成系列、脂代谢系列、Ⅱ型胶原系列、细胞因子系列、生长因子系列等数十个基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其他易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与、并由环境因素诱导的复杂病。与符合孟德尔遗传规律的单基因病不同，在一个ONFH患病的个体中究竟存在多少个易感基因？每组易感基因对应的临床表现型是什么？需要多少个易感基因的累积最终引起或加重ONFH的发生发展？这些问题的回答要比孟德尔遗传病复杂得多。基因多态性的信息是海量的，寻找ONFH易感基因的研究往往需要大样本量多基因位点的分析，并确认其与ONFH发生发展及其临床表型的相关性，这也是ONFH分子发病机理研究较为滞后的原因之一。目前，国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题：①零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述；②仅限于单纯的SNPs位点分型的多，与ONFH临床表型的相关研究少，难以确认SNPs位点与ONFH发生发展的联系；③单纯报告基因突变位点的研究多，对基因突变后的表达效率及基因功能的阐述较少，无法进一步明确突变基因位点在ONFH发生中的作用。④尤为重要的是骨代谢重要信号通路的发现与功能研究，为阐述ONFH的分子病变基础提供了前所未有的机遇，但是到目前为止，尚未见到相关骨代谢信号通路系列基因多态性与ONFN发病风险的报告。这些瓶颈问题难以使ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接，是阐述ONFH分子发病机理进展的束缚，也是ONFH分子病因学研究亟待解决的关键问题。本文建立在ONFH分子发病机理进展与存在瓶颈问题的基础上,联合应用临床分子诊断技术的创新集成，分别阐述：①优选骨代谢关键基因启动子区或编码区的Tag SNPs作为研究的靶位点，系统阐述其基因分型、等位基因频率、单倍体型、多基因之间的交互作用与ONFH发病风险的关联，阐述ONFH遗传易感分子靶点；②研究Tag SNPs基因分型、等位基因频率、单倍体型与ONFH临床表型的相关性，阐述遗传性易感位点在ONFH发生发展中的作用，解析TagSNPs多态性与临床表型的内在联系；③分析不同基因分型及单体型之间蛋白水平表达的差异，观察基因突变对表达效率及其功能的影响，从整体水平阐述突变位点与基因功能的相关性；④选择骨代谢信号通路系列关键基因Tag SNPs作为研究的靶位点，原始创新性地阐述TagSNPs靶位点分子遗传学与临床表型之间的内在关系,筛查ONFH发生发展密切相关的分子靶点，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶标，促进分子病因学的研究成果与ONFH的人群防治及早对接。本文研究主要获得如下结果：1.应用LDR及分子测序技术在361例ONFH组及健康对照组体系中成功完成了SREBP-2、IGFBP3、SOX9基因7个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示SOX9基因rs1042667(A/C)-rs12601701(A/G) A-A单体型在ONFH组的分布频率显着低于对照组（P=0.03），提示A-A单体型为保护性单体型，携带A-A单体型的个体可能减低ONFH发病风险。此外，SREBP2rs105271（7A/G）-rs2267439(C/T)-rs2267443(A/G）A-T-G与G-T-A单体型在ONFH组的分布分别具有明显低于对照组（P=0.063)和高于对照组的趋势（P=0.076)。TagSNPs之间交互作用的分析结果发现SREBP2rs1052717（A/G）与IGFBP3rs3110697(A/G)位点之间交互作用与ONFH风险相关（P=0.037),为ONFH多个微效基因联合致病提出了科学依据。2.应用免疫酶联技术分析IGFBP3、IGF-1、SREBP2及SOX-9基因蛋白水平表达的结果,发现ONFH患者组血清IGFBP3蛋白表达水平明显高于对照组（P=0.045），血清IGF-1蛋白表达水平也显着高于对照组（P=0.007）；ONFH组血清SOX9蛋白表达水平极显着低于对照组（P=0.000），不仅率先提出了ONFH患者IGFBP3、SREBP2及SOX-9基因蛋白水平表达异常的证据，而且阐述了ONFH患者靶基因的功能状态，提出了基因多态性影响基因功能的科学依据。尤其惹人注目的是首次发现ONFH患者血清SOX-9水平异常减低。3.在靶基因多态分子分型体系内，证实ONFH组血清TG含量明显高于对照组（P=0.01）,血清LDL-c水平也显着高于对照组（P=0.005），而HDL-c水平则显着低于对照组（P=0.00），LDL-c/HDL-c的比值亦明显高于对照组（P=0.00），在骨代谢关键基因Tag SNPs研究体系中同步提出了ONFH患者血脂代谢显着异常的证据，再次证实了脂代谢紊乱是ONFH的核心发病环节，而且提示了深入解析脂代谢关键基因的突变及其功能状态对ONFH发生发展的重要作用。4.应用生物信息学技术对TagSNPs的基因分型与ONFH的临床表型相关分析结果显示，SREBP-2基因rs2267439的TT型对ONFH临床分期显示统计学意义的趋势（P=0.056）；分别携带IGFBP3rs2453839位点TT型、CT型的ONFH患者，IV病例显着多于III期病例，而携带CC型的患者，IV病例显着少于III期（P=0.017）；基因型与ONFH的病变累计范围也显示出明显相关性，分别携带SOX9基因12601701位点GG型、AG型的ONFH患者，双髋受累病例显着多于单髋受累病例，而携带AA型的ONFH患者，双髋受累病例则显着少于单髋受累病例（P=0.009），提出了IGFBP3、SOX9基因的TagSNPs分别介入ONFH的临床分期及病变范围临床表型的科学依据。5.对SREBP-2、IGFBP3、SOX9的单体型与ONFH临床表型的相关分析结果显示，SOX9rs1042667与rs12601701的两个多态位点所具有的4个单体型中，3个单体型与病变累及范围相关，分别是携带A-A单体型的ONFH患者，双髋病变例数明显低于单髋病变例数（P=0.03)；携带A-G单体型的ONFH患者，双髋病变例数明显高于单髋病变例数（P=0.013)；携带C-A单体型的ONFH患者，双髋病变例数则明显低于单髋病变例数（P=0.048)，从而率先提出了与ONFH临床表型密切相关的SOX9基因单体型。6.