莫炫永1 王衍洪2 何珊娜2
（1 东莞市国药质量检测中心, 广东东莞523010; 2 中山大学附属东华医院药学部. 广东东莞523000）
【摘要】目的：建立同时测定马来酸依那普利叶酸片中马来酸依那普利和叶酸含量及马来酸依那普利活性代谢物依那普利拉的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。C18 柱，以乙腈:0.5% 甲酸（25:75）为流动相，流速为0.4 mL/min，检测波长为215 nm，柱温为50℃。结果：依那普利、依那普利拉和叶酸之间能够达到很好分离，它们的回归方程分别为:A=1.133 1ρ-5361.62, A=15.104ρ-31.92，A=25.21ρ-324.53。结果表明，马来酸依那普利在0.505 38 ～ 5.053 8 mg/L r=0.999 8(n=6) 平均回收率分别为99.91%，RSD=1.15%(n=9)。依那普利拉在16.192 ～ 161.92 mg/L r=0.999 1(n=6) 平均回收率分别为97.1%，RSD=1.39%(n=9)。叶酸在81.232 ～ 812.32μg/L r=0.9991(n=6) 平均回收率分别为100.11%，RSD= 1.20%(n=9)。结论：该法能够同时测定三组分的含量，而且简便、准确、快速，可用于监测本品在血浆中的血药浓度。
【关键词】马来酸依那普利；依那普利；叶酸；高效液相色谱法；血药浓度
【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-9753（2015）08-0174-02
马来酸依那普利叶酸片是在药物基因组研究成果的基础上研制开发成的国家级一类新药，主要成分为马来酸依那普利10 mg，叶酸0.8 mg。
马来酸依那普利是一种长效ACEI 类抗高血压药，其降压疗效虽然较好，但长期应用对高血压患者靶器官保护作用有限。同型半胱氨酸(Hey) 是目前众多营养因素中的研究热点，它的升高与心血管疾病有明显的相关性。Hey 可引起内皮细胞脱落，导致低密度脂蛋白氧化，消弱血管的反应应答能力，增强单核细胞的聚集。有研究表明叶酸可降低血液中的Hey 水平，降低中风的发生率，通过降低Hey 水平发挥靶器官保护作用。本品能够在有效控制血压的同时，保护靶器官，山莨菪碱大鼠体内主要代谢途径、脑卒中等动脉粥样硬化性及血栓性心脑血管疾病的发生率。马来酸依那普利和叶酸的HPLC 测定法均有文献报道，但HPLC 法同时测定这2 种成分血药浓度及马来酸依那普利体内代谢活性物质依那普利拉含量笔者未见报道。本实验采用反相色谱，分离和测定了该血浆中这三种组分，方法可靠，结果准确。
1 仪器与试药
Agilent 1200RRLC 型高效液相色谱仪及OPANLAB EZChrom工作站( 美国Agilent 公司)；CPA225D 十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；马来酸依那普利对照品( 供HPLC 法测定，按C20H28N2O5?C4H4O4 计，本品含量为99.8％ 100705-201203中国食品药品检定研究院 )、依那普利拉对照品( 检查用100707-200401 中国食品药品检定研究院)、叶酸对照品( 按 C19H19N7O6计，供 HPLC 法测定，含量为 89.7% 100074-201214 中国食品药品检定研究院)；马来酸依那普利叶酸片( 批号：20130901 深圳奥萨制药有限公司，规格：马来酸依那普利10mg，叶酸0.8mg)；甲醇( 分析纯)，乙腈( 色谱纯)，甲酸（分析纯）、蒸馏水( 超纯水)。
2 观察指标
观察指标包括方法的专属性：检测药物之间是否存在互相干扰；药品的线性关系：利用回归曲线，判断药物的线性关系；溶液稳定性：对不同浓度的样品进行检测，观察溶液的稳定性；实验的重现性及血药浓度。
3 统计方法
计量资料采用 表示，组件比较采用t 检验，计数资料采用率表示，组件比较采用χ2 检验，双侧P<0.05 为差异有统计学意义。
4 方法与结果
4.1 色谱条件
色谱柱：C18 色谱柱(Xbridge 3.0mm×100 mm，3.5μm， 美国Waters 公司)；以乙腈-0.5% 甲酸(25 ∶ 75) 为流动相，流速为0.4mL?min-1；检测波长为215 nm；柱温为50℃。
4.2 方法的专属性考察
马来酸依那普利和叶酸与已知有关物质依那普利拉，及血浆中两个组分的HPLC 分离检测结果见图1，结果表明，血浆对主药测定无干扰，已知有关物质峰与各主成分峰能够达到基线分离。
4.3 线性关系考察
精密称取马来酸依那普利对照品12.66 mg，置50 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密称取依那普利拉对照品10.12 mg，置50 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml 置50ml 量瓶中加流动性稀释至刻度摇匀，作为储备液。精密称取叶酸对照品11.32 mg，置50 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml 置50ml 量瓶中加流动性稀释至刻度摇匀，作为储备液。分别精密量取马来酸依那普利储备液和叶酸储备液各0.2，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0mL, 分置100 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。各量取溶液5μL 注入色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。将溶液质量浓度(ρ) 分别与依那普利、依那普利拉和叶酸峰面积(A) 做线性回归,得马来酸依那普利的回归方程为:A=1.133 1ρ-5361.62，相关系数(r)=0.999 8(n=6)，依那普利拉的回归方程为:A=15.104ρ-31.92，相关系数(r)=0.999 1(n=6)，叶酸的回归方程为:A=25.21ρ-324.53，(r)=0.999 1(n=6)。结果表明，马来酸依那普利在0.505 38 ～ 5.0538 mg?L-1、依那普利拉在16.192 ～ 161.92 mg?L-1、叶酸在81.232 ～ 812.32μg?L-1 内，A 与ρ 呈良好线性关系。
