巩燕, 李晓海, 应万涛, 蔡耘, 钱小红[1]2006年在《血液蛋白质组学的研究技术及进展》文中研究说明人血液含有来源于几乎所有细胞、组织、器官的蛋白质,可以直接反映病理、生理状态,是各种疾病诊断、生物标志物发现的最有价值的标本。因此,长期以来,血浆蛋白质组一直是人们研究的热点,并被人类蛋白质组组织(HUPO)列为首批启动的重大国际合作研究项目。血浆蛋白质含量动态范围非常广、成分极其复杂,血浆蛋白质组的研究极富挑战性。近年来,血浆高丰度蛋白质去除、蛋白质/肽段分离、质谱鉴定、数据处理等多种相关技术都取得了很大的进展。本文简要综述了上述技术领域的研究和应用进展。
许志宾[2]2007年在《人永生化肝细胞和高转移肝癌细胞的糖蛋白质组学研究及Prohibitin 1上调与肝癌关系的研究》文中进行了进一步梳理第一部分人永生化肝细胞糖蛋白质组学研究本论文提出一种用于大规模分离和鉴定人永生化肝细胞(Chang liver细胞)的N-糖基化糖蛋白的方法。为了从细胞裂解物中高通量地分离N-糖基化糖蛋白，我们先对Chang liver细胞进行裂解、细胞总蛋白溶解以及凝集素亲和层析(包括Concanavalin A (Con A)和wheat germ agglutinin (WGA))，再利用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)对于被凝集素吸附的糖蛋白进行分离，最后利用质谱技术(mass spectrometry，MS)进行鉴定。图像数据经过ImageMaster~(TM) 2-D Platinum软件分析，Chang liver细胞中的蛋白质经Con A吸附后平均检测到323±5(n=3)个蛋白点；经WGA吸附后平均检测到256±5(n=3)个蛋白点。去除重迭的124±5(n=3)个蛋白点后，共吸附455个不同的蛋白点。对于从Chang liver细胞裂解物中吸附的糖蛋白，我们从考马斯染色的电泳胶上切点后进行质谱鉴定，共鉴定了84个蛋白点，其中47个蛋白点是Con A吸附的糖蛋白，代表40个不同的蛋白质；37个蛋白点是WGA吸附的糖蛋白，代表34个不同的蛋白质。去除Con A和WGA都有吸附的点后，共得到70个不同的蛋白质。结果表明，我们建立了一种高通量的糖蛋白质组学的方法分离人肝细胞的N-糖基化糖蛋白。本文的研究内容是人类肝脏蛋白质组学研究项目(HUMAN LIVER PROTEOME PROJECT(HLPP))的一部分，这种方法的建立将有助于促进人类对肝脏细胞N-糖基化糖蛋白的研究。第二部分人永生化肝细胞和高转移肝癌细胞的比较糖蛋白质组学研究应用第一部分的方法，我们对比了Chang liver细胞和人高转移肝癌细胞MHCC97-H的N-糖基化糖蛋白表达差异，分析发现7个在MHCC97-H细胞中上调的糖蛋白(p＜0.05)，其中2个是Con A吸附的糖蛋白，5个是WGA吸附的糖蛋白，并通过质谱技术结合数据库搜索进行了鉴定。鉴定结果表明，Con A吸附的糖蛋白分别为羧酸酯酶(Carboxylesterase)和热休克蛋白96前体(Heat shock protein gp96 precursor)，WGA吸附的糖蛋白分别为抑制素(Prohibitin 1，PHB)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(Glutamate-cysteine ligase，modifier subunit)、假定蛋白(Hypothetical protein)、类似B细胞增强因子的新蛋白(Novel protein similar to Pre-B cell enhancing factor，PBEF)和二氢硫辛酰氨脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase，E3 component of pyruvate dehydrogenase complex，2-oxo-glutarate com)。研究报道表明这些糖蛋白与癌症的发生、发展有一定的联系。第叁部分Prohibitin 1上调与肝癌增殖及迁移关系的研究在第二部分的研究结果中，我们发现prohibitin 1(PHB)在MHCC97-H细胞中明显上调。