刘博虎1 范耀东2 廉坤1 李咏梅1 蒲军1（通讯作者）
（1昆明医科大学第二附属医院神经外科 650031；2昆明医科大学第三附属医院 650031）
【摘要】目的 观察猴脑缺血后行局部选择性深低温顺行脑灌注对谷氨酸（glutamic acid，Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）代谢的影响。方法 成年恒河猴8只，随机分为两组：选择性深低温组（阻断双侧颈总动脉后深低温灌注，n=5）；空白对照组（仅阻断双侧颈总动脉，n=3）。建立猴脑选择性局部深低温体外循环模型，自缺血前30min开始利用微透析技术持续采集脑细胞外液，常温下临时阻断双侧颈总动脉10min后行顺行性低温灌注，降脑温至18℃，维持60min，用高效液相色谱-紫外线法测定谷氨酸、γ-氨基丁酸浓度。结果 谷氨酸在常温下阻断双侧颈总动脉后迅速升高（P＜0.05）,行低温冷灌注后较常温脑缺血时明显下降（P＜0.05），恢复血供复温过程较冷灌注时谷氨酸无明显变化。γ-氨基丁酸在常温脑缺血、低温冷灌注及恢复血供复温过程中无明显变化，仅在低温冷灌注初期稍下降，随着冷灌注时间的延长逐渐恢复至灌注前水平（P＞0.05）。讨论 Glu表达下降、GABA表达变化不明显，提示脑脑缺血后选择性深低温灌注过程中主要通过降低Glu表达，减低了Glu的“兴奋性”毒性，提高了神经元对缺血缺氧的耐受性，促进受损脑细胞的修复，是脑缺血的重要保护机制之一 。
【关键词】谷氨酸 γ-氨基丁酸 恒河猴 选择性深低温 脑缺血
【中图分类号】R741 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0063-02
研究表明：脑局部选择性深低温可以提高脑对缺血缺氧的耐受性，同时避免心衰、肺水肿等严重的全身并发症[1-3]。本实验通过微透析技术持续采集脑细胞外液，利用高效液相色谱-紫外线法测定谷氨酸、γ-氨基丁酸浓度，了解选择性深低温对猴脑缺血模型神经递质代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年恒河猴8只，雄性，购于中国科学院昆明动物研究所实验中心，年龄7-10岁，平均8.2岁，体重6.9-11kg,平均8.1kg。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立
丙泊酚静脉麻醉后，留置尿管，放置肛温温度计，分离血管，右侧颈内动脉远心端插管连接降温系统；右颈内静脉远心端连接超滤复温装置，右颈内静脉近心端插管测中心静脉压；左股静脉近心端插管备回输复温后的体循环血流，右股静脉近端插管备低温灌注时回收体循环血流；右股动脉插管测平均动脉压；右顶叶插入针形脑温传感器并连接脑温监测仪，降温前全身肝素化，夹闭双侧颈外静脉、颈总动脉和颈内静脉，常温下缺血10min后，经降温系统向右颈内动脉内输入4℃的林格氏液，保持灌注速度10ml/kg/min，维持脑温在≤18℃，同时自右颈内静脉头端回流灌注液，经左股静脉回收体循环血流经超滤器去除多余水分后复温至37℃，回输至右股静脉，脑温降至≤16℃后，维持脑温于此值60min后停止低温灌注，恢复上述血管正常血流，使脑自然复温。术中持续监测生命体征和血流动力学变化。
1.2.2 标本采集及处理
左顶叶植入微透析针（透析膜有效长度4mm，截至分子量20ku），于断血前90min开始恒速（2.5μL/min）透析，60min后开始采集透析液，收集缺血前10min至复温后40min的脑细胞外液（每20min采集1管，共7管），收集的微透析液速置-80℃冰箱保存。将微透析采集大脑细胞外液通过紫外线法测定，用已知的标准品氨基酸色谱保留时间与微透析液的色谱保留时间进行对照定性，采用外标法计算色谱峰面积进行定量测定。
1.2.3 统计学处理
应用SPSS17.0统计软件，计量资料以x-±s表示，氨基酸含量不同时间位点之间的比较采用单因素方差分析。α=0.05,P＜0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
选择性深低温组5只猴成功建立了脑选择性深低温断血流60 min 安全复苏模型，术后长期存活。对照组缺血60min后均未恢复意识，48h内死亡。
2.2 谷氨酸及γ-氨基丁酸代谢变化
谷氨酸在常温下阻断双侧颈总动脉后迅速升高（P＜0.05）,行低温冷灌注后较常温脑缺血时明显下降（P＜0.05），恢复血供复温过程较冷灌注时谷氨酸无明显变化。γ-氨基丁酸在常温脑缺血、低温冷灌注及恢复血供复温过程中无明显变化，仅在低温冷灌注初期下降，随着冷灌注时间的延长逐渐恢复至灌注前水平（P＞0.05）。
