李菊香, 颜素娟, 罗伟, 苏海, 程晓曙[1]2004年在《心肌营养素-1在高血压心室重塑中的作用及药物的干预》文中研究说明目的探讨心肌营养素-1(CT-1)在高血压心室重塑中的作用,以及与肾素血管紧张素系统(RAS)的关系;观察氟伐他汀防治心室重塑的机制是否与CT-1有关。方法(1)离体实验:用160mmHg的高静水压刺激原代培养的心肌成纤维细胞,同时用心肌营养素-1的反义寡核苷酸进行干预。分别用MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖,放免法检测AngⅡ的浓度,Western blot检测CT-1蛋白的表达。(2)在体试验:硝基精氨酸甲酯(L-NAME)诱导的高血压大鼠分别用氟伐他汀和卡托普利进行干预。12周后处死动物,取材观察心肌组织病理变化,检测心肌中AngⅡ及羟脯氨酸的浓度,用Western blot检测心肌中CT-1的表达。结果离体实验:高静水压能明显促使心肌成纤维细胞增殖,AngⅡ分泌增加,CT-1合成上调,而CT-1的反义寡核苷酸能抑制高静水压诱导的细胞增殖和AngⅡ分泌。在体实验:L组大鼠第二周血压开始明显升高,卡托普利能使血压明显下降,逆转心室重塑,并减少AngⅡ的分泌,下调心肌组织中CT-1的表达。而氟伐他汀对血压无影响,但能逆转心室重塑,使AngⅡ分泌下降,且能下调心肌组织中CT-1的表达。结论CT-1能调节高血压的致的心室重塑,且这一作用与RAS之间有一定的联系。在不影响血压的情况下,氟伐他汀可能通过减少CT-1的分泌从而逆转高血压心室重塑。
李菊香, 颜素娟, 罗伟, 苏海, 程晓曙[2]2004年在《心肌营养素-1在一氧化氮缺乏性高血压大鼠心室重塑中的作用及药物的干预》文中认为目的近年有研究发现心肌营养素-1(Cardiotrophin-1,CT-1)与高血压心室重塑之间有一定的关系,本文探讨CT-1对一氧化氮缺乏性高血压大鼠心室重塑的影响及氟伐他汀的干预作用。方法以硝基精氨酸甲酯(L-NAME)诱导的一氧化氮(NO)缺乏性高血压大鼠为模型。分为四组:(1)正常对照组(C):常规饮食饮水;(2)L-NAME组(L):L-NAME(50mg/kg/d);(3)L-NAME+氟伐他汀组(L+S);第四周开始加氟伐他汀(5mg/kg/d);(4)L-NAME+卡托普利组(L+C);第4周开始加用卡托普利(50mg/kg/d)。于第1、2、4、6、8、10和12周末用尾袖法测血压,12周后处死动物,取材观察心肌组织病理变化,检测心肌中血管紧张索Ⅱ(Ang Ⅱ)及羟脯氨酸的浓度,用Western blot检测心肌中CT-1的表达。结果(1)与对照组相比,L组大鼠第二周血压开始明显升高[(151.25±7.58)vs.(116.50±10.62)mmHg,P<0.01],卡托普利干预组第六周开始血压明显下降[(1.23.43±4.86)vs.(167.50±17.85)mmHg,P<0.01)],而氟伐他汀对血压无影响;(2)L组Ang Ⅱ浓度较C组明显增高[(1023.00±50.19)VS.(735.50±72.12)pg/mg,P<0.01)]L+S组、L+C组Ang Ⅱ浓度明显低于L组[(833.19±117.59)vs.(123.00±50.19)pg/mg,(807.08±44.57)vs.(1023.00±50.19)pg/mg,P<0.05](3)L组羟脯氨酸浓度较C组明显升高[(0.44±0.06)vs.(0.277±0.80)μg/mg,P均<0.01],L+S组、L+C组浓度较L组明显降低[(0.32±0.08)vs.(0.44±0.06)μg/mg,(0.30±0.09)vs.(0.44±0.06)μm/mg,P均<0.05];(4)L组心肌组织中CT-1蛋白的表达明显增高[(1.79±0.21)vs.(1.02±0.12),P<0.01],L+S组、L+C组心肌组织中CT-1蛋白的量较L组明显减少[(1.32±0.16),(1.12±0.15)vs.(1.79±0.21),P均<0.05],与C组无差异。结论L-NAME诱导的NO缺乏性高血压大鼠心肌组织中CT-1蛋白表达上调,卡托普利能减少心肌组织中CT-1的量,推测CT-1可能参与NO缺乏性高血压大鼠心室重塑,且受肾素血管紧张素系统(RAS)的影响。氟伐他汀在不影响血压的情况下能明显预防NO缺乏性高血压大鼠心室重塑,减少心肌组织中CT-1的量,提示氟伐他汀下调CT-1的表达可能是其预防NO缺乏性高血压大鼠心室重塑的机制之一。
颜素娟, 李菊香, 程晓曙, 吴清华, 苏海[3]2006年在《心肌营养素-1在高血压心室重塑中的作用及药物的干预》文中提出目的探讨心肌营养素-1(CT-1)在高血压心室重塑中的作用,以及与肾素血管紧张素系统(RAS)的关系;观察氟伐他汀防治心室重塑的机制是否与CT-1有关。方法 (1)离体实验:3—4代心肌成纤维细胞用于实验,分为四组:(1)空白对照组(C):大气压下培养;(2)高静水压组(H):160mmHg压力下培养; (3)CT—1反义寡核苷酸组(ASODN):160mmHg压力培养下,加入终浓度为10μmol／L的CT-1反义寡核苷酸:(4)CT—1正义寡核苷酸组(SODN):160mmHg压力培养下,加入终浓度为10μmol／的CT-1正义寡核苷酸。MTT法检测细胞增殖,并检测培养液中的AngⅡ的量,Western—blotting法检测细胞裂解液中CT-1蛋
颜素娟, 李菊香, 程晓曙, 吴清华, 苏海[4]2006年在《心肌营养素-1在高血压心室重塑中的作用及药物的干预》文中认为目的探讨心肌营养素-1(CT-1)在高血压心室重塑中的作用,以及与肾素血管紧张素系统(RAS)的关系;观察氟伐他汀防治心室重塑的机制是否与CT-1有关。方法1、离体实验:3～4代心肌成纤维细胞用于实验,分为4组:(1)空白对照组(C):大气压下培养;(2)高静水压组(H):160mmHg压力下培养;(3)CT-1反义寡核苷酸组(ASODN):160mmHg压力培养下,加入终浓度为10μM的CT-1反义寡核苷酸;(4)CT-1正义寡核苷酸组(SODN):160mmHg压力培养下,加入终浓度为10μM的CT-1正义寡核苷酸。MTT法检测细胞增殖,并检测培养液中的AngⅡ的量,Western-blotting法检测细胞裂解液中CT-1蛋白的表达。2、在体试验:以硝基精氨酸甲酯(L-NAME)诱导的高血压大鼠为模型。分为四组:(1)正常对照组(C):常规饮食饮水;(2)L-NAME组(L):L-NAME(50mg/kg/d);(3)L-NAME+氟伐他汀组(L+S):第四周开始加氟伐他汀(5mg/kg/d);(4)L-NAME+卡托普利组(L+C):第四周开始加用卡托普利(50mg/kg/d)。12周后处死动物,取材观察心肌组织病理变化,检测心肌中AngⅡ及羟脯氨酸的浓度,用Western blotting检测心肌中CT-1的表达。结果离体实验:(1)与空白对照组相比,高静水压刺激后心肌成纤维细胞明显增殖(P<0.01),AngⅡ浓度增高(P<0.01),CT-1表达增加(P<0.01)。