4.4 精密度实验
精密量取“2.3”项下对照品溶液，连续重复进样6 针，以马来酸依那普利峰面积计算RSD 为0.33%(n=6)，依那普利拉峰面积计算RSD 为1.73%(n=6)，以叶酸峰面积计算RSD 为1.02%(n=6)。
4.5 溶液稳定性实验
精密量取“2.3”对照品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24h 进样，记录色谱图，以马来酸依那普利峰面积计算RSD 为0.18%(n=6), 以依那普利拉峰面积计算RSD 为1.03%(n=6) 以叶酸峰面积计算RSD 为0.60%(n=6)。结果表明，本品溶液在24h 内稳定。
4.6 重现性实验
取样品( 批号:20130901)20 粒，研细，精密称取细粉适量，共6 份，照“2.8”项下方法测定，以峰面积/ 称样量计算RSD(%)。结果马来酸依那普利RSD 为0.79%(n=6), 依那普利拉RSD 为1.13%(n=6)，叶酸RSD 为1.07%(n=6)。
4.7 回收率实验
按本品制剂处方，配制高(120%)、中(100%)、低(80%) 含量测定模拟内容物，每个质量浓度称取各3 份，分别测定其含量，并计算回收率。马来酸依那普利、依那普利拉和叶酸的平均回收率分别为99.91%、97.1% 和100.11%， RSD 分别为1.15%(n=9)、1.39%(n=9)和1.20%(n=9)。
4.8 血药浓度测定
健康男性人员在清洗期后于早晨服用本品一片，然后分别于0.3、0.5、0.75、1、2、3、4、8、12、24 小时后于肘部抽血适量，离心（4000rpn 10min），取血清1ml，加入3ml 甲醇，混匀，离心（10000rpn,5min），取上清液2ml，氮吹至干，加流动相1ml 溶解，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液5μl 同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。结果符合文献中的药时曲线, 曲线见图2。故本方法适用于测定人体血浆中依那普利、依那普利拉和叶酸的浓度。
5 讨 论
5．1 检测波长的选择
将适当质量浓度的马来酸依那普利、依那普利拉与叶酸溶液在200 ～ 400 nm 内进行扫描。结果显示马来酸依那普利、依那普利拉只在205 nm 处有一末端吸收，且吸收峰的下降段延续到250 nm 处，而叶酸在此范围内也有较大吸收，因此在此范围内选择几个波长进行实验。结果在215 nm 处2 组分峰面积均较大，且色谱基线噪音小，满足检测要求。
5．2 柱温的选择
依那普利和依那普利拉均具有脯氨酸结构，这种结构中的C—N 键具有部分双键的性质，导致C—N 键的自由旋转受阻，而依那普利和依那普利拉是构象异构体。当这种构象异构体之间相互转化的速度较低时，在色谱系统中可以被分离。而这种转化速度主要受温度的影响，即温度高，转化速度快，可以使C—N 单键跨过施转能级，达到自由旋转。我们考察了20 ～ 80℃内柱温的变化对色谱峰形的影响，结果显示柱温在50℃以上，依那普利峰和依那普利拉峰及叶酸峰的理论板数均可以达到2 500 以上，且温度越高，柱效越高。但从保护色谱柱的角度考虑，选择柱温为50℃。
5．3 流动相中试剂的选择
分别考察了以甲醇和乙腈作为流动相的有机相对色谱峰形的影响。结果显示，用甲醇作为有机相较乙腈可以得到较高的理论板数；但是由于甲醇的沸点低于乙腈，在高柱温时，甲醇作为有机相的流动相在色谱系统中表现出较高的基线噪音。因此经过综合比较后，选择乙腈作为流动相的有机相。参考文献中考察了四甲基溴化铵，四丁基溴化铵，苄基三甲基氯化铵以及十六烷基三甲基溴化铵等离子、磷酸盐、0.1% 甲酸、0.5% 甲酸、0.5% 醋酸，最后选择了0.1%的甲酸，依那普利峰、依那普利双酮峰和叶酸峰能做到基线分离。而离子对试剂对仪器及色谱柱的损害极大，且在测定血样时基线不稳定，存在血浆中的杂质干扰测定。
5.4 色谱柱的选择
我们测试了多个品牌的， 有4.6*250mm 5μm,4.6*150mm5μm,3.0*100mm 3.5μm，4.6*50mm 1.8μm，4.6*75mm 2.5μm 的等不同规格C18 色谱柱，从样品在血样中的分离度、出峰时间、理论塔板数、样品的上样量、系统运行时间、对色谱柱的保护等考虑最后确定XbridgeTMC18 3.0 mm×100 mm,3.5μm, 美国Waters 公司的色谱柱。
所以，高效液相色谱可以作为同时测定血浆依那普利叶酸片中三种组分含量的方法。而且具有简便、准确、快速的特点。
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论文作者:莫炫永1 王衍洪2 何珊娜2
论文发表刊物:《中国医学人文》2015年第8期供稿
论文发表时间:2015/9/14
标签：依那普利论文; 马来论文; 叶酸论文; 色谱论文; 精密论文; 浓度论文; 溶液论文; 《中国医学人文》2015年第8期供稿论文;