黑龙江省佳木斯市妇幼保健院儿内科 154002
摘要：目的 应用T7-连接双信号放大技术进行呼吸道七项病原RNA检测，探讨其在儿童呼吸道感染方面的应用价值。方法 收集我院门诊及住院处390例呼吸道感染的患儿呼吸道分泌物，进行T7-连接双信号放大技术检测呼吸道七项病原体RNA，同时采集我院住院处522例支原体、衣原体和184例流感三项抗体检测，比较分析其灵敏性和特异性及临床应用价值。结果 T7-连接双信号放大技术检测时间仅需要2-3小时，其灵敏度和可靠性和时效性均优于抗体检测，且不需要昂贵的特殊设备，具有实验室前期投入少，线性范围宽，无需内参，直接定量，试剂盒价格便宜等优点。结论 T7-连接双信号放大技术可方便快捷的检测呼吸道七项病原体RNA，其检测效能灵敏性、特异性及时效性均较高，适宜临床推广应用。
关键词：T7-连接双信号放大技术；病原体RNA；呼吸道感染
[Abstract] Objective To detect seven pathogenic RNA in respiratory tract by T7-linked double-signal amplification technique and explore its application value in children with respiratory tract infection.Methods Respiratory tract secretions of 390 children with respiratory tract infections in outpatient and inpatient departments of our hospital were collected and T7-junction double signal amplification technique was used to detect the RNA of seven pathogens in the respiratory tract.Use value.Results The detection time of T7-linked double-signal amplification technique was only 2-3 hours.The sensitivity，reliability and timeliness of T7-linked double-signal amplification technique were superior to that of antibody detection，and it did not need expensive special equipment.It had the advantages of less pre-laboratory input，wide linear range，no internal parameters，direct quantification，and cheap kit.Conclusion T7-linked double-signal amplification technique can detect seven pathogenic RNA in respiratory tract conveniently and quickly.It has high sensitivity，specificity and timeliness，and is suitable for clinical application.
[keyword] T7- connected dual signal amplification technology；pathogen RNA；respiratory tract infection
呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统，分为上呼吸道感和下呼吸道感染，常见病原体为病毒，少数为细菌和肺炎支原体、衣原体。
呼吸道病原体七项为甲型流感病毒H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1/2/3型、腺病毒B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体，是儿童急性呼吸道感染常见的病原体[1]。本研究采用T7-链接双信号放大技术检测小儿呼吸道七项病原体RNA，分析其灵敏性和特异性及时效性，探讨其临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选取2017年5月5号至2018年1月23号我院住院处及门诊急性呼吸道感染患儿390例，男孩232例，女158例；年龄1个月至14岁，平均（4.0±3.9）岁。患儿在入院当天或者第二日晨起咽拭子迅速擦拭患儿两侧腭弓、咽及扁桃体，取咽部分泌物，将拭子插入装有1mL1xPBS缓冲液或生理盐水的采集管中，折断并弃去咽拭子尾部，旋紧管盖。注明标本留取时间，及时送检。
1.2 材料：T7-连接双信号放大技术检测呼吸道病原七项RNA试剂盒由武汉中帜生物科技有限公司提供，手工操作仪器为化学发光检测仪TZD-CL-200S，全自动化学发光免疫分析仪ADC CLIA、全自动化学发光酶免仪Tethys。
1.3 方法
1.3.1 按照T7-链接双信号放大检测试剂盒相应说明书进行。1）样本预处理。2）检验准备工作。3）样本和阳性质控物裂解。4）T7核酸扩增。5）信号放大检测按七项呼吸道病原体核酸检测试剂盒（双扩增法）产品说明书所示操作步骤进行。6）化学发光检测仪自动进行结果判定。
1.3.2 灵敏度测定：根据产品性能评估结果，本试剂盒的各病原体检测灵敏度为：
1.3.3交叉反应：七种病原体间以及与其它病毒（甲型流感病毒H5N1、副流感病毒4a型、副流感病毒4b型、腺病毒1型、腺病毒2型、人冠状病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、百日咳杆菌、棒状杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、乳杆菌、卡他莫拉菌、无毒结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟、淋球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、唾液链球菌）之间无交叉反应。响。
