（1.第二军医大学免疫学研究所 上海 200433；2.第二军医大学附属长海医院病理科 上海 200433）
摘要：目的 探讨天麻素（Gastrodin）在小鼠海水淹溺性急性肺损伤（SW-ALI）中对肺上皮细胞炎症反应的作用。方法 25只雄性C57小鼠随机分为5组：SW-ALI组和SW-ALI+ gastrodin组（每组设置3个时间点：0h，6h，12h，其中SW-ALI 0h作为空白对照组）。在小鼠建模前10min，腹腔注射gastrodin（30mg/kg），SW-ALI组注射PBS作为对照。在实验点收集每组的肺泡灌洗液（BALF），用酶联免疫吸附试验检测肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α的表达，记录48h内小鼠的存活率。脂多糖（LPS）刺激小鼠肺泡上皮细胞MLE12，分为空白对照组、LPS刺激组（1ug/ml）、LPS+gastrodin组，定量PCR检测刺激0、4、8h时IL-1β、TNF-α的表达，蛋白印迹实验检测P65和IκB磷酸化水平。结果 与单纯SW-ALI组比较，SW-ALI+ gastrodin组48h内的存活率上升，肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α的水平降低。体外实验表明，gastrodin能够抑制LPS诱导肺泡上皮细胞IL-1β、TNF-α的表达，并且抑制P65和IκB的磷酸化水平。结论 gastrodin能够通过抑制肺上皮细胞的炎症反应减少SW-ALI小鼠肺脏中炎症因子的产生，缓解SW-ALI导致的肺部炎症。
关键词：天麻素；海水淹溺；急性肺损伤；肺上皮细胞；治疗
Gastrodin attenuates the seawater drowning induced acute lung injury via inhibiting the inflammatory response of alveolar epithelial cells
GU Yan1，ZHU Jie1，LIU Yanfang2*
Department of Immunology，Second Military University，Shanghai，200433，China
Department of Pathology，Changhai Hospital，Second Military University，Shanghai，200433，China
[Abstract] Objective To explore the role of gastrodin in the regulation of seawater drowning induced acute lung injury（SW-ALI）. Methods 25 male C57BL/6 mice were randomly divided into five groups：SW-ALI group and SW-ALI+ gastrodin group（each group had 3 time points：0h，6h，12h，and 0h was taken as a control group）. Before SW-ALI，gastrodin（30mg/kg）was intraperitoneally injected and PBS was taken as a control. The bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of each group was collected at each time point. The expression of IL-1β and TNFα in BALF was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the survival rate of mice was recorded. LPS-stimulated MLE12 cell lines were divided into control group，lipopolysaccharide（LPS）group（1ug/ml），LPS+gastrodin group. Quantitative PCR was used to detect IL-1β and TNFα expression，and the phosphorylation of P65 and IκB was detected by Western blot. Results Compared with the SW-ALI group，the survival rate of the SW-ALI+ gastrodin group increased and the level of IL-1β and TNFα in the lung decreased. In vitro experiments showed that gastrodin could inhibit the expression of IL-1β and TNFα in alveolar epithelial cells stimulated by LPS via inhibiting the phosphorylation of P65 and IκB. Conclusion Gastrodin can inhibit inflammatory responses of alveolar epithelial cells and reduce the production of inflammatory factors in the lung of SW-ALI mice.