尽管PHB早被报道为一种肿瘤抑制蛋白，但尚未发现它与肿瘤的关系及其糖基化的报道，所以我们选择PHB作为对象进一步研究PHB上调与肝癌的关系。首先我们对糖蛋白质组学得到的PHB在肝癌细胞中的上调进行验证。通过Western blot和半定量RT-PCR两种方法证明了PHB表达量在肝癌细胞MHCC97-H细胞中比Chang liver细胞上调约2倍。同时我们还通过Western blot比较了4个肝癌病人的正常、癌旁和肝癌组织(pair test p＜0.01)的PHB表达量的差异，结果发现在两例病人的肝癌组织中PHB的表达明显上调(p＜0.05)。其次，为了研究PHB与肝癌的关系，我们选择其他肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7404、HUH-7、Lmb、MHCC97-L细胞，对其中PHB的蛋白表达水平进行了检测，发现除MHCC97-H细胞外，其他肝癌细胞中PHB的表达量均没有明显上调，尤其是MHCC97-L细胞中PHB的表达量明显低于MHCC97-H细胞。MItCC97-H和MHCC97-L细胞是具有相同遗传背景但转移潜能不同的细胞，所以我们下一步进行PHB与肝癌细胞迁移的关系的研究。我们通过构建PHB表达质粒，在MHCC97-L细胞中瞬时转染PHB表达质粒而使PHB过表达，然后对过表达PHB的MHCC97-L细胞和转染空质粒的MHCC97-L的增殖、迁移能力进行测定。结果表明，PHB在MHCC97-L细胞中过表达对MHCC97-L细胞的增殖抑制率为35％，而细胞的迁移率增加了2.1±0.1倍(p＜0.05)倍。最后，我们利用SWISS-PROT数据库预测、免疫共沉淀和凝集素L-PHA印迹验证PHB是一种糖蛋白。我们的结果第一次报道了PHB蛋白是一种N-糖基化糖蛋白，且参与肝癌细胞的增殖和迁移的调控。综上所述，本实验通过凝集素亲和层析和蛋白质组学技术建立了一种高通量的糖蛋白质组学的方法分离鉴定人肝细胞N-糖基化糖蛋白，并应用这种方法进行Chang liver和MHCC97-H的差异糖蛋白质组学分析，结果筛选出与肝癌细胞相关的7种上调糖蛋白，并对其中的PHB蛋白与肝癌细胞的关系及PHB糖基化进行了初步的研究。
安欣[3]2014年在《口腔扁平苔藓患者血清的蛋白质组学研究》文中研究指明口腔扁平苔藓（oral lichen planus, OLP）是一种可长期反复发作的慢性口腔黏膜病，因长期糜烂病损易癌变，WHO将其列入癌前状态。OLP的发生发展与心理因素、内分泌因素、免疫因素、感染因素等有关，但具体发病机制尚不明确。因对其发病机制研究不明，治疗一直没有显着的效果。因此对于口腔扁平苔藓发病机制的探寻成为目前急需解决的问题。近些年来，生命科学出现了一个崭新的时代——蛋白质组时代，蛋白质组学是继基因组研究基础上发展起来的一门科学，是通过对基因转录、合成后的产物蛋白质动态和整体水平上的研究，可以直接阐明生命在生理和病理条件下可能的发病机制。蛋白质组技术发展迅速，双向凝胶电泳是最主要的分离方法，双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescencedifference in gel electrophoresis，2-D DIGE）技术是在传统的双向凝胶电泳的基础上将对照组和实验组样品分别用荧光染料标记，然后混和在一起再进行双向凝胶电泳，根据不同荧光材料激发不同的波长，使差异蛋白点以不同的颜色表现在2D胶的图像上，从而检测到蛋白样品间微小表达差异，有更高的灵敏性、重复性、准确性。现在此技术已经广泛应用于国内外医学研究，尤其是应用此技术鉴定出与癌症相关的分子标记物，从而为抑制细胞恶性分化，为开发治疗药物奠定理论基础。但是目前国内外研究对于运用2-D DIGE技术研究口腔扁平苔藓的报道十分罕见，因此本研究采用此技术筛选并且鉴定口腔扁平苔藓患者和健康人血清中的差异蛋白，进一步探讨其可能的作用机制。目的：应用2-D DIGE以及液相色谱-质谱联用技术筛选、鉴定口腔扁平苔藓患者及健康人血清差异蛋白，进而分析口腔扁平苔藓患者与健康人相关蛋白水平有哪些变化，差异蛋白的功能及可能与口腔扁平苔藓有哪些关系，使口腔扁平苔藓的早期诊断预防、生物蛋白靶向治疗、预后判断趋于可能，同时也可证实双向荧光差异凝胶电泳在口腔扁平苔藓研究中具有实用价值。