率先应用质谱分析技术在377例ONFH组及健康对照组体系中完成了Wnt通路GSK3β、SFRP4基因4个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示SFRP4rs1052981CC型携带者，发病年龄显着早于TC及TT携带者（P=0.05），ONFH组SFRP4C-A单体型的分布具有明显低于对照组的趋势（P=0.073），提示SFRP4C-A单体型可能是一种保护作用的单体型，携带此单体型可能具有减低ONFH发病风险的趋势；GSK3βrs3755557TA携带者，男性患者具有高于女性患者的趋势（P=0.067），分别提出了Wnt信号通路SFRP4、GSK3β的分子遗传学与ONFH临床表型相关的依据。7.应用质谱分析技术完成了RANK/RANKL/OPG通路的OPG、RANK、RANKL、TRAF6、NFATC15个基因10个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示ONFH组携带NFATC1rs9518CC基因型的频率具有高于对照组的趋势（P=0.057），NFATC1rs9518TC型携带者，Ⅳ期病变的比例显着高于Ⅲ期（P=0.03）； OPGrs2073617TT型携带者,特发性ONFH的比例显着高于激素性和酒精性ONFH(P=0.02); TRAF6rs5030411(C/T)-rs5030416(C/A)的C-C单体型携带者，双髋病变的比例具有明显高于单髋病变的趋势（P=0.06）；RANKL rs1054016与RANKL rs9525641的交互作用与ONFH发病风险显着相关（P=0.026)。率先阐述了RANK/RANKL/OPG通路多基因位点与ONFH发病风险相关，它们或者以等位基因型或单体型的方式影响ONFH的病因学分类、病变分期以及病变范围，或者以协同作用的方式影响ONFH发病风险，提出了RANK/RANKL/OPG通路与ONFH发病风险相关的分子靶点。8.应用质谱分析技术完成了骨代谢关键转录因子COL2A1、Runx-2、Osterix、成脂分化关键转录因子PPARγ及IGFBP3基因的11个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果发现不仅ONFH组携带PPARγrs2920502CC基因型的频率显着高于对照组（P=0.0005），而且ONFH组携带PPARγrs2920502等位基因C的频率也显着高于对照组（P=0.0005)，而携带等位基因G的频率则显着低于对照组（P=0.0005),首次提出了ONFH风险密切相关的PPARγ突变位点。研究进一步发现ONFH组携带IGFBP3rs2132572AA基因型的频率亦显着高于对照组（P=0.042）, rs2132572GA型携带者，双侧髋受累的比例显着低于单侧髋（P=0.039）；COL2A1rs2070739AA型携带者的发病年龄显着高于GG型与GA型携带者（P=0.008）； COL2A1的A-T-G-A单体型携带者，双髋病变的比例显着低于单髋病变，提示了多个转录因子的基因多态性协同作用影响ONFH的发生发展，进一步提出了与ONFH发病风险相关的多个分子靶点。9.本研究发现转录因子多个TagSNPs之间的交互作用与ONFH风险显着相关，包括COL2A1rs3809322与COL2A1rs1859444（P=0.043)，COL2A1rs3803183与COL2A1rs3809322（P=0.041), COL2A1rs1859444与Osterixrs4759113（P=0.013)，COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2132572（P=0.006)，COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2854744（P=0.002); COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2854746（P=0.006)， COL2A1rs3809322与RUNX-2rs376319（P=0.032)，RUNX-2rs7751427与IGFBP3rs2854744(P=0.009），RUNX-2rs7751427与IGFBP3rs2854746（P=0.005)，充分提示了RUNX-2、IGFBP3、COL2A叁个关键基因多个TagSNPs之间的协同作用可能增加ONFH的发病风险，进一步提示多个微效基因的联合影响是ONFH分子遗传学的基本特征。
刘武[3]2007年在《补肾法对酒精干预成骨样细胞蛋白质表达影响的实验及相关临床研究》文中指出1研究目的股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由于多种病因破坏股骨头血供使骨的活性成分死亡的一种病理过程。酒精性股骨头坏死是常见的类型之一，目前病机认识方面比较肤浅，治疗也处于被动，往往出现坏死后才进行治疗，而且办法不多，其发病机理和防治技术尚需不断研究，尤其对其病机和中医防治机理方面进行研究更具有重要意义。过度摄入酒精是酒精性股骨头的主要原因，目前发病机理主要有酒精的细胞毒作用、骨细胞脂肪变性坏死等学说。股骨坏死的基本病理变化是骨小梁表面成排的成骨细胞消失，骨细胞陷窝空虚。现代医学对股骨头坏死的防治尚缺乏理想手段。“肾主骨”是中医治疗骨病的理论依据，股骨头坏死是中医骨病中越来越受注目的一种，补肾法治疗酒精性股骨头坏死已经在临床上广泛应用，但是中医方剂的治疗作用机理一直未得到现代科学的合理阐述，不利于中医现代化的发展。蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新领域，主要研究蛋白质的特性，可以在蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理生化过程以及疾病的病理过程等，通过比较患病细胞与正常细胞中蛋白质的表达变化，或者比较患病细胞与药物处理后细胞中蛋白质的表达变化，可能找到疾病的发病机制，同时也可能发现一些新的药物靶点及新药物。蛋白组学对中医领域的辨证论治研究提供了全新概念的技术平台，从现代技术讲，补肾、补髓是有其基因学或蛋白质学的依据的。目前在股骨头坏死的机理和中药治疗的机制研究中进行体外模拟成骨细胞受损并进行治疗的实验研究尚未见报道。本课题进行体外细胞实验，首先模拟酒精性股骨头坏死细胞受损的模型，然后采用补肾法代表方剂六味地黄丸含药血清进行治疗，再用蛋白组学的双向电泳技术，找出酒精干预和治疗后的差异蛋白质点，并进行初步分析，为进一步发现差异蛋白质进而研究酒精性股骨头坏死的发病机理和补肾法的治疗机制打下基础。2研究方法与结果2．1补肾法对OS-732成骨样细胞增殖作用的研究2．1．1细胞生长曲线绘制选择合适密度的OS-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、低剂量组和空白对照组(即生理盐水灌胃)血清连续培养7天。显微镜观察并计数，绘制细胞生长曲线，发现药物组的增殖作用均较空白血清组强，高、中剂量组含药血清对细胞有较强的刺激作用，而又以中剂量组的作用最强，3—6d为对数生长期。2．1．