(2)CT-1ASODN干预后,高静水压的促细胞增殖作用明显减弱(P<0.05),降低AngⅡ浓度(P<0.05),明显抑制CT-1的表达(P<0.01);而CT-1的SODN对高静水压的促增殖,AngⅡ浓度及CT-1表达无明显影响。在体实验:(1)与对照组相比,L组大鼠第二周血压开始明显升高(P<0.01),卡托普利干预组第六周开始血压明显下降(P<0.01),而氟伐他汀对血压无影响;(2) L组AngⅡ浓度较C组明显增高(P<0.01),L+S组、L+C组AngⅡ浓度明显低于L组(P均<0.05);(3)L组羟脯氨酸浓度较C组明显升高(P<0.01),L+S组、L+C组浓度较L组明显降低(P均<0.05);(4)L组心肌组织中CT-1蛋白的表达明显增高(P<0.01),L+S组、L+C组心肌组织中CT-1蛋白的量较L组明显减少(P均<0.05),与C组无差异。结论高静水压能刺激成纤维细胞增殖,CT-1蛋白表达上调,而CT-1的反义寡核苷酸能抑制高静水压的促增殖作用,表明CT-1参与高静水压的促心肌成纤维细胞增殖作用。高静水压能促进成纤维细胞分泌AngⅡ,CT-1的反义寡核苷酸抑制高静水压的促AngⅡ分泌,表明CT-1参与高静水压的促心肌成纤维细胞增殖作用与RAS有关。(3) LNAME诱导的NO缺乏性高血压大鼠心肌组织中CT-1蛋白表达上调,卡托普利能减少心肌组织CT-1的量,推测CT-1可能参与NO缺乏性高血压大鼠心室重塑,且受RAS的影响。(4)氟伐他汀在不影响血压的情况下能明显预防NO缺乏性高血压大鼠心室重塑,减少心肌组织中CT-1的量,提示氟伐他汀下调CT-1的表达可能是其预防NO缺乏性高血压大鼠心室重塑的机制之一。
颜素娟[5]2004年在《心肌营养素-1在高血压心室重塑中的作用及药物的干预》文中研究指明目的：探讨心肌营养素-1（CT-1）在高血压心室重塑中的作用，以及与肾素血管紧张素系统（RAS）的关系；观察氟伐他汀防治心室重塑的机制是否与CT-1有关。方法：1、离体实验： 3-4代心肌成纤维细胞用于实验，分为四组：（1）空白对照组(C)：大气压下培养；（2）高静水压组(H)：160mmHg压力下培养；（3）CT-1反义寡核苷酸组(ASODN)：160mmHg压力培养下，加入终浓度为10μM的CT-1反义寡核苷酸; (4)CT-1正义寡核苷酸组(SODN)：160mmHg压力培养下，加入终浓度为10μM的CT-1正义寡核苷酸。MTT法检测细胞增殖，并检测培养液中的AngⅡ的量，Western-blotting法检测细胞裂解液中CT-1蛋白的表达。2、在体试验：以硝基精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的高血压大鼠为模型。分为四组：（1）正常对照组（C）：常规饮食饮水；（2）L-NAME组（L）： L-NAME（50mg/kg/d）；(3) L-NAME+氟伐他汀组（L+S）:第四周开始加氟伐他汀（5mg/kg/d）;（4）L-NAME+卡托普利组（L+C）：第四周开始加用卡托普利（50mg/kg/d）。12周后处死动物，取材观察心肌组织病理变化，检测心肌中AngⅡ及羟脯氨酸的浓度，用Western blotting 检测心肌中CT-1的表达。结果：离体实验：（1）与空白对照组相比，高静水压刺激后心肌成纤维细胞明显增殖(0.153±0.011 vs 0.114±0.012，p<0.01)，AngⅡ浓度增高(21.47±1.37 vs 17.86±0.64 pg/mg，p<0.01)，CT-1表达增加（1.56±0.24 vs 0.95±0.19pg/mg，p<0.01）。（2）CT-1ASODN干预后，高静水压的促细胞增殖作用明显减弱(0.132±0.013 vs 0.153±0.011，p<0.05)，降低AngⅡ浓度(19.12±0.91 vs 21.47±1.37pg/mg，p<0.05)，明显抑制CT-1的表达(1.03±0.21 vs 1.56±0.24， p<0.01)；而CT-1的SODN对高静水压的促增殖，AngⅡ浓度及CT-1表达无明显影响。在体实验：（1）与对照组相比，L组大鼠第二周血压开始明显升高(151.25±7.58 vs 116.50±10.62mmHg，p<0.01)，卡托普利干预组第六周开始血压明显下降(123.43±4.86 vs 167.50±17.85mmHg，p<0.01)，而氟伐他汀对血压无影响；(2) L组AngⅡ浓度较C组明显增高(1023.00±50.19 vs 735.50±72.12pg/mg，p<0.01)，L+S组、L+C组AngⅡ浓度明显低于L组 (833.19±117.59 vs
张国天[6]2007年在《阿托伐他汀对大鼠心肌梗死后心肌营养素-1的影响》文中认为背景和目的急性心肌梗死(acute myocardial infartion，AMI)后心室重塑(ventricular remodeling)是心室大小、形态、结构和功能变化的过程，包括梗死区心肌坏死产生膨出，非梗死区心肌肥大和成纤维细胞的增殖及间质胶原的增生、纤维化，最终导致心力衰竭。心室重塑是一复杂的病理生理过程，至今其机制尚未完全阐明。近年来，众多细胞和炎症因子在心室重塑发生机制中的作用受到重视。心肌营养素-1(Cardiotrophin-1，CT-1)是一种新近发现的细胞因子，属于白介素-6(interleukin-6，IL-6)超家族。已有的研究提示，CT-1在AMI后心室重塑中起着重要作用。一方面它可直接促使心肌细胞肥大和成纤维细胞生长、迁移、分泌Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。另一方面，CT-1增加局部血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)生成，通过肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)过度激活，进一步加重心室重塑。他汀类药物能改善心肌梗死后心力衰竭大鼠模型左室重塑和功能，但他汀类药物对大鼠AMI后CT-1和AngⅡ的影响尚未见报道。本实验通过建立大鼠心肌梗死模型，观察AMI后CT-1mRNA、AngⅡ、BNP mRNA(心肌肥厚标志基因)和Ⅰ型胶原的变化及它们之间的相互关系，初步探讨阿托伐他汀干预对它们的影响，为他汀类药物改善AMI后心室重塑提供新的理论依据。材料与方法(1)模型制作与分组健康清洁级雄性Wistar大鼠65只，体重240±20g，随机分为假手术组(n=15)和AMI组(n=50)；AMI组通过结扎左冠状动脉前降支(LAD)制作AMI模型，24h后存活36只，再随机分为心梗对照组(n=18)和阿托伐他汀干预组(n=18)。阿托伐他汀干预组每日给以阿托伐他汀(40mg／kg)灌胃，持续4周，假手术组和心梗对照组每日给以等量生理盐水灌胃。(2)超声心动图测定左室心功能大鼠麻醉后，采用二维超声心动图，探头频率10MHz，采用标准的左室长、短轴切面，测定左室舒张末期内径(LVEDd)、左室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)。