方法：1两种提取人血清蛋白方法比较：采用甲醇、10mM碳酸氢铵沉淀蛋白法和苯酚抽提的方法分别提取健康志愿者的血清蛋白，Bradford法测蛋白含量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后对比两种方法得到的蛋白条带，选择适合人血清蛋白的提取方法。2双向荧光差异凝胶电泳：随机选出6例口腔扁平苔藓初诊患者和6例健康志愿者并抽取静脉血，分离血清，提取血清蛋白，Bradford法测定蛋白含量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测各样品蛋白重复性、蛋白降解情况。双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白，Typhoon9410扫描仪对2-D DIGE胶进行扫描，然后Deep Purple染色，DeCyderTM差异分析软件6.5版搜索差异点,将差异表达量大于1.2倍的蛋白质点进行标记并生成挖点坐标文件，导出后用Ettan spot picker挖点。3液相色谱-质谱联用技术鉴定差异蛋白：挖出蛋白胶粒清洗、Trypsin溶液酶解成多肽，LTQ XL增强型二维线性离子阱质谱仪鉴定，应用Bioworks Browser3.3.1软件通过ESQUEST运算方法在蛋白数据库（NCBI中的human fasta数据2013.12.10）搜索差异蛋白的酶解肽段，以确定被测差异蛋白可能的名称，从而鉴定可能的蛋白质。结果：1选择人血清蛋白提取的最适合方法：本研究采用了甲醇、10mM碳酸氢铵沉淀蛋白法和苯酚抽提的方法分别提取血清蛋白，Bradford法测蛋白含量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较发现用苯酚抽提方法得到的电泳条带更清晰，蛋白纯化程度更高，因此选择苯酚抽提的方法用于本研究。2十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示：检测各样品蛋白显示各样品蛋白条带清晰，蛋白重复性较好，无明显蛋白丢失现象。3双向荧光凝胶电泳结果口腔扁平苔藓患者血清与健康人血清因用不同颜色的荧光染料标记，在2-D DIGE分离时，一些蛋白点是两种颜色的重合，即呈现出黄色，说明在口腔扁平苔藓患者血清和健康人中均有相同程度的表达，而另外还有一些各自特异高表达的蛋白点通过各自荧光染色的颜色显现出来，即呈现出红色或者绿色。经6个生物学重复，从而测得差异蛋白点平均为（583±183）个,选出重复性较好的差异点20个鉴定，得到12种蛋白，其中7种蛋白在患者血清中表达量降低，5种蛋白表达量升高。4液相色谱-质谱鉴定差异蛋白：鉴定出12种差异蛋白，分别是结合珠蛋白、铜蓝蛋白、血清补体C3、载脂蛋白A-Ⅰ、激肽原、维生素D、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、血清补体成分C9、人类因子B、β-1-金属结合球蛋白。结论：1苯酚抽提的方法更适合人血清蛋白的提取。2口腔扁平苔藓患者血清中存在差异蛋白,差异蛋白点平均为（583±183）个,重复性较好的差异蛋白12个并且表达量发生变化，其中7个在患者血清中表达量降低，5个表达量升高。3口腔扁平苔藓患者血清中质谱鉴定到得蛋白12个，其中结合珠蛋白、铜蓝蛋白、血清补体C3、载脂蛋白A-Ⅰ、激肽原、维生素D、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、血清补体成分C9、人类因子B可能与口腔扁平苔藓发病机制密切相关。
参考文献：
[1]. 血液蛋白质组学的研究技术及进展[J]. 巩燕, 李晓海, 应万涛, 蔡耘, 钱小红. 生物技术通讯. 2006
[2]. 人永生化肝细胞和高转移肝癌细胞的糖蛋白质组学研究及Prohibitin 1上调与肝癌关系的研究[D]. 许志宾. 复旦大学. 2007
[3]. 口腔扁平苔藓患者血清的蛋白质组学研究[D]. 安欣. 河北医科大学. 2014
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