2 MTT法测定OS-732成骨样细胞的增殖试验选择合适密度的OS-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、低剂量组和生理盐水空白对照组血清进行连续培养5天，每天酶标仪测定吸光值，结果：培养24h、48h未见明显差异，但培养第3d、4d、5d后，高、中、低剂量组的增殖作用均较生理盐水空白对照组强，又以中剂量组最为明显，具有统计学意义，高、低剂量组无统计学意义2．1．3 OS-732成骨样细胞分泌ALP的实验研究选择合适密度的OS-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、低剂量组和生理盐水空白对照组血清进行培养，分别在培养第3d、4d、5d后进行碱性磷酸酶试剂盒检测，酶标仪测定OD值结果：高、中、低各剂量组均比生理盐水空白组高，但以中剂争组最为明显，具有统计学意义。高、低剂量组无统计学意义。2．2 OS-732成骨样细胞酒精干预和六味地黄丸含药血清治疗作用的实验研究2．2．1 OS-732成骨样细胞不同浓度酒精干预下细胞凋亡率检测选择生长良好合适密度的OS-732成骨样细胞，分别加入不同浓度的酒精进行孵育，空白对照组仅加入同等量RPMl1640。分别于干预后的第24h、48h与72h收集细胞，冷乙醇固定、PI液染、流式细胞仪检测。结果：酒精干预各组细胞凋亡率明显比空白对照组增高，具有显着意义(P＜0.05)，随着酒精浓度的增加，干预时间的延长，凋亡率逐渐升高，凋亡率与酒精浓度呈正相关，与干预的时间成正相关。2．2．2 OS-732成骨样细胞酒精干预后电子显微镜观察分为正常OS-732成骨样细胞组，酒精干预组，酒精干预后加六味地黄丸含药血清治疗组。透射电镜下的表现：正常成骨样细胞核较大，呈多型性，核仁明显，细胞质中可见较多的核糖体、高尔基体及溶酶体样颗粒。给予酒精干预后部分细胞器发生变化，核糖体、内质网减少，出现较多空泡，可以见到典型的细胞凋亡表现，细胞核固缩碎裂。药物治疗后细胞质内的细胞器从结构上有所恢复，内质网、高尔基体清晰可见。2．3 OS-732成骨样细胞酒精干预和六味地黄丸含药血清治疗后差异蛋白表达的初步分析成骨样细胞分为酒精干预组、药物治疗组、空白对照组。每组细胞提取总蛋白后进行双向凝胶电泳技术分离，得出蛋白质点电泳凝胶图谱，然后进行计算机图像分析软件分析。结果，发现酒精干预组与空白正常组相比，表现明显差异的蛋白点有5个(即SSP1002、SSP1401、SSP1602、SSP8501、SSP8504)，均表现为表达降低。这5个蛋白在药物组中其表达差异得到不同程度的逆转。2．4补肾法治疗酒精性股骨头坏死的临床研究以六味地黄丸合并生脉成骨片与单一生脉成骨片进行疗效比较。对69例酒精性股骨头坏死患者进行系统的临床观察。结果表明，两组均有较高疗效，合并用药组有效率83.78％，单一用药组81.25％，两组比较无显着差异。从缓解疼痛指标看，合并用药组优于单一用药组，具有显着差异性(P=0.0028)；从治疗前后的体征改善方面观察，合并用药明显优于单纯用药组(P＜0.05)。在影像学方面，两组的死骨吸收，新骨形成，骨膜反应等方面没有明显差异。3结论3．1六味地黄丸含药血清对OS-732成骨样细胞具有增殖作用，促进细胞分泌ALP。3．2一定浓度的酒精可以引起OS-732成骨样细胞凋亡，细胞凋亡与酒精浓度和干预时间成正相关。从倒置显微镜、透射电子显微镜不同角度观察到细胞受损的表现，可以见到细胞死亡和凋亡，存活的细胞可见空泡样改变。3．3采用蛋白组学双向电泳技术发现酒精干预后受损的0S-732成骨样细胞部分蛋白质表达下调，中药六味地黄丸含药血清可以逆转其部分表达，说明具有治疗作用。3．4六味地黄丸为补肾法的代表方，在临床观察中发现对酒精性股骨头坏死有较好疗效，结合活血化瘀方法可以提高疗效。
王宸[4]2014年在《晚期酒精性股骨头坏死骨组织中相关基因的表达》文中指出背景与目的自从1922年Axhausen报道了酒精中毒的病人容易患骨坏死疾病以来，人们就一直在探究股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head，ONFH）与酒精之间的关系。1968年Jones发现酒精中毒引起的股骨头软骨下骨坏死具备骨坏死的所有特征。近年来，伴随着人民生活水平的提高，饮酒的人愈来愈多，酒精的消耗量也不断增加，酒精性股骨头坏死患者在逐年增加。现在已有明确证据显示酒精为导致股骨头坏死的病因之一。关于股骨头坏死的发病机理学说有多种，如脂肪栓塞学说、高凝低纤溶学说、骨内高压及静脉瘀滞学说、微血管损伤学说以及骨质疏松学说等。以往人们研究酒精性ONFH的病理变化，发现早期酒精性ONFH股骨头内脂肪髓（脂肪堆积），脂质代谢紊乱，脂肪细胞增殖肥大，压迫毛细血管及血管窦，造成骨内高压及静脉回流障碍。进一步研究发现酒精调控股骨头细胞内成脂基因表达升高，成骨基因表达下降，并且酒精诱导骨髓多功能干细胞系成脂分化，抑制其成骨分化，加重股骨头内脂肪堆积而骨修复不足的病理过程从而导致股骨头的缺血坏死。晚期酒精性ONFH（ARCOⅢ-Ⅳ期）病理表现典型：软骨下骨折，骨量减少，坏死区面积特别大，有大块坏死骨，周围修复硬化带明显，股骨头塌陷、变形。但是目前尚不清楚坏死区骨组织细胞中相关基因的表达情况，国内外文献亦未见报道。故本研究收集人类酒精性ONFH患者股骨头标本，采用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测股骨头坏死区内骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、成骨转录因子-2（Runx-2）、过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPAR-γ）、护骨素(osteoprotegerin，OPG)、破骨细胞分化因子(receptor activatorofNF．KB ligand，RANKL)mRNA的表达情况，进一步探讨晚期酒精性ONFH坏死区骨组织细胞中相关基因表达的变化，对晚期酒精性ONFH治疗措施的选择有一定的参考价值。材料与方法2013年1月~2013年6月，收集10例ARCOⅢ-Ⅳ期（ARCOⅢ-B期3例，ARCOⅢ-C期3例，ARCOⅣ期4例）酒精性股骨头坏死患者股骨头骨组织和10例GardenⅢ-Ⅳ期（GardenⅢ期5例，GardenⅣ期5例）新鲜股骨颈骨折患者股骨头骨组织，分别作为实验组和对照组。实验组为晚期酒精性股骨头坏死患者，男8例，女2例，年龄33～60岁，平均45岁，无激素应用史、感染、创伤等其他病史。对照组男6例，女4例，年龄44～70岁，平均52岁，术前病程3-7天，平均5天，无饮酒史、激素应用史及其他病史。实验中观察股骨头大体标本形态，坏死区面积大小、颜色、质地，再采用RT-qPCR技术分别测定两组股骨头骨组织中BMP-2、Runx-2、PPAR-γ、OPG、RANKLmRNA的相对表达量。结果RT-qPCR检测各目的基因的Ct值，最后采用2-Ct法分析实验组相对于对照组目的基因表达变化的倍数，本实验结果显示实验组坏死区骨组织中BMP-2、Runx-2、PPAR-γ、OPG、RANKL mRNA的表达量较对照组均明显降低：2-△△Ct分别为0.51±0.04、0.46±0.09、0.59±0.07、0.31±0.04和0.51±0.06，差异有统计学意义，P＜0.01。结论1.晚期酒精性ONFH的坏死面积特别大，残存的骨细胞很少；2.晚期酒精性ONFH坏死区骨组织内成骨、成脂基因表达均降低。