(3)免疫组化染色测定心肌组织Ⅰ型胶原产量心肌组织石蜡包埋后连续切片，分别行HE染色及脱蜡水化，滴加稀释的一抗、二抗，用DAB显色、封片。采用图像分析软件在显微镜下分析，镜下观察棕黄色为阳性。(4)放射免疫法测定心肌中AngⅡ浓度左室非梗死区心肌按要求研磨成匀浆，煮沸、低温离心后，取上清液采用放射免疫法测定心肌中AngⅡ浓度。(5) SYBR Green I Real Time PCR检测各组大鼠心肌组织中CT-1、BNPmRNA的表达①总RNA的提取；②逆转录聚合酶链反应；③标准曲线绘制及SYBRReal Time PCR反应：以cDNA为模板，加入相应的引物及SYBR Premix Ex TaqTM，在Gene Amp 5700 Sequence Detector仪上分别对CT-1、BNP和管家基因GAPDH(内参)进行扩增，将扩增产物倍比稀释成5个不同浓度的标准品，制作CT-1、BNP和GAPDH标准曲线；将待测样品与标准品同时在Real Time PCR仪(型号同上)上反应，将所得不同Ct值分别代入各自的标准曲线，电脑自动读出各样品的起始模板量。再将各样品CT-1、BNP基因定量结果与GAPDH基因定量结果相比进行RNA校正，即可得到各组大鼠心肌组织中CT-1、BNPmRNA的相对表达量。结果(1)一般情况：4周后，各组大鼠存活情况分别为假手术组14只、心梗对照组13只、阿托伐他汀干预组14只。3组大鼠体重无显着性差异(P值均＞0.05)；心梗对照组和阿托伐他汀干预组大鼠心脏重量、左室重量、心脏重量指数和左室重量指数均明显高于假手术组(P值均＜0.05)，而阿托伐他汀干预组大鼠上述各指标较心梗对照组显着降低(P值均＜0.05)。(2)左心功能情况：4周后超声心动图显示的各组大鼠左心功能情况为：心梗对照组和阿托伐他汀干预组LVEDd明显高于假手术组(P值均＜0.05)，而LVEF和FS明显低于假手术组(P值均＜0.05)；与心梗对照组相比，阿托伐他汀干预组LVEDd显着降低(P值＜0.05)，LVEF和FS明显升高(P值均＜0.05)。(3)心梗对照组和阿托伐他汀干预组与假手术组相比，左室非梗死区Ⅰ型胶原产生、AngⅡ的浓度、CT-1mRNA、BNPmRNA的表达均明显增高(P值均＜0.05)，而阿托伐他汀干预组上述指标均明显低于心梗对照组(P值均＜0.05)。(4) Pearson直线回归分析表明：心梗对照组和阿托伐他汀干预组心肌组织中CT-1mRNA与BNPmRNA表达均呈正相关(r=0.747，；r=0.650，P值均＜0.05)、CT-1mRNA表达与Ⅰ型胶原的生成亦均呈正相关(r=0.687，；r=0.698，P值均＜0.05)。心梗对照组和阿托伐他汀干预组心肌组织中CT-1mRNA表达与左室非梗死区中AngⅡ浓度的变化也呈正相关(r=0.571，；r=0.651，P值均＜0.05)。结论(1)阿托伐他汀能够抑制心肌梗死后心室重塑，改善心功能；(2) CT-1参与了心肌梗死早期的心室重塑过程；(3)阿托伐他汀可下调大鼠心肌中CT-1mRNA、BNPmRNA的表达，减少Ⅰ型胶原的产生；(4) AngⅡ参与了心肌梗死后CT-1介导的心室重塑，但其因果关系不能确定。
夏子荣, 李菊香, 周瑞红, 颜素娟, 罗伟[7]2008年在《STAT3、ERK 1/2、PI3-K信号通路在心肌营养素-1致心肌成纤维细胞增殖中的作用》文中研究说明目的探讨心肌营养素-1(cardiotrophin-1、CT-1)在高血压心室重塑中的作用,观察叁条位于gp130下游的信号通路,即JAK-信号传导子和转录激活子3(singal transducer and activatorof transcription3.JAK-STAT3)通路、细胞外信号调节激酶1/2(extracel lular signal reguIatedkinasesl/2,ERK1/2)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinas.PI3-K)通路、在CT-1致心肌成纤维细胞增殖中的作用,以及在CT-1诱导心肌成纤维增殖时ERK1/2与STAT3之间的交汇作用(crosstake)。方法 3-4代心肌成纤维细胞用于实验,分为对照组、助溶剂(二甲亚砜,DMSO)组、CT-1反义寡核苷酸组(antisense oligodeoxynucleotides,ASON)、正义寡核苷酸对照组(sense oligodeoxynucleotides)PD98059组、AG490组、LY294002。利用自制压力培养装置,进一步将各组细胞置于160mmHg压力下培养8小时。STAT3的表达和活性通过RT-PCR和Western Blot分析测定;ERK1/2和PI3-K的表达和活性通过RT-PCR分析测定;心肌成纤维细胞增殖通过MTT测定。结果高静水压能明显促进心肌成纤维增殖,CT-1表达上调,CT-1ASODN干预后,STAT3、ERK1/2和P13-K mRNA以及蛋白表达水平明显下降;JAK-STAT3阻断剂AG490干预后对高静水压的促细胞增殖作用明显减弱并且增加ERK1mRNA的表达;MAPK-ERK1/2阻断剂PD98059干预后增强高静水压的促增殖并且增加STAT3mRNA表达,PI3-K阻断剂LY294002干预后对高静水压的促增殖作用无影响;SOND和DMSO组与对照组相比对心肌成纤维细胞增殖无明显差别。结论高静水压刺激心肌成纤维细胞CT-1的表达上调,促使STAT3、ERK1/2、PI3-K表达都上升;致心肌成纤维细胞增殖的作用主要通过STAT3通路;ERK1/2通路通过抑制STAT3的表达起负向调节作用,可能在防止心肌成纤维细胞过度增殖起重要的作用;PI3-K没有参与这一作用。上述STAT3通路与ERK1/2通路之间的相互作用可能有助与防止诱导心肌成纤维细胞过度增殖。
宁田海, 佟金[8]2015年在《《中国循环杂志》2015年第30卷关键词索引》文中研究说明说明:1本索引按关键词汉语拼音字母顺序排序。2在第1个汉字相同的情况下,按第2个汉字拼音字母顺序排序,以后依次类推。在第1个汉字音同字不同的情况下,按笔划多少排列。3在关键词相同的情况下按发表先后顺序排列。4以英文为首的词,按第1个英文字母顺序先后排列居文中关键词之前。5在第1个英文字母相同的情况下,按第2个英文字母顺序先后排列,依次类推。6文题、作者后括号内数字为期号,最后为起页。