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缺血后深低温灌注前后猴脑细胞外液谷氨酸、γ-氨基丁酸含量(μM)
时间 Glu GABA 缺血前 2.05±0.64bfg 9.95±0.08bfg 断血流后10min(常温) 2.97±1.36acde 9.84±0.18acde 断血流后30min (冷灌注初) 1.49±0.48bfg 9.3±0.07bf 断血流后50min (冷灌注中) 1.66±0.66bfg 8.75±0.82bg 断血流后70min(冷灌注末) 1.77±0.68bfg 9.36±0.60bf 恢复血流复温初 1.44±0.12acde 9.84±0.34 恢复血流复温中 1.78±0.37acde 9.78±0.43
aP<0.05,vs.缺血前；bP<0.05,vs.断血流后10min；cP<0.05, vs.断血流后30min；
dP<0.05,vs.断血流后50min；eP<0.05,vs.断血流后70min；fP <0.05,vs.恢复血流初；gP<0.05,vs.恢复血流中。
3 讨论
氨基酸类神经递质是人类脑组织中最重要的神经递质, 包括兴奋性及抑制性两类：抑制性递质主要有γ-氨基丁酸和甘氨酸, 兴奋性递质主要有谷氨酸和天门冬氨酸。谷氨酸和天门冬氨酸的过度刺激可能会导致神经元的损伤[4-6]。脑组织缺血、缺氧导致兴奋性氨基酸的过度积累，兴奋性氨基酸介导激活谷氨酸受体的钙离子通道导致大量钙离子内流产生兴奋性毒性。谷氨酸是大脑内主要的神经递质，其负责包括认知、记忆、感觉、运动等功能。过度积累的谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA），增加细胞内钙离子，从而触发一个级联的细胞内反应，活化磷脂酶，蛋白酶，蛋白激酶，磷酸酶，以及一氧化氮合酶（NOS）。NOS导致增加一氧化氮生产，这可能会损害DNA的脱氨基作用导致DNA链断裂。受损的DNA激活DNA聚合酶加的dATP到切口的DNA链的末端，从而导致dATP的消耗。这些过程，最终导致细胞死亡[7-11]。由此可见，脑缺血缺氧后谷氨酸的大量释放是神经细胞死亡发生的重要始动环节。本实验利用微透析技术采集脑细胞外液，通过紫外线法进行高效液相色谱分析，实验表明，缺血10min深低温灌注组谷氨酸在常温断血流预缺血后迅速升高，低温灌注后较常温缺血时明显下降。结果提示：选择性深低温可以抑制脑缺血后谷氨酸等EAA的过度释放, 因而能减少谷氨酸介导的钙内流, 从而抑制钙内流介导的神经元死亡的细胞内级联反应，这和Nishi[12-13]等的研究结果一致。深低温停循环后应用谷氨酸受体拮抗剂可以明显抑制神经元的凋亡[14-15]。虽然谷氨酸并非是导致缺血神经细胞死亡的唯一因素，但胞外谷氨酸浓度越高，NMDA受体过度兴奋，缺血神经细胞内游离Ca2+就越多，这是谷氨酸“兴奋毒性”病理过程导致缺血神经细胞死亡的重要因素[16]。
γ-氨基丁酸通过激活GABA受体复合物来增加GABA，可以导致跨过突触后膜的氯离子的流动增加，减轻脑缺血产生的损伤作用。γ-氨基丁酸通过介导突触后膜抑制性突触后电位（IPSP）的产生，对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋毒”作用具有直接的对抗作用[11]。本实验表明：γ-氨基丁酸在脑缺血前保持在一定水平，常温脑缺血、低温冷灌注及恢复血供复温过程中无明显变化，仅在低温灌注初期稍降低，并未出现代偿性增加。因此，本实验从氨基酸类神经递质代谢角度说明脑选择性深低温技术通过脑局部低温降低脑内谷氨酸表达发挥了一定的脑保护作用。
缺血10min深低温组恢复血流后行再灌注复温，和行低温冷灌注时相比，谷氨酸无升高。复温再灌注过程是脑氧供需失衡的时期，脑氧耗增加，引起无氧代谢增多，自由基大量生成, 脑内氨基酸代谢紊乱，兴奋性氨基酸的毒性作用增强，而选择性深低温(阻断双侧颈总动脉)在恢复血流后行再灌注复温，与低温灌注时相比，谷氨酸含量变化不明显，这从一个侧面说明，脑缺血后行脑局部选择性深低温灌注在避免全身严重并发症的同时具有脑保护作用。
参考文献
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课题支持:昆明医科大学研究生创新基金，项目编号：2013S17 ；
论文作者:刘博虎1,范耀东2,廉坤1,李咏梅1,蒲军1
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第39期供稿
论文发表时间:2014-4-8
标签：谷氨酸论文; 低温论文; 丁酸论文; 选择性论文; 氨基论文; 常温论文; 脑缺血论文; 《中外健康文摘》2013年第39期供稿论文;