李志强[5]2017年在《活络骨康丸家兔含药血清抑制酒精诱导MSCs成脂及促进成骨分化的研究》文中研究说明目的:通过经口灌胃给药法制备活络骨康丸家兔含药血清,将其用于培养全骨髓法提取的骨髓基质细胞(Marrow Stromal Cells,MSCs),观察其对MSCs成脂与成骨分化机制的影响,探讨活络骨康丸家兔含药血清对酒精诱导MSCs成脂抑制及促进成骨的作用机理。进一步证明活络骨康丸防治酒精性股骨头坏死(Osteonecrosis of Femoral Head,ONFH)的有效性与可行性,为该药在临床上应用于治疗此病提供科研依据和理论支持。方法:实验选用新西兰大白兔10只,依据体表面积折算动物等效药量法,计算活络骨康丸灌胃剂量,以2 ml/Kg溶剂量换算,将丸剂碾末后置入生理盐水内均匀混悬,配制成药液。连续经口灌胃7天后(每日上午1次),剖腹取家兔腹主动脉血用以制成活络骨康丸家兔含药血清。应用全骨髓贴壁法体外分离培养以获得家兔MSCs,后接种于6孔培养板内,每板分3组(2孔/组)于接种当天即进行干预实验。其中,对照组低糖型DMEM培养液中加入的是10%正常家兔血清;模型组培养液中加入10%正常家兔血清及90 mmol/L酒精;实验组培养液中则加入10%活络骨康丸家兔含药血清及90 mmol/L酒精。干预性培养后,分别从成脂指标[苏丹Ⅲ脂染及光镜下脂肪cell计数和反复冻融法裂解MSCs所得细胞内甘油叁酯(Triglyceride,TG)含量]和成骨指标[MSCs胞内碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性及细胞培养液中骨钙素(Bone Gla Protein,BGP)含量]两方面进行观察记录及相应定性定量检测。实验第12天,将部分培养板内细胞刮落并收集,反复冻融使胞膜破裂,离心取上层清液,后将试剂盒置于全自动生化分析仪上测定细胞内ALP活性;第14天,采用放射免疫检测技术测定细胞培养液内BGP含量;待培养至第21天,取出6孔板各孔内供脂染样本预置的盖玻片,进行苏丹Ⅲ染色处理,倒置相差显微镜下观察脂肪滴颜色、形态、大小等,并完成脂肪cell计数。反复冻融法裂解细胞,收集并测定培养液中TG含量。所得数据均应用SPSS 22.0统计分析软件进行处理。结果:(1)细胞培养至第12~14天,置于倒置显微镜下观察到模型组和实验组细胞胞浆内均开始出现微小颗粒状呈圆形的脂肪滴,类似液泡且周围具有折光性黑色环。但实验组中数量相对较少,而对照组中最少。继续培养并观察,随着酒精刺激MSCs脂肪分化特性进一步增强,脂肪cell数量逐渐增多,细胞内微小脂滴逐渐融合致体积明显变大,镜下观察为多边形或类圆形。待培养至第21天,苏丹Ⅲ染色处理后,见细胞内出现被染为橘红色颗粒状小圆脂滴,细胞核则被染为浅蓝色。(2)脂肪cell计数和胞内TG含量提示模型组显着高于实验组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)模型组测得ALP活性及BGP含量均明显低于实验组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:酒精毒性作用可使股骨头内脂肪cell增殖肥大,脂质沉积、脂代谢紊乱而使骨细胞变性坏死,成骨细胞亦出现失活,导致ONFH。活络骨康丸家兔含药血清对酒精诱导MSCs具有成脂抑制作用,同时能促进并维持MSCs成骨分化,对抗酒精毒性,改善局部微循环,降低股骨头骨内压,促进死骨修复和新骨生成,对酒精性ONFH具有防治作用。
宋旸[6]2011年在《SREBP-2、IGFBP3基因多态性与ANFH发病风险的研究》文中研究指明目的：ANFH是遗传易感因素和环境危险因素共同作用的复杂性疾病, ANFH基因遗传多态性与发病风险的相关研究,可为ANFH易感人群筛查、早期诊断和早期干预提供重要科学依据。建立在股骨头缺血性坏死分子发病机理研究进展基础上,选择SREBP-2、IGFBP-3两个基因作为研究的靶基因,综合应用多种分子技术的创新集成,分析靶基因多态位点与ANFH发病的风险及临床表现型的相关性,从分子遗传学及基因功能的角度筛查与股骨头缺血性坏死发生发展的关键靶分子,为建立ANHF的分子水平防治对策提出关键分子靶点。方法：股骨头坏死入组病例选自于2009年6月至2010年12月就诊于吉林大学中日联谊医院骨科的临床患者49例,排除明显髋关节的外伤史,按Ficat诊断与分期标准进行ANFH的临床诊断与分期,并按临床病因学分类分为激素性股骨头坏死、特发性股骨头坏死、酒精性股骨头坏死叁类。健康对照组按知情同意的原则选自与股骨头坏死入组病例年龄、性别相匹配的健康体检者42例。应用文献循证方法选择与ANFH的发生发展及骨代谢有密切关的固醇调节元件结合蛋白基因2(SREBP-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白3基因(insulin-like grouth factor bind protein 3,IGFBP3)基因,作为基因多态性研究的目标基因。其中SREBP-2检测SNP位点为rs2267439、rs 2267443；IGFBP3检测的SNP位点为rs2453839。采用聚合酶链反应(PCR)、基因测序等分子技术的创新集成,检测目标基因多态性；通过SPSS10.0统计学软件等分析这些基因多态性在ANFH组和正常对照组中的分布特点,基因多态性与临床表现型之间的关系,以及基因多态位点之间的交互作用。结果：本研究取得以下结果：1.综合应用分子克隆、荧光定量PCR、分子测序等多种分子技术的创新集成,在91例ANFH组及健康对照组体系中成功克隆了SREBP-2、IGFBP3基因3个多态性位点的基因片段,经电泳及测序检测证实所克隆的基因片段条带清晰,电泳条带位置与所设计目标基因片段分子量一致,碱基序列与GeneBank目标基因片段序列完全吻合。本研究以测序技术金标准为核心技术的方法体系不仅提高了检测的特异性与灵敏性而且为进一步进行ANFH易感基因相关的表观遗传学及转录与翻译水平表达的研究奠定了实验基础。2.应用分子测序技术证实了SREBP2基因rs2267439SNP位点的多态性为CC,CT,及TT叁种类型：rs2267443SNP位点的多态性为GG,、AA及GA叁种类型。