李菊香[9]2007年在《心肌营养素-1在心肌缺血再灌注损伤中的作用及信号转导》文中指出研究背景与总体思路大量的基础和临床研究证实,缺血心肌再灌注后,缺血心肌细胞损伤会加重,包括心肌功能进一步受损、代谢异常以及心肌超微结构的改变进一步加重,即心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。再灌注损伤机制复杂,可通过多种途径产生,氧自由基的作用是I/R的重要发病环节,是细胞衰老和死亡的重要因素。心肌细胞凋亡与I/R密切相关,线粒体膜通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pole,mPTP)具有调节心肌细胞凋亡的作用,在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位Δψm的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,导致电子传递链中断,氧化磷酸化停止,细胞内氧自由基水平上升,ATP水平下降,改变细胞电化学氧化还原状态以及释放Caspase激活物,直接导致细胞凋亡或死亡。稳定线粒体膜电位Δψm,阻止线粒体膜通透性改变,可以逆转濒临凋亡的心肌细胞。因此研究心肌细胞凋亡的保护因子是当前的热点之一。CT-1是新近从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆出的一种细胞因子,主要表达于心肌细胞和心肌成纤维细胞,它参与调节心脏正常生理过程,具有促进心脏正常发育和促使细胞存活的作用。作为IL-6超家族成员,CT-1与受体gp130和或LIFRβ结合后,具有IL-6样作用,合成急性期反应蛋白,产生心肌保护作用。研究证实,急性心梗后缺血心肌CT-1表达明显增多,从而减少心肌细胞的死亡丢失,促进残余细胞的存活,并使成纤维细胞迁徙促进梗死区愈合,保护心功能。体外研究发现CT-1能增强新生大鼠心肌细胞在无血清培养基中的存活,CT-1诱导热休克蛋白hsp70和hsp90的过度表达,后者对培养新生心肌细胞的热休克或缺血缺氧的刺激有保护作用。以上均表明CT-1与心肌的损伤和功能有着密切的关系。为此我们设想,CT-1亦可能在大鼠急性I/R损伤心肌细胞代谢和功能的损害中发挥作用,并可能作为细胞内一种内源性保护物质,对减轻I/R损伤起着重要的保护作用。我们前期研究发现,CT-1通过JAK/STAT3信号通路介导高静水压促心肌成纤维细胞增殖,ERK1/2通路抑制其促增殖作用,PI3K信号通路则不参与CT-1的促心肌成纤维细胞增殖作用。那么,CT-1在心肌缺血和再灌注损伤中的作用机制如何,以及通过哪些信号转导途径发挥作用,如何发挥作用,尚需进一步的研究来证实。因此本研究:首先利用离体Langendorff缺血再灌注心脏,通过观察CT-1对离体缺血再灌注心脏心肌梗死范围,再灌注心律失常,心功能的影响,以及心肌的病理改变等,心肌eNOSmRNA和iNOSmRNA表达的变化,并利用信号通路阻断剂阻断CT-1的作用;从离体器官水平,研究CT-1是否对缺血再灌注心脏的心肌损伤具有直接的保护作用,并初步探讨CT-1的作用机制。其次利用离体培养的心肌细胞急性缺氧-复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1对缺氧-复氧后心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡的影响,及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(Δψm)、心肌细胞ROS等的变化,证实CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。并应用信号通路阻断剂及细胞因子信号抑制子-1(SOCS1)反义寡核苷酸技术,进一步阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制及信号转导途径;通过检测分化与凋亡相关基因的表达,从细胞和分子水平,论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。第一部分:CT-1对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用及机制探讨目的利用Langendorff灌流装置,建立离体大鼠I/R心脏模型,通过检测心肌梗死范围、心律失常、心肌酶学、心功能及病理改变,评估CT-1对缺血再灌注损伤大鼠心脏的作用;同时检测心肌eNOSmRNA表达和iNOSmRNA表达,初步探讨CT-1的作用机制。从离体整体心脏水平,探讨CT-1是否对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用,以及保护的机制如何。方法大鼠分为6组(n=12)(1)对照组;(2)缺血-再灌注组(IR组);(3)CT-1组1(缺血前加CT-110μg/l);(4)CT-1组2(缺血后加CT-110μg/l);(5)CT-1+LY294002组;(6)CT-1+PD98059组。LY294002,PD98059分别是PI3K /Akt、ERK1/2通路阻断剂, 0.1M的氢氧化钠溶解,并用磷酸缓冲液(PBS)调节pH值至7.4,灌流浓度分别是5μM和10μM。摘取大鼠心脏后进行离体Langendorff灌流,平衡15min,结扎30min ,再灌60min。恒压灌注,多导生理记录仪分别记录心率,心律,左室收缩压(LVSP)和左室内压力的变化速率(±dp/dtmax),计算冠脉流量,结合灌注压计算冠脉阻力,描记压力-容量曲线(P-V)计算左室舒张期顺应性。留取灌流液检测LDH、CK水平。灌注结束后采用氯化叁苯基四氮唑(TTC)溶液染色法测定心肌梗死范围,显微镜观察心肌病理变化,并取心室肌检测iNOSmRNA和eNOSmRNA表达。结果1、心律失常:IR组在缺血期间就出现早搏、短阵心动过速等心律失常;再灌注期间心率变慢,频繁的早搏、心动过速,甚至发生室颤等恶性心律失常。再灌注前经CT-1灌注预处理,无论缺血前或缺血后,心律不齐均出现晚,仅出现偶发的早搏,再灌注后早搏的次数明显减少,心动过速发生的次数少和持续时间短(P<0.05)。分别加用信号通路阻断剂LY294002(Akt/PI3K阻断剂),PD98059(ERK1/2阻断剂)灌注,能够抑制CT-1的改善心律失常作用,心律失常再次增加,出现明显的早搏、心动过速(P<0.05),甚至发生室颤。2、心肌损伤:IR组的心肌梗死范围为38.6±4.62%,CT-1组1和CT-1组2心肌梗死范围分别是22.5±3.15%和23.7±2.75%,均明显小于IR组(P<0.05)。各组I/R前LDH、CPK基线值差异无统计学意义,缺血30min后,LDH、CPK除CT-1组1变化不明显外,其它组均较缺血前升高。再灌注60min后,IR组LDH、CPK进一步升高,与再灌注前比较有显着的差异性。两CT-1组再灌注60min后LDH、CPK均较IR组下降,但与缺血30min后比较,仍有升高。表明,无论CT-1在缺血前或缺血后处理,均可以明显改善缺血-再灌注引起的心肌损伤。而CT-1处理后分别给予LY294002和PD98059处理,均能部分消除CT-1处理的这种保护作用。3、心功能:与缺血前比较,IR组心脏缺血30min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax明显下降,左室舒张期僵硬度增加,顺应性下降;再灌注30min后,上述参数进一步恶化,随后虽有所恢复,但再灌注60min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax仍低于缺血前,左室舒张期僵硬度高于缺血前。CT-1无论缺血前或缺血后处理,再灌注60min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax均较IR组明显提高,左室舒张期僵硬度较IR组低,但CT-1的这种效应可被两种通路阻断剂阻断。