1.3.5质量控制：阴性质控物的8项检测指标的检测值均低于10000，阳性质控物的8项检测指标应均判断为阳性，否则，实验视为无效，需重新进行检测。样本的18SrRNA检测指标应判断为阳性，否则需重新检测或重新采样。当样本的18SrRNA检测指标为阴性时，说明样本检测可能存在抑制或采样未采集到细胞，建议重新检测或重新采集细胞；检测结果和样本采集、运输及保存条件有关，其中任何失误都将会导致假阴性结果。如果样本在处理过程中发生交叉污染，则可能出现假阳性结果。
1.3.6检验方法的局限性：1）样本的检测结果应与临床评价及其他诊断方法结合使用。本产品用于辅助诊断呼吸道感染性疾病，检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。2）不合理的样本采集、转运及处理、样本中病毒的滴度过低均有可能导致假阴性结果。3）本产品检测区域针对的是病原体的保守区，很少发生突变，只有在极少数情况下会导致假阴性。4）采用不同于本操作说明中所明示的温度与反应时间，可能会导致错误的检测结果。5）对于抗病原体治疗对本品的检测性能的影响，未建立相关信息。
1.3.7 肺炎支原体抗体应用富士瑞必欧株式会社的赛乐迪亚-麦可Ⅱ（SERODIA-MYCO Ⅱ）采用被动凝集法进行检测；衣原体用珠海丽珠试剂股份有限公司的肺炎衣原体IgM抗体检测试剂盒采用酶联免疫法进行检测；流感三项应用北京英诺特生物技术有限公司的流感病毒A型、B型、副流感病毒IgM抗体联合检测试剂盒采用胶体金法进行检测。
1.4 统计学分析：采用SPSS16.0软件进行分析。计数资料比较采用x2检验，分析两种检测方法效能和吻合Kappa系数，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 T7-链接双信号放大技术检测结果：本次RNA检测共收集390例标本，支原体MP、衣原体CP两项检测351例，支原体阳性94例（阳性率26.78%），衣原体阳性15例（阳性率4.27%）；腺病毒AdV、合胞病毒RSV、人副流感病毒PIV三项检测16例，腺病毒阳性2例（阳性率12.5%），合胞病毒阳性11例（阳性率68.75%），人副流感病毒阳性3例（阳性率18.75%）；所有七项病原体检测19例，未查出甲型流感病毒，乙型流感病毒FluB3例（阳性率15.79%）。
2.2支原体、衣原体、流感三项检测结果：同时检测支原体、衣原体抗体IgM522例，支原体阳性90例（阳性率17.24%），衣原体阳性34例（阳性率6.51%；甲型流感、乙型流感、副流感病毒抗体IgM184例，未检出甲型流感，乙型流感6例（阳性率3.26%），副流感26例（阳性率14.13%）。
2.3 T7-连接双信号放大技术和抗体检测结果比较：
T7-链接双信号放大技术和IgM检测支原体、衣原体、甲流、乙流、副流阳性率比较（%）
支原体和乙型流感病毒的T7-链接双信号放大技术与抗体IgM检测阳性率差异具有统计学意义P<0.05，衣原体和副流感病毒的T7-链接双信号放大技术与抗体IgM检测差异不具有统计学意义，P＞0.05。
3.讨论
儿童呼吸道感染是儿科最常见的疾病之一，全年任何时候均可发病，发病率较高，发病次数也不固定，每个人常可以多次发病，营养不良，机体免疫力低下的小儿易患。。呼吸道感染症状多样，常见发热、咳嗽、鼻塞、流涕，一些患儿还可有恶心、呕吐、腹痛等胃肠道症状。检测呼吸道感染原方法常见的有抗体IgG、IgM性、定量的检测，核酸PCR、RNA、DNA的检测，血、痰、鼻咽拭子的培养等等。临床诊断的金标准多为培养结果，但培养往往时间长，阳性率低，不能及时有效地指导临床诊断和治疗，所以临床一般选用抗体或者PCR检测，但PCR最终测定的是DNA，对临床诊断也有一定的局限性。
本研究结果显示T7-链接双信号放大双扩增技术与抗体检测，尤其是急性期抗体IgM的检测相比较，具有较高的灵敏度和特异性，尤其在时效性方面，能更快更准的检出病原。双扩增法最终产物是RNA，具有灵敏度高，因为病原体复制活跃期核糖体RNA的含量远高于DNA，所以RNA更易被检测到；患者用药后病原体死亡，RNA随之降解，所以RNA检测是活菌检测，有助于临床对病原体的早期判断和治疗效果进行评估；有临床专家共识指出：核酸扩增诊断技术不受年龄、产生抗体的能力、病程早晚及用药等因素的影响，在感染早期的检出率最高[2][3]。双扩增法中的T7核酸扩增技术是在NASBA技术基础上开发，能在单管内实现多对引物的扩增。有文献指出：通过对比试验发现NASBA的敏感性（100%）高于RT-PCR（77.5%）和ELISA（65%）。【4】
有文献指出：采用直接冻融法处理咽拭子样本，结果显示NABSA的灵敏度明显高于逆转录PCR，且特异性高、耗时相对较短，克服了目前实验室病毒检测方法的局限性。【5】
双扩增法与免疫荧光法比较，双扩增法的总阳性检出率高于免疫荧光法，差异有统计学意义。【6】双扩增法检测RNA检测较DNA检测具有临床相关性好，可辅助愈判、用于疗效监测、指导临床精准用药，反映病原体在患者体内的活性状态。而DNA可以检测到病原体的潜伏感染，有些病原体潜伏时间很长，因而，DNA检测阳性并不能表明该病原体正处于活跃状态，此种情况下的阳性结果临床相关性差，易导致错误治疗、过度治疗。低污染，由于环境中存在稳定的RNA酶可使RNA降解，不易污染其他检测结果。而PCR技术最终的扩增产物为DNA，因为环境中DNA很稳定，扩增引起的污染不容易消除，容易引起假阳性结果。设备要求低，RNA恒温扩增技术避免了PCR的升降温步骤，降低了对仪器的要求。
综上所述，T7-链接双信号放大技术可快速、高效、特异地检测七项病原的RNA，具有敏感性、特异性高，可用于临床检测，使用该检测方法指导临床用药，有望提高初始治疗效率，缩短平均住院时间，可望成为快速诊断病原的方法。明确引起感染的病原体，选择合适的治疗方案，可以有效的防止抗生素滥用，使患者得到及时有效地治疗。
参考文献：
[1]王惠榕，萧剑雄.肺炎支原体感染的流行病学研究进展[J].中国人兽共患病学报，2010，26（11）：1062-1066.
[2] 儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识2015年版
[3] 三种方法对儿童肺炎支原体感染诊断的动态评价
[4] 儿童呼吸道常见病原体检测新进展与临床意义
[5] 运用多种方法提升儿童感染性疾病的实验诊断能力
[6] 双扩增法与免疫荧光法比对试验数据
论文作者:尹芳革,赵永波,郭锦华
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第26期
论文发表时间:2018/11/8
标签：病原体论文; 流感论文; 支原体论文; 病毒论文; 阳性论文; 抗体论文; 衣原体论文; 《中国误诊学杂志》2018年第26期论文;