ANFH组rs2267439SNP位点的TT型基因型频率(34.0%vs23.8%)和rs2267443SNPGA型基因型频率(34.1%vs24.3%)分别较正常对照组频率有上升的趋势,提示rs2267439等位基因纯合子TT基因型携带者和rs2267443GA型基因型携带者可能会增加ANFH患病风险。3.基因之间交互作用的分析结果发现,SREBP-2基因两个多态位点rs2267439(T/T)与rs2267443(G/A)基因型在ANFH组和对照组中的分布具有统计学差异,表明(T/T)与(G/A)基因型之间的相互作用可能增加ANFH风险。提示同时携带两种突变基因型——T/T型和G/A型,可在ANFH发生中呈协同作用,所致ANFH发病率风险明显高于单独携带其中一个基因型的患者。阐述了ANFH是一种多基因遗传病,多个易感基因突变更易导致ANFH发病。4.基因测序结果证实了IGFBP3基因的rs2453839位点的多态性为CC、TT及CT叁种类型。尽管rs2453839基因型及等位基因频率在ANFH组与正常对照组之间的分布未见统计学差异,但ANFH的TT型基因型频率(52.0%vs 71.4%)呈现低于正常对照组的趋势；而ANFH的TC型频率(40.0%vs 20%)则呈现高于正常对照组的趋势。对IGFBP3基因rs2453839位点的多态性与ANFH发病风险的评估,有待于扩大样本量的深入研究。5.对ANFHIGFBP3rs2453839基因型与临床表现型的对比分析结果,发现携带TT型基因型的ANFH患者病程显着短于CT+CC型携带者(P<0.01);双侧Ⅱ-Ⅲ期患者携带TT型基因型多于CT+CC型携带者(P<0.05);病变累及范围单侧髋关节受累患者TT型亦多于CT+CC型携带者(P<0.05),首次证实了IGFBP3rs2453839基因多态性与ANFH患者的临床表现型呈现一定程度相关性。结论：我们的研究结果在国内外率先提出了SREBP-2、IGFBP3基因多态性与中国北方汉族人群ANFH风险的相关依据,两种基因多态性可能是中国北方汉族人群股骨头缺血性坏死最重要的遗传易感因素之一。对SREBP-2、IGFBP3基因遗传易感位点、表观遗传学、基因表达效率、临床表现型的系统深入研究,可能有助于进一步阐述基因多态性与股骨头缺血性坏死的发生发展的关系,也为临床ANFH的分子水平防治——ANFH易感人群筛查、早期诊断和早期干预提出了主要监控的分子靶标。
陈跃平[7]2014年在《酒精对特发性股骨头坏死骨髓成骨微环境作用机制研究》文中研究说明研究背景股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of the femoral head, ONFH)是由股骨头血供中断或骨细胞变性导致相关活力成分(骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞)死亡及随后的修复而导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍的一种疾病。它不是一个单一的过程,而是遗传因素与一个或多个危险因素综合作用的结果。它是骨科临床中常见疾病之一,是由不同原因导致的股骨头骨髓造血细胞、骨髓脂肪细胞及骨细胞变性坏死的一种疾病。股骨头缺血性坏死主要分为两大类,包括创伤性股骨头坏死(traumatic osteonecrosis of femoral haead TONFH)和非创伤性股骨头坏死(non.traumatic osteonecrosis of femoralhead,NONFH)。在髋关节疾病中,它已经代替了髋关节结核的位置,跃居首位。股骨头缺血性坏死病程缓慢,病因复杂,治疗困难,致残率高,长期以来困扰着国内外学者,被医学界称为“不死的癌症”。目前临床上缺乏有效的早期筛查和检测手段,所以早期发现和诊断股骨头坏死从而进行药物或手术等有效干预非常欠缺,很多患者直到出现无法忍受疼痛,髋关节活动受限才来就诊,但此时大都已经出现了股骨头塌陷变形、骨性关节炎等晚期病变,只能施行人工髋关节置换手术,最终导致患者生活质量下降以及国家家庭个人的经济负担增加。因此,明确股骨头坏死的原因,弄清其发病机制,是临床和实验室专家一直努力研究的方向。特发性股骨头缺血性坏死(Idiopathic femoral head necrosis,IFHN)主要包括激素性和酒精性的股骨头缺血坏死,约占股骨头缺血坏死病例的40%,临床上以酒精性股骨头缺血坏死常见。长期大量饮酒可引起股骨头髓内脂肪细胞大量增殖,脂肪细胞肥大,使相对密闭的骨髓内压力明显增高,微小血管受压变细,血流受阻。IFHN是一种常见致残性疾病,发病率较高,近年来呈逐渐上升趋势。如果早期得不到及时有效的处理,80%以上的患者将最终导致坏死性骨关节病的发生,甚至致残。目前对于IFHN的发病机制尚不清楚,国内外尚无定论。股骨头缺血性坏死仍是医学界的一大难题,了解IFHN发病机制,对探索该病有效的预防、早期诊断和治疗方法有重要的临床意义。近年来,国内外学者对股骨头坏死的发病机制进行了深入研究,提出多种学说,包括：脂质代谢紊乱学说、血液循环的机械损伤学说、血管内凝血学说、骨内压增高学说、细胞毒性与细胞损伤学说、骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化学说等。在目前诸多观点中,脂质代谢紊乱学说是一种相对成熟的观点。IFHN的发病机理极其复杂,髓内脂肪细胞增殖肥大继发脂肪栓塞在股骨头坏死发生发展过程中的作用逐渐受到重视。当前的相关研究认为脂肪细胞的生成在骨质减少性疾病的发生发展过程中起着非常重要的作用,“脂质学说”已成为目前IFHN发病的研究热点领域。骨质疏松症是以破骨细胞对骨的吸收和成骨细胞成骨之间的平衡被打破造成的骨量减低为特点。因此,成骨细胞骨形成减少可导致骨质疏松症的进一步发展,同时,骨细胞凋亡率可以调节骨细胞的形成。在成年人中,负责骨形成的成骨细胞来自骨髓间充质干细胞(BMSCs)。通过几项研究的大量数据表明,成骨细胞和成脂肪细胞均有着共同的多能骨髓间充质干细胞,而成脂肪细胞和成骨细胞之间是相互作用的关系,即成脂细胞分化越来越多的同时,成骨细胞的形成则越来越少,反之亦然。过量饮酒的习惯通常被认为是骨质疏松的主要原因并且可以增加发生骨折的风险。临床和实验研究目前证实,酒精引起的骨质疏松主要是由于抑制了新骨的形成,而对骨质的吸收方面影响较少。在成年人中,来自于骨髓中的骨髓间充质干细胞(BMSC)的成骨细胞主要负责骨的形成。这些骨髓间充质干细胞分化成骨细胞的能力在维持成人骨骼起中着关键的作用。骨髓和其他组织中都可以有BMSCs的存在,它具有典型干细胞的特征,在不同的特定条件下它可以分化为不同的间充质组织,如再生骨、软骨、肌肉、脂肪等。它的分化环境主要在体内骨松质骨小梁及骨髓内。在受到外界刺激下,体内的成骨微环境中的细胞信号传导系统开始作用,BMSCs开始增殖分化,从原代细胞到成骨细胞逐步分化,最后参与完成体内组织的更新和创伤的修复,特别是在骨组织损伤后修复中,BMSCS发挥着尤为重要的作用。即使在体外,成骨细胞或成脂细胞诱导BMSCs分化的机制也涉及好几个方面。