4、冠脉流量:各组离体IR前冠状动脉流量、冠脉阻力基线值差异无统计学意义。缺血30min后,冠状动脉流量除CT-1组1变化不明显外,其它组均较缺血前明显下降,而冠脉阻力则显着增加。再灌注60min后,IR组冠脉流量虽有所恢复,但较缺血前明显下降(8.1±0.7VS 10.8±0.9ml/min)。两CT-1组再灌注60min后冠脉流量稍有下降,但与缺血前比较,无统计学差异。而与I/R组比较,再灌注明显多于I/R组,冠脉阻力明显下降,表明,无论CT-1在缺血前或缺血后处理,均可以明显改善缺血再灌注心脏的血液供应。5、心肌iNOSmRNA和eNOSmRNA表达:心脏缺血-再灌注后,心肌iNOSmRNA表达较对照组明显上调,而eNOSmRNA表达则明显下调(0.579±0.046VS 1.973±0.147,P<0.05)。而无论缺血前还是缺血后使用CT-1处理,心肌iNOSmRNA表达均较IR组明显下调,eNOSmRNA表达上调(1.892±0.162VS 0.579±0.046,p<0.05);分别给予通路阻断剂LY294002和PD98059处理,iNOSmRNA表达较两CT-1组明显升高,eNOSmRNA表达下降;助溶剂DMSO组与CT-1组无差异。表明CT-1能够减少缺血再灌注心肌iNOSmRNA表达,升高eNOSmRNA表达。而LY294002和PD98059组的iNOSmRNA表达均明显高于两CT-1组,而eNOSmRNA表达则明显低于CT-1组。讨论与结论缺血导致心肌损害,而再灌注就象双刃剑,通过改善心肌氧供和限制心肌细胞“自溶”来减少梗死面积;同时引起心脏局部细胞因子网络的失衡及某些细胞因子、粘附分子的过度表达,增加心肌损伤,在一定程度上降低了再灌注的疗效。但与此同时机体为应对缺血/再灌注损伤的打击,会产生一些具有保护性非特异性蛋白,分泌一些内源性保护性物质,对抗应激造成的损害。主要来源于心室肌细胞的CT-1,除具有促进心脏正常发育和促使细胞存活的作用外,作为IL-6家族成员,合成急性期反应蛋白,产生心肌保护作用。本研究利用离体Langendorff灌流心脏,发现再灌注开始,左室收缩压、左室心肌收缩性不但不改善,反而比缺血时有所减弱,冠脉流量减少,而冠脉阻力则增加。CT-1预处理后明显减轻缺血再灌注后心肌损伤,减少再灌注心律失常的发生,特别是室性心动过速等恶性心律失常的发生,明显缩小心肌梗死面积,降低冠脉阻力,增加冠脉灌流量,改善心肌收缩性和左室舒张期僵硬度。而使用ERK1/2和PI3K信号通路阻断剂,可取消CT-1预处理对心脏的保护作用。表明CT-1对缺血再灌注损伤心肌有保护作用,提示CT-1可以作为一种治疗性蛋白对抗心肌缺血再灌注引起的损伤。并通过上调eNOSmRNA表达,减少iNOSmRNA,调控NO的合成抑制心肌损伤。第二部分CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用机制及信号转导目的本部分以体外培养的心肌细胞为研究对象,利用心肌细胞急性缺氧复氧模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡,心肌肌酸激酶等的影响,及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(Δψm)、心肌细胞ROS、NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1蛋白表达等的变化,进一步探讨CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。通过使用CT-1信号通路阻断剂LY294002,PD98059及信号抑制子(SOCS1)反义寡核苷酸(ASODN)转染心肌细胞,从细胞和分子水平阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的信号通路(包括激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)PI3K/Akt/糖原合成酶激酶(GSK-3β)即PI3K/Akt/ GSK-3β,PI3K/Akt/eNOS,ERK1/2,SOCS1/STAT3途径。通过检测分化与凋亡相关基因的表达,论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。方法1、乳鼠心肌细胞培养:取出生1-3天的SD大鼠心肌组织,按改良的Simpson等方法进行分次水浴搅拌消化,差速贴壁法纯化心肌细胞,以1×106/cm2的细胞密度接种于35mm培养皿。2、缺氧复氧模型的复制:心肌细胞生长接近汇合状态,呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液( NaH2PO4mmol/L, NaHCO3mmol/L, CaCl2 1.8mmol/L, MgSO41.2mmol/L,HEPES20 mmol/L,NaCl98.5 mmol/L, KCl10.0 mmol/L,乳酸钠40 mmol/L PH6.5)以95%N2-5%CO2预饱和1h,将培养的细胞以模拟缺血液置换正常培养基,放入密闭气体盒中通95%N2-5%CO2为缺氧;置换DMEM培养基后于CO2培养箱中正常培养为复氧培养即再灌注。3、实验分组:第一节:ERK1/2,PI3K/Akt/ GSK-3β,PI3K/Akt/eNOS途径介导CT-1对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤的保护作用根据实验方案分6组:①对照组:更换培养基后CO2培养箱中正常培养;②缺氧复氧组:缺氧3h,复氧培养3h;③缺氧复氧+CT-1组:缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;④缺氧复氧组+CT-1+ LY294002组(PIK3/akt阻断剂):缺氧3h,加入终浓度为10μmol/l的LY294002,10min后加CT-1(10ng/ml),再进行复氧3h处理;⑤缺氧复氧组+CT-1+PD98059组(ERK1/2阻断剂):缺氧3h,加终浓度为20μmol/L,10min后加CT-1(10ng/ml),复氧处理;⑥缺氧复氧组+ CT-1+ DMSO组:缺氧3h,加DMSO(助溶剂) 10min后加CT-1(10ng/ml),进行复氧3h处理。第二节:信号抑制子SOCS1/JAK介导CT-1对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤的保护作用分别设计SOCS1蛋白基因的2条ASODN,1条正义寡核苷酸(SODN),1条错义寡核苷酸(ScODN),通过脂质体转入心肌细胞。