由于人体股骨头周围的特殊结构,头颈局部骨膜结构的缺乏从而导致使得骨膜内成骨不可能在股骨头部位产生,再加上该处软骨的成骨能力又非常弱,这些使股骨头部位的成骨机制被BMSCs成骨占据主要地位。相关研究表明,BMSCs可在酒精的诱导下大量成脂分化,而成骨分化受抑制,揭示了酒精性ONFH的新的发病机理。相关实验研究表明,成熟的成骨细胞可以通过细胞间的直接接触作用促进骨髓基质干细胞增殖。大量的临床及实验研究证实成骨细胞具有分泌作用,已经被证实的可分泌的生长因子有碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),胰岛素样生长因子(IGF),血小板衍生生长因子(PDGF),骨形成蛋白(BMP)等,它们被认为是BMSCs骨分化诱导因子。BMSCs表面的受体与这些生长因子结合后,细胞内信号系统被受体介导作用改变,从而激发BMSCs的特异性成骨转录因子Osf2/Cbfq1或Cbfq1/Runx2,使BMSCs的增殖及成骨分化加速。其中BMP和转化生长因子(TGF)对BMSCs分别起着骨诱导作用和增殖作用。已有研究证实骨髓间充质干细胞具有分化为多种细胞的潜能,并可以分化成一种或多种细胞系。在其分化的多种细胞系中,成脂分化与成骨分化的关系最为密切：多项研究已经表明,成骨细胞和脂肪细胞具有共同祖母细胞-骨髓间充质干细胞。研究证实骨髓间充质干细胞的成脂分化与成骨分化的途径之间存在一种对立关系。已有证据显示成骨细胞和脂肪细胞之间在很大程度上是可以相互转换的,在成脂分化及成骨分化时两者相互影响,这可能为通过抑制脂肪细胞分化来防治骨质疏松症或其它骨疾病提供依据。因此,在这些过程中有关的信号通路被认为是治疗骨质减少性疾病时的目标所在。酒精摄入后,在体内分解随着血液流经整个身体并穿过细胞膜进入细胞内,进而几乎影响所有细胞的正常生理活动。大量摄入酒精可以促进成脂细胞分化,抑制成骨。此外,慢性少量和大量饮酒同样会导致骨吸收增强而抑制骨形成。因此,酒精被认为是造成骨质疏松症的主要危险因素。酒精和激素是有力的IFHN发病因素,但它们具体是通过什么途径导致疾病的发生?抑或是多种途径联合起作用?抑或是另存在新的发病过程?目前尚无明确答案。阐明IFHN的发病机制,并据此寻找治疗的靶点仍是目前研究的一项重要任务。微环境指细胞周围近距离作用和调控细胞兴奋或抑制活动的微量理化因素,以及该细胞在进化和分化过程中形成且对相关能量敏感的特殊结构和受体等在细胞局部组成的机能环境。许多研究表明激素和细胞分泌的各种因子对成骨细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞群和体内骨重建的作用是极其复杂的,可以是交叉重迭的、协同的,也可以是拮抗的、短暂的。多种全身性的和局部的信号被网络中的细胞接受、传导、整合,然后被进一步释放刺激网络的其他成员,从而使信号逐级放大。在此过程中不仅把循环、局部的信号与骨微环境内的细胞联系起来,而且本身也参与了生理活动的调节。因此,骨髓内微环境的稳定以及骨吸收和骨形成之间的偶联,可能正是此调控网络通过骨髓内多种细胞之间的信号联系动态调节的结果。一些研究数据表明,酒精通过上调过氧化酶基因的表达激活受体Y(PPARy),使得骨髓间充质干细胞由成骨分化向成脂肪细胞分化转换,但相关具体的转换机制目前并不清楚。本项目通过对酒精作用下骨髓间充质干细胞分化方向、成骨细胞的成骨能力、脂肪细胞功能是否存在调节作用,以及脂肪细胞+骨髓间充质干细胞、脂肪细胞+成骨细胞共培养体系的影响进行研究。观察成骨与成脂分化的关键基因PPARy与cbfal在不同条件下的表达,检测成骨相关的指标ALP、OCN、I型胶原及脂肪细胞LPL。探讨致病因素的作用途径,及对髓内细胞池中骨髓间充质干细胞、成骨细胞、脂肪细胞的影响,脂肪细胞受到致病因子作用后是否会产生局部调节效应,以进一步阐明骨髓内成骨微环境在IFHN发病过程中的作用与可能机制,并为寻找可能的治疗靶点提供支持。目的1阐明IFHN发病过程中致病因素对髓内细胞池中骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化影响所造成的脂质异常；2探讨成骨细胞与脂肪细胞受酒精作用后的功能改变；3探讨脂肪细胞功能改变对成骨细胞及骨髓间充质干细胞的调节作用；4分析酒精对脂肪细胞+骨髓间充质干细胞,脂肪细胞+成骨细胞共培养体系的影响。方法1体外分离、培养新西兰白兔骨髓间充质干细胞、脂肪细胞及成骨细胞。作骨髓间充质干细胞多分化潜能鉴定以及骨髓成骨细胞及脂肪细胞的表型鉴定。2应用酒精作用于骨髓间充质干细胞、脂肪细胞及成骨细胞,观察酒精对骨髓间充质干细胞的分化,以及脂肪细胞、成骨细胞的功能影响。3用酒精作用于脂肪细胞后,制备条件培养基,然后作用于骨髓间充质干细胞与髓内成骨细胞,观察脂肪细胞受到影响后对二者的作用。4将脂肪细胞+骨髓间充质干细胞,脂肪细胞+成骨细胞作共培养,观察共培养体系中的细胞分化与成骨指标的改变情况,以及在酒精作用下二共培养体系的细胞分化与成骨指标改变情况。5检测细胞内质网的活性及与之相关的基因的变化,采用RT-PCR和免疫印迹法实时定量分析脂肪细胞和成骨细胞的标志物,进行油红O染色,并对形成的脂肪细胞进行量化,对成骨细胞的生物标志物碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原和骨钙素进行检测,同时还进行半胱氨酸蛋白酶3的活性测定,进而评估骨髓间充质干细胞的凋亡程度。结果培养12天后对两组细胞进行ALP染色,显示实验组细胞质内ALP染色阳性反应明显,对照组染色显色弱,实验组细胞钙化结节数量多且较大,对照组也有钙结节形成,但较小。实验组标准钙化结节计数显着高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),加入0.15mol/L酒精干预后,成骨细胞发生皱缩,AO/EB染色出现凋亡细胞。取生长对数期的兔骨髓间充质干细胞进行诱导培养,当汇合度达到70-80%的加成骨诱导培养基,进行诱导培养。随着时间延长,实验组成骨细胞数量明显多于对照组。在3、6、9天的每张爬片各取4个低倍视野进行钙结节成骨数量计数,实验组分别为(200.83±24.73)、(1112.00±77.56)、(1199.00±44.91)个/cm2；对照组分别是(99.75±10.15)、(790.00±94.13)、(1059.00±26.39)个/cm2(P<0.001)随着时间延长,实验组脂肪细胞数量明显多于对照组,两组小脂滴均逐渐增多、增大,但实验组更明显。在4、6、8、10d的髓内脂肪细胞数量实验组分别为(200.83±24.78)、(1102.00±76.21)、(1160.00±28.83)、(1199.00±44.51)个/cm2；对照组分别是(99.75±10.67)、(790.00±94.63)、(1000.00±41.30)、(1059.00±26.54)个/cm2,脂肪细胞数量随酒精作用的时间延长而增多(P<0.001)。研究发现,加入了酒精的培养皿中检测到脂肪细胞标记物(PPARγ2和AP2)数量增加、成骨标记(Osf2/Cbfa1)数量减少,而表现为脂滴蓄积的现象,因此,长期接触酒精能够使骨髓间充质干细胞成脂细胞分化增强,成骨分化受到抑制。结论通过密度梯度离心贴壁法所获得的骨髓间充质干细胞在常规培养及诱导培养时均可表现出较强的增殖能力及成骨、成脂分化潜能,足以表明骨髓间充质干细胞能够为骨组织工程的研究提供可靠种子细胞来源；酒精抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化并能促进其向成脂细胞分化；酒精能够诱导成骨细胞的凋亡,促进骨髓内脂肪细胞的增殖肥大。长期过量饮酒会导致股骨头髓内脂肪细胞快速大量增殖,同时脂肪细胞较正常肥大,从而使相对封闭的骨髓内压力显着增高,微小血管因受压而变细,最终导致血流受阻或者中断,从而形成股骨头缺血性坏死。主要创新点1、本研究提出酒精能够促进髓内脂肪细胞增殖肥大,同时可以抑制骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化；2、本研究提出酒精作用于脂肪细胞后的代谢产物对骨髓间充质干细胞及骨细胞的增殖均具有一定的抑制作用；3、本研究建立了脂肪细胞+骨髓间充质干细胞,脂肪细胞+成骨细胞共培养体系。
阿不都赛米·艾买提[8]2011年在《自体脂肪干细胞与藻酸钙复合体修复兔激素性股骨头坏死的实验研究》文中研究表明目的：观察兔脂肪干细胞(rADSCs)的生长规律,鉴定其干细胞特性；采用MRI扫描、显微CT成像技术及组织学染色观察激素联合脂多糖诱导早期兔股骨头坏死的实验效果；综合评价rADSCs与藻酸钙复合体修复对兔激素性股骨头坏死的治疗效果。材料与方法：1)首先自28周龄新西兰大白兔肩胛间区分离获取皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化获得rADSCs。在体外原代培养及传代培养,观察其体外增殖能力等生物学特性,通过流式细胞术检测rADSCs分化群表面抗原的表达,取第叁代rADSCs向成脂、成骨和成软骨诱导分化,观察其多向分化潜能；2)将50只新西兰大白兔,雄性,28周,2.5～4.5kg,随机分为实验组及对照组,实验组以10μg/kg脂多糖经耳缘静脉注射一次,间隔24小时后肌肉注射甲基强的松龙20mg/kg,共3次间隔24h,最后注射甲强龙6周后通过MRI、micro-CT扫描,组织学染色检查筛选动物模型并评价股骨头坏死的部位、程度并计算坏死率并筛选备用下一步实验；3)造摸成功后,实验动物随机分为四组,A组为造模对照组(21只)；B组为髓芯减压+藻酸钙复合体移植组(22只)；C组为髓心减压+藻酸钙+未成骨诱导的rADSCs移植组(22只)；D组为髓心减压+藻酸钙和成骨诱导的rADSCs移植组(22只)。取第叁代rADSCs,在体外成骨诱导两周后,在X线引导下以髓心减压的方式,注入股骨头病灶内。分别于移植术后4周及8周各组兔先行MRI及显微CT扫描,之后处死动物取股骨头行常规组织学观察；免疫组织化学法检测骨桥蛋白(OCN)的表达,取材,进行大体观察和组织学检。结果：1)我们获得的rADSCs具有很强的体外增值能力,长期传代后增值能力无明显改变；流式细胞术的检测结果显示,实验所用的rADSCs对CD、CD34、CD44、CD105、 CD166以及CD49d阳性表达。同时,实验所用rADSCs对CD14、CD45与CD31阴性表达,排除了造血系和内皮细胞的污染；第叁代rADSCs体外成骨诱导两周后,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红染色阳性；成脂诱导两周后,油红O染色阳性;微团培养成软骨诱导两周后,免疫荧光染色结果显示Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ)表达阳性：2)造摸后,MRI扫描结果提示6周时,实验组SE序列T1WI上表现为点状、细线状、片状中等信号强度,T2WI上表现为点状、细线状、片状高信号强度；T1WI上呈片状中等信号强度,T2WI上呈片状偏低信号,部分出现关节腔积液；Micro-CT检查提示在实验组中平扫结果显示,可见骨髓腔内骨小梁数量明显减少,变细、疏松,部分骨小梁已断裂,丢失,出现低密度区,叁维重建结果显示,骨小梁叁维空间结构破坏,方向性差,排列紊乱,与周围骨小梁连接性差,出现低密度区；组织学结果显示股骨头软骨层变薄,骨小梁明显变细稀疏,结构紊乱,部分骨小梁断裂不连续,弥漫性的存在的空骨陷窝,髓腔内造血细胞明显减小,可见微小血管内血栓形成；3)藻酸钙和成骨诱导的rADSCs移植组MRI扫描结果显示低信号区明显缩小；Micro-CT结果表明骨骼体积、总体积、连接密度与骨密度明显增加,叁维重建结果显示,骨小梁叁维空间结构基本完整,方向性佳,排列整齐,与周围骨小梁连接性佳,偶然见少许低密度区；组织病理学结果显示表现空骨陷窝减少,成骨细胞多,在骨陷窝率及骨坏死率方面显着低于其余3组；免疫组化显示藻酸钙和成骨诱导的rADSCs移植组的标本骨内成骨反应活跃。结论：实验所用rADSCs的叁向分化潜能得到确认,这些实验结果表明我们分离的细胞为脂肪干细胞；激素联合脂多糖能够安全地诱导兔早期股骨头坏死模型；以脂肪干细胞为种子细胞、藻酸钙为支架材料构建的复合体可作为治疗激素性股骨头坏死的一种新途径。
崔永锋[9]2005年在《激素性和酒精性股骨头坏死病理、X线与临床的对比研究》文中研究指明临床上发现,激素性和酒精性股骨头坏死(ONFH)具有不同的病理特点、影像表现和临床症状,其预后亦相差较远。但由于对激素性和酒精性ONFH的不同特点没有更深入的认识,更没有相应的治疗手段,因此往往把两者归为非创伤性ONFH,这显然不利于个性化治疗和临床疗效的评估。本论文对激素性和酒精性ONFH的组织形态学、免疫组织化学、X线和临床等进行比较,并按照影像病机分类法对两种ONFH的特点进行分析,研究两种ONFH发病过程中骨坏死、血管损伤及其修复、再生的不同特点;探讨两者不同特点对临床诊断及治疗的指导意义。论文共分五个部分进行论述:一、激素性和酒精性ONFH组织形态学的比较研究(1)目的:对激素性和酒精性ONFH组织形态学的各项指标进行定量研究,对两者之间不同的病理特点进行比较,从而深入认识ONFH的发病机理及其与激素和酒精不同致病原因的关系。(2)方法:对69例ONFH患者的73个股骨头,随机抽取13个股骨头(按ARCO分期,Ⅲ期5个,Ⅳ期8个),其中7个激素性(男5个,女2个),6个酒精性(均为男性),分别锯成3-4mm的薄片,制成全股骨头的病理切片;同时对ONFH的负重区软骨面、软骨下坏死中心、修复区和相对正常头颈区分别取材,按照统一程序制成股骨头的普通病理切片,进行HE、改良Masson染色,在光学显微镜下对ONFH的组织形态学进行定量分析,实验数据采用单因素方差分析统计处理。(3)结果:激素性ONFH组和酒精性ONFH组比较,激素组骨小梁面积、空骨陷窝率、脂肪细胞长径、新生骨小梁面积均低于酒精组(P<0.05),而软骨成骨指数高于酒精组(P<0.05);两组之间在骨陷窝面积和长径、同源软骨细胞数、有效血管和无效血管数无显着性差异(P>0.05),但激素组有效血管和无效血管数在数值上均高于酒精组。(4)小结:激素性和酒精性ONFH的坏死表现形式不同:激素性ONFH以骨髓、脂肪组织、骨小梁的分解吸收及肉芽组织形成为特点;而酒精性ONFH以凝固性坏死和纤维素样坏死为特点。激素性和酒精性ONFH修复的方式不同:激素性ONFH以肉芽组织形成、骨质吸收及软骨成骨为特点,是以多发灶性修复为主,但成骨能力较差;