实验分为7组(1)对照组:DMEM液培养6小时;(2)缺氧/复氧组:缺氧3h,复氧3h;(3)缺氧/复氧+CT-1组(CT-1组):缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(4)缺氧/复氧+CT-1+ ASODN组1(ASODN组1,终浓度为20μmol/L):ASODN培养24小时后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(5)缺氧/复氧+CT-1+ ASODN组2(ASODN组2,终浓度为20μmol/L):ASODN培养24小时后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(6)缺氧/复氧+CT-1+ SODN组(SODN组,终浓度为20μmol/L):SODN培养24h后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(7)缺氧/复氧+CT-1+ ScODN组(ScODN组,终浓度为20μmol/L):ScODN培养24h后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理。4、检测指标:(1)相差显微镜检测心肌细胞形态,搏动频率和节律。(2)MTS法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,全自动生化分析仪测定上清液LDH、CPK-MB含量。(3)四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物(JC1)荧光显微镜和流式细胞仪检测心肌细胞线粒体膜电位Δψm;二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH CA)流式细胞仪检测心肌细胞活性氧(reactive oxygen species ,ROS)。(4)RT-PCR法检测心肌细胞eNOSmRNA、iNOSmRNA、SOCS1 mRNA、Id3 mRNA和BadmRNA表达。(5)蛋白免疫印迹(Western blot)检测NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1蛋白、PI3-K和PI3-K磷酸化蛋白水平,ERK1/2蛋白和磷酸化蛋白水平;GSK-3β蛋白和磷酸化GSK-3β蛋白水平;SOCS1蛋白水平。结果第一节1、心肌细胞搏动频率与节律:各组基线心肌细胞搏动频率均为148次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧-复氧后心肌细胞搏动频率较缺氧前明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧前比无明显减慢,与对照组相近,节律整齐。而阻断剂LY294002和PD98059干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则,而助溶剂DMSO并不干扰CT-1的作用。表明LY294002和PD98059均特异性阻断了CT-1对缺氧复氧氧损伤的心肌细胞的保护作用。2、心肌细胞的损伤:对照组心肌细胞存活率为96.2±3.2%,凋亡率为2.8±0.4%。缺氧-复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低,为76.8±4.6%,心肌细胞凋亡率明显上升(19.4±2.3%),二者差异有显着性意义(P<0.05),心肌酶LDH和CK-MB较对照组升高。CT-1处理的心肌细胞,明显抑制LHD、CK-MB的升高和凋亡的增加,存活率较缺氧复氧组明显升高(89.8±8.3%VS 78.8±4.6%, P<0.05), LY294002和PD98059组干预后,均明显阻断了CT-1的作用,心肌细胞存活率较CT-1组下降,而心肌细胞凋亡率增加。3、细胞内ROS水平和nox-1蛋白表达:缺氧-复氧后心肌细胞ROS水平和nox-1蛋白表达明显高于对照组(14.28±1.42 VS 3.54±0.16;1.127±0.107VS 0.215±0.018,P<0.01), CT-1处理后心肌细胞ROS水平和nox-1蛋白表达较缺氧复氧组下降(6.73±0.21VS 14.28±1.42, 0.394±0.036 VS 1.127±0.107, P<0.05),接近空白对照组。加LY294002和PD98059阻断剂干预后ROS水平和和nox-1蛋白表达则明显增加。而DMSO组ROS水平和nox-1蛋白表达与CT-1组相当。表明CT-1抑制细胞内ROS的生成,且与抑制nox-1蛋白水平有关。4、心肌细胞线粒体膜电位Δψm:流式细胞仪结果:缺氧复氧组心肌细胞Δψm明显小于对照组(86.28±7.15 VS 40.55±4.25,p<0.01),CT-1组较缺氧复氧升高(69.13±6.84 VS 40.55±4.25, p<0.05),加LY294002和PD98059阻断剂后Δψm水平则小于CT-1组(分别是50.13±5.82VS 69.13±6.84, 54.51±6.62 VS 69.13±6.84, p均<0.05),而DMSO组与CT-1组类似。荧光显微镜结果:当线粒体膜电位破坏时,JC1不能聚集到线粒体内,以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光,荧光强度与Δψm损伤程度成正比。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。缺氧复氧损伤组心肌细胞绿色荧光强度明显强于对照组,而红色荧光则明显弱于对照组,表明线粒体Δψm受到破坏。CT-1处理的心肌细胞JC1绿色荧光强度明显减弱,红色荧光增强。LY294002和PD98059阻断剂处理后,心肌细胞Δψm下降,绿色荧光强度增强,红色荧光减弱。表明缺氧复氧损伤心肌细胞Δψm受损,CT-1能够阻止缺氧复氧引起的心肌Δψm细胞损伤,而信号阻断剂能阻止CT-1的作用。4、心肌细胞iNOS和eNOSmRNA表达:对照组iNOSmRNA水平较低,缺氧/复氧损伤后心肌细胞iNOSmRNA明显高于对照组, eNOSmRNA表达则低于对照组,二者差异有显着性意义(0.932±0.088 VS 0.117±0.053;0.347±0.023 VS 0.965±0.063,P均<0.05)。缺氧后CT-1处理的心肌细胞iNOSmRNA水平较缺氧复氧组显着降低,eNOSmRNA表达上调(0.359±0.027VS 0.932±0.038 ; 0.756±0.059VS 0.347±0.023 P<0.05),LY294002和PD98059组干预后,心肌细胞iNOSmRNA表达增加,eNOSmRNA表达下调,与CT-1组比较均有显着性差异。而助溶剂DMSO组与CT-1组无明显差别。5、心肌细胞PI3K蛋白和磷酸化PI3K蛋白水平:各组PI3K蛋白表达无明显差异,但磷酸化PI3K蛋白水平缺氧复氧组较空白对照组增加(0.475±0.032 vs0.325±0.018,P<0.05),CT-1组较缺氧复氧组显着升高(0.986±0.093 vs0.475±0.032,P<0.05),加PI3K/Akt阻断剂后PI3K蛋白水平明显下降(0.197±0.029 vs0.986±0.093,P<0.01),而助溶剂组和PD98059组与CT-1组无明显差异(0.963±0.048 vs0.986±0.093, P>0.05),表明CT-1激活了PI3K途径,而PI3K/Akt和ERK1/2途径在此实验未发现有交互作用。6、心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白水平:各组缺氧复氧后心肌细胞ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义。缺氧复氧组较空白对照组磷酸化ERK1/2蛋白表达有所增加(0.495±0.043 vs0.249±0.016,P>0.05),但无统计学差异,而CT-1组较缺氧复氧组显着增加(0.975±0.068 vs0.495±0.043,P<0.05),加ERK1/2阻断剂后ERK1/2蛋白水平明显下降(0.127±0.011 vs0.975±0.062,P<0.05),而助溶剂组与CT-1组无明显差异(0.925±0.063 vs0.975±0.062,P>0.05)PI3K/Akt阻断剂组与CT-1组无明显差异(0.969±0.059 vs0.975±0.062, P>0.05),表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞ERK1/2磷酸化的作用。7、心肌细胞GSK-3β蛋白表达和磷酸化状态:各组经3小时缺氧,3小时复氧后,心肌细胞GSK-3β蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK-3β蛋白表达明显减少,而CT-1组较缺氧复氧组显着上升,加PI3K/Akt阻断剂后磷酸化GSK-3β蛋白水平明显少于CT-1组,而助溶剂组和ERK1/2阻断剂组与CT-1组无明显差异,表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞GSK-3β磷酸化的作用。PI3K/Akt阻断剂可以抑制CT-1处理所引起的GSK-3β磷酸化,而ERK1/2阻断剂则无此作用。8、心肌细胞BadmRNA和Id3mRNA表达:缺氧复氧组心肌细胞BadmRNA表达明显高于对照组(0.986±0.035 VS 0.325±0.023,P<0.01),而Id3mRNA变化不明显,;CT-1处理组的BadmRNA表达较缺氧复氧组组下调(0.313±0.019 VS 0.986±0.035, P<0.05),Id3mRNA表达较I/R组稍有所下降,但无统计意义。两种信号通路阻断剂均能明显抑制CT-1的这种作用。第二节1、SOCS1介导CT-1对缺氧/复氧心肌细胞损伤:各组基线心肌细胞搏动频率均为150次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整。心肌细胞存活率明显降低,凋亡率明显增加。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧组比明显加快,与对照组相近,节律较整齐。两组反义SOCS1干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则;与CT-1组比较,心肌细胞存活率下降,心肌细胞凋亡率增加,LDH和CPK-MB增加;正义SOCS1和错义SOCS1并不干扰CT-1的作用。2、SOCS1介导CT-1对心肌细胞内ROS水平和线粒体膜电位Δψm的影响:缺氧复氧损伤后心肌细胞ROS水平明显升高(14.28±1.42VS 3.54±0.56, P<0.001), CT-1组心肌细胞ROS水平较缺氧复氧损伤组下降(4.73±0.48VS 14.28±1.52, P<0.01),接近空白对照组。两组反义SOCS1干预后ROS水平均明显高于CT-1组( 10.8±0.85VS 4.73±0.48,9.92±0.93 VS 4.73±0.48, P<0.05),而正义和错义SOCS1则对CT-1的作用无影响。流式细胞仪结果示:缺氧/复氧损伤组心肌细胞Δψm明显小于对照组,CT-1组较缺氧复氧组升高(69.13±6.84 VS 40.55±4.25, p<0.05),加反义SOCS1干预后Δψm水平则小于CT-1组(51.32±5.75VS 69.13±6.84;47.18±5.01VS 69.13±6.84, p<0.05)。正义SOCS1和错义SOCS1组结果与CT-1组类似。荧光显微镜结果:缺氧复氧损伤组心肌细胞绿色荧光强度明显强于对照组,表明线粒体膜转运孔mPTP受到破坏。CT-1预处理后心肌细胞JC1绿色荧光强度明显减弱,反义SOCS1干预后,心肌细胞Δψm下降,绿色荧光强度增强。而正义SOCS1和错义SOCS1组结果与CT-1组类似。3、反义寡核苷酸(ASODN)对SOCS1蛋白及mRNA表达的影响:缺氧复氧组较空白对照组SOCS1 mRNA表达和SOCS1蛋白水平有所增加;而CT-1组SOCS1 mRNA表达和SOCS1蛋白水平均较缺氧复氧组显着升高,表明CT-1促进心肌细胞SOCS1过表达。SOCS1反义寡核苷酸干预后SOCS1mRNA和蛋白水平较CT-1组明显下调,而SOCS1正义寡核苷酸和SOCS1错义寡核苷酸组与CT-1组无明显差异。表明转染的反义SOCS1能有效地抑制缺氧复氧心肌细胞SOCS1的表达。4、SOCS1对CT-1介导的心肌细胞磷酸化STAT3的影响:各组非磷酸化STAT3蛋白水平无明显差异。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化STAT3蛋白表达明显增加(0.672±0.034 vs0.147±0.012, P<0.05),而CT-1组较缺氧复氧组显着下降(0.425±0.035 vs0.672±0.031,P<0.05),加SOCS1反义寡核苷酸后磷酸化STAT3蛋白水平明显增加,而SOCS1正义寡核苷酸组和错义寡核苷酸组与CT-1组无明显差异,表明SOCS1抑制CT-1引起的STAT3磷酸化。结论1、CT-1对心肌细胞损伤的作用:减轻缺氧-复氧诱导的心肌细胞的损伤,表现在心肌细胞存活率增加,凋亡率减少,心肌细胞搏动有力且有节律,减少心肌损伤酶的释放。2、CT-1减轻心肌缺氧复氧损伤的机制:(1)通过抑制NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1mRNA的表达,减少心肌细胞ROS的产生;(2)增加eNOSmRNA表达,减少iNOSmRNA表达;调控NO的合成,抑制心肌细胞凋亡;(3)减轻心肌细胞线粒体膜孔电位Δψm的损伤,改善心肌细胞线粒体膜转运孔的功能。3、CT-1减轻心肌缺氧复氧损伤的信号传导:(1)激活PI3K/Akt/GSK-3β途径;(2)激活PI3K/Akt/eNOS途径;(3)激活细胞外信号调节激酶ERK1/2途径;(4)激活信号抑制子SOCS1途径,抑制STAT3的磷酸化。4、CT-1通过激活以上信号通路,抑制促凋亡基因BadmRNA表达,减少缺氧-复氧损伤的心肌细胞的凋亡。