张林锋[10]2010年在《siRNA干扰预防酒精性股骨头坏死的动物实验研究》文中研究说明背景和目的：酒精性股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head, ONFH)在临床上常见,早期症状隐匿,容易被忽视,当髋部疼痛不适就诊时,股骨头病变往往发展为ARCOⅡ期或Ⅱ期以上,失去了治疗的最佳时期,该病致残率高,严重威胁着人类的健康,迄今没有发现有效预防该病发生的方法。最新的酒精性股骨头坏死发病机理动物实验表明,过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因在动物股骨头内的多潜能干细胞骨髓基质细胞(marrow stromal cells, MSCs)成脂分化过程中起着关键性的调节作用,长期大量的酒精摄入可明显上调PPARγ基因表达,促进MSCs成脂分化,抑制其成骨分化,引起股骨头内脂肪细胞数目增多、体积增大、脂质沉积、骨细胞变性坏死。本研究运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)原理,将经过筛选、鉴定并体外扩增的高效siRNA腺病毒载体注入家兔的股骨头内,观察siRNA腺病毒预防酒精性ONFH的效果,从基因方面寻求一种防治酒精性股骨头坏死的有效途径。材料和方法：选取健康新西兰种家兔96只,2～3月龄,体重2.7±0.5/只,雌雄不拘,随机分为4组,每组24只。正常对照组(N组)：采用灌胃法,给予10%葡萄糖注射液10ml/(kg·d);酒精组(M组)：采用灌胃法,给予白酒(酒精度含量46%V/V)10ml/(kg·d),作为股骨头坏死模型组；酒精+重组腺病毒组(S组)：同法同量灌酒,在实验第1、3、5月的第1天随机选择侧别麻醉下经股骨颈行股骨头穿刺,注入25μl siRNA腺病毒滴液,用骨蜡封闭穿刺小孔。酒精+穿刺组(CO组)：手术方法同S组,但不注入siRNA腺病毒载体。各组动物分别于实验第2、4、6月月末测定空腹血清总胆固醇(CHO)、甘油叁酯(TG)含量；观察各组动物股骨头组织学变化；测定各组股骨头组织中的最大脂肪细胞平均直径、骨小梁面积分数和空骨陷窝计数。采用RT-PCR技术检测各组股骨头组织中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA的表达。Western-blot检测各组股骨头内PPARγ蛋白表达。结果：1.一般状况：在整个实验期间,N组食欲正常,动作敏捷,体重逐渐增加；M、CO两组随酒精灌胃时间延长食欲逐渐下降,活动量减小,动作迟缓,体重增长不明显,精神欠佳,皮毛发黄、晦涩、失去光泽；S组精神、食欲、体重增长及动作灵活性优于M、CO组,但较N组稍差。2.各组实验动物各时间段空腹血清甘油叁酯(TG)和总胆固醇(CHO)含量变化(mmol/L):实验第2、4、6个月M、CO、S组动物空腹TG、CHO测定结果明显高于N组水平,且随实验进展呈逐渐增高趋势,与N组比较差异有统计学意义(P<0.05)；股骨头组织病理学HE染色、苏丹Ⅲ脂肪染色显示M、CO组股骨头内空骨陷窝计数、脂肪细胞及最大脂肪细胞平均直径明显增多、增大,骨小梁稀疏、变细,相对N、S组差异有统计学意义(P<0.05),S组空骨陷窝计数、脂肪细胞及最大脂肪细胞平均直径未见明显增加(P>0.05),相对N组差异无统计学意义。3.股骨头骨髓细胞成脂、成骨分化基因检测结果：RT-PCR检测股骨头骨髓细胞中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA基因表达、Western-blot检测股骨头骨髓细胞PPARγ蛋白表达结果显示M、CO组股骨头内PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相对β-actin的吸光度比值明显增高,Osteocalcin mRNA基因相对β-actin的吸光度比值明显降低,与N、S组差异均有统计学意义(P<0.05),S组中PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相对β-actin的吸光度比值和Osteocalcin mRNA基因相对β-actin的吸光度比值相对N组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.长期大量的酒精摄入可以导致酒精性股骨头缺血坏死。2. pAdeno-X-siPPARγ重组腺病毒能够有效阻断PPARγmRNA的表达,阻止酒精诱导家兔活体股骨头内MSCs成脂分化,保持其成骨分化,促进新骨形成、骨修复和功能重建。3.应用RNAi技术,可以从家兔酒精性股骨头坏死发病机制上防治其发生,对酒精性ONFH的防治提供了新的技术路线和科学的理论依据,其长期疗效及以后的临床应用有待进一步观察和研究。
参考文献：
[1]. 酒精性股骨头坏死的发病机理及相关研究[D]. 刘慧松. 苏州大学. 2003
[2]. 骨代谢相关基因标签SNPs与ONFH发病风险及临床表型的相关性研究[D]. 宋旸. 吉林大学. 2015
[3]. 补肾法对酒精干预成骨样细胞蛋白质表达影响的实验及相关临床研究[D]. 刘武. 广州中医药大学. 2007
[4]. 晚期酒精性股骨头坏死骨组织中相关基因的表达[D]. 王宸. 郑州大学. 2014
[5]. 活络骨康丸家兔含药血清抑制酒精诱导MSCs成脂及促进成骨分化的研究[D]. 李志强. 河南中医药大学. 2017
[6]. SREBP-2、IGFBP3基因多态性与ANFH发病风险的研究[D]. 宋旸. 吉林大学. 2011
[7]. 酒精对特发性股骨头坏死骨髓成骨微环境作用机制研究[D]. 陈跃平. 南方医科大学. 2014
[8]. 自体脂肪干细胞与藻酸钙复合体修复兔激素性股骨头坏死的实验研究[D]. 阿不都赛米·艾买提. 新疆医科大学. 2011
[9]. 激素性和酒精性股骨头坏死病理、X线与临床的对比研究[D]. 崔永锋. 广州中医药大学. 2005
[10]. siRNA干扰预防酒精性股骨头坏死的动物实验研究[D]. 张林锋. 郑州大学. 2010
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