魏群[10]2010年在《激活素A-卵泡抑素系统在心衰后左心室重构中的作用》文中研究表明慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心血管疾病发展到晚期的病理综合征,是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前的研究认为心室重构是慢性心力衰竭发生发展的主要病理基础,既包括心肌细胞的重构又包括心肌间质的胶原沉积和纤维化,即心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)。MF是指在心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中胶原纤维过量积聚,胶原含量显着升高或胶原成分发生改变,主要表现为心肌细胞肥大、心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFb)增殖并分泌大量胶原蛋白。研究表明,心肌纤维化是不同病因的心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,可导致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、心肌电生理紊乱、心律失常及冠状动脉储备下降甚至引起猝死,是心室重构的主要表现之一。由于梗死区的心肌组织被胶原代替形成瘢痕,非梗死区占心脏的大部分,其重构的特点与梗死区不同,梗死后非梗死区的变化对心脏长期预后的影响可能更大。而且目前国外的研究也表明非梗死区在心衰的心室重构中占有重要地位,因此本实验着眼于对非梗死区心室重构的研究。研究发现某些细胞因子在MF的形成中发挥了关键作用。转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)即是与MF有关的最重要的细胞因子,而激活素A(Activin A)属于TGF-β超家族成员,是机体参与急性期应答以及纤维化形成的重要因子。卵泡抑素(Follistatin,FS)作为Activin A特异结合蛋白,可以阻断Activin A的生物学作用。FS与Activin A常共同存在、共同表达构成一个维持组织器官正常生长的平衡系统,其中一项的过度表达或另一项的减少引起的Activin A-FS系统的失衡将伴随某些组织器官生理过程的失调和病理过程的形成,而且Activin A-FS系统被认为是重要的、以复合体形式调节多种细胞功能的系统。尽管有研究报道Activin A在心梗后心衰模型组左室缺血区及非缺血区表达升高,但有关Activin A-FS系统在心梗后心衰形成及纤维化中的作用仍不清楚。因此,本研究通过检测心力衰竭患者血清中Activin A、FS及BNP的表达水平,探讨其表达水平变化及临床意义,同时采用结扎Wistar大鼠左冠状动脉前降支制备心梗后心衰模型,分析Activin A-FS系统的表达在心衰后左心室重构中的作用机制及雷米普利与替米沙坦的干预机制。主要研究内容如下:1、临床研究:选择2008年3月~2008年12月门诊和住院的充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)病人。CHF诊断标准参照2005年ESC《成人慢性心力衰竭的诊断与治疗指南》,心功能分级参照美国纽约心脏病协会1994年修定标准NYHA分类法。健康对照组(control)44例,为随机选取的同期健康者,男20例,女24例,年龄63~84(平均73.27±7.07)岁,排除心肺、肝肾、糖尿病及其他内分泌疾病。CHF病人87例,其中男性46例,女性41例,年龄63~85(平均72.88±7.35)岁,排除肺、肝、肾、糖尿病及其他内分泌疾病,按照美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级分为3组:心功能II级组(NYHA II,30例)、心功能III级组(NYHA III,26例)和心功能IV级组(NYHAIV,31例)。清晨空腹采集静脉血3ml,1500r/min离心15min后,分装血清于?80℃冰箱冻存。人血清Activin A、FS及BNP水平检测具体操作步骤按照人Activin A、FS及BNP的ELISA检测试剂盒说明书(美国ADL公司)进行。临床研究发现,与健康对照组比较,证实心衰病人血清BNP水平升高,同时心衰病人血清Activin A水平也明显升高,差异显着(P<0.05～0.001),并且心衰病人血清Activin A的水平与心衰程度及BNP水平呈正相关,相关系数及P值分别为(R=0.9350,P<0.001),(R=0.8918,P<0.001)。NYHA II组及NYHA III组血清FS的水平无明显变化(P>0.05),NYHA IV组血清FS水平呈下降趋势,但差异无显着性(P>0.05)。2、结扎Wistar大鼠左冠状动脉前降支6周建立心梗后心衰模型,同步灌胃给予雷米普利与替米沙坦干预5周后,观察各组大鼠心肌形态学的变化、血流动力学、心肌肥厚指数,分析Activin A-FS系统的表达变化。应用RT-PCR法检测左室非梗死区心肌组织Activin A及其相关受体IIA、IIB,FS,col- I及col-III mRNA表达水平,以及测定col-I / col-III比值。ELISA方法检测大鼠血清及左室非梗死区心肌组织Activin A、血管紧张素II(Ang II)蛋白表达,左室非梗死区心肌组织FS蛋白表达及血清BNP水平。行HE染色及Masson染色分析左室非梗死区心肌胶原沉积。进一步行免疫组织化学染色检测左室非梗死区心肌组织Activin A及FS蛋白表达情况。研究结果表明心梗后心衰模型组大鼠Activin A-FS系统存在明显的失衡。与假手术组比较,心梗后心衰模型组左室非梗死区心肌组织Activin A mRNA及蛋白表达水平均显着升高,激活素II型A受体(ActRIIA)和II型B受体(ActRIIB)、胶原蛋白I及III(col-I & col-III)mRNA表达水平,以及col-I / col-III比值亦增高,同时与心室重构相关介质(BNP和AngII)水平升高,并伴随心功能降低及心肌肥厚指数升高,Masson染色可见大量胶原沉积。有意义的是,我们发现心梗后心衰模型组左室非梗死区心肌组织FS mRNA及蛋白表达水平下降。给予雷米普利与替米沙坦同步干预后,可以下调左室非梗死区心肌组织Activin A mRNA及蛋白表达水平,上调FS mRNA及蛋白表达水平,同时可见ActR II及胶原蛋白mRNA表达水平下降,心功能明显改善,BNP和AngII水平及心肌肥厚指数亦明显降低,心肌胶原沉积减轻。综上所述,本研究结果显示,临床检测血清Activin A水平有望作为心力衰竭诊断、治疗和监控的又一临床血清学指标,同时心梗后心衰的发生发展过程中Activin A-FS系统失衡,调节Activin A/FS比率可能成为改善心衰的治疗靶点。雷米普利与替米沙坦可通过调节Activin A-FS系统,改善左心室重构,本实验为其作用机制作一补充。
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