[key words] gastrodin；seawater drowning；acute lung injury；alveolar epithelial cell；therapy
现代海战条件下，海水淹溺是落水人员死亡的重要原因之一，其中的主要诱因是海水淹溺型急性肺损伤（seawater drowning induced acute lung injury，SW-ALI）[1]。不同于常见原因导致的急性肺损伤（acute lung injury，ALI），SW-ALI发病机制复杂，病情发展快，如不及时救治，可发展为急性呼吸窘迫综合症，死亡率急剧增高[2]。因此，研究SW-ALI的发病机制，早期及时干预治疗SW-ALI导致的肺部炎症，对于SW-ALI的治疗十分关键。
SW-ALI发病过程中肺上皮细胞起到重要作用。研究表明，其在识别外源性刺激、启动肺部炎症过程中至关重要[3]。因此，抑制肺上皮细胞炎症反应有望减轻SW-ALI导致的肺部炎症。天麻素由兰科植物天麻的根块提取，具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有缓解作用[4]。有报道显示，天麻素对于肺部炎症也有很好的治疗效果[5]。但其对SW-ALI的作用尤其是对肺上皮细胞功能的影响尚未见报道。我们通过构建小鼠SW-ALI模型，研究天麻素在肺上皮细胞炎症反应和海水淹溺性急性肺损伤中的作用，以期为SW-ALI的治疗提供有效的手段。
1.材料与方法
1.1实验小鼠与主要试剂
雄性C57小鼠，8周龄，体重20-25g，采购自上海西普尔-必凯实验动物公司，术前适应性饲养1周。ELISA试剂盒购自R&D公司；mRNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；小鼠肺上皮细胞系MLE12购自ATCC；p-P65、p-IκB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。海水取自东海海域，其中主要电解质含量：Na+ 465mmol/L，K+ 8.2mmol/L，Cl- 521mmol/L，Mg2+ 6.2mmol/L，Ca2+ 5.4mmol/L；PH值8.3。
1.2小鼠海水淹溺性急性肺损伤模型构建
用100g/L的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射（4mL/kg体重），麻醉后仰位于平板上。用镊子牵拉小鼠的舌，用移液枪吸取100μL海水，滴于小鼠咽后壁，并马上捏住小鼠的鼻子。20s后，松开舌及鼻，放于笼中让其自然苏醒。
1.3酶联免疫吸附试验检测肺泡灌洗液中IL-1β和TNFα的表达
25只雄性C57小鼠随机分为5组：SW-ALI组和SW-ALI+ gastrodin组（每组设置3个时间点：0h，6h，12h，其中SW-ALI 0h作为共同的空白对照组）。在小鼠建模前10min，腹腔注射gastrodin（30mg/kg），SW-ALI组注射PBS作为对照。在实验点收集每组的肺泡灌洗液（BALF），离心后收集肺泡灌洗液放于-80℃冰箱保存，统一时间按照ELISA试剂盒的说明书进行ELISA检测。
1.4定量PCR检测肺上皮细胞系中IL-1β和TNFα的表达
脂多糖（LPS）刺激小鼠肺泡上皮细胞MLE12，分为空白对照组、LPS刺激组（1ug/ml）、LPS+gastrodin组，收取刺激0、4、8h时的细胞，利用飞捷mRNA提取试剂盒提取mRNA，反转录成cDNA后，利用定量PCR技术检测IL-1β和TNFα的表达。IL-1β检测引物：forward 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’、reverse 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；TNFα检测引物：forward 5’-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3’、reverse 5’-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3’。
1.5蛋白印迹法检测p-P65、p-IκB的表达
收集LPS刺激肺上皮细胞0、4、8小时蛋白样品，蛋白印迹法检测p-P65、p-IκB的表达。蛋白上样，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离目的蛋白，电泳转移 2 h后，采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，转膜结束后，以5%脱脂牛奶进行封闭，用兔抗p-P65、p-IκB（1：1000）孵育，置于4℃冰箱孵育过夜，第二天用羊抗兔的二抗（1：2000）进行孵育1小时，将膜放入显影箱，用ECL显影液显色曝光。
1.6数据分析
计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用非配对T检验分析，各组间P<0.05，则差异具有统计学意义。采用 Graph Pad Prism5.01软件进行数据统计学处理与分析。
2.结果
2.1 天麻素提高SW-ALI模型小鼠存活率
本研究观察了SW-ALI组和SW-ALI+gastrodin（30 mg/kg）组（10只/组）小鼠48小时存活率。结果显示较SW-ALI组，SW-ALI+gastrodin（30 mg/kg）组的小鼠48小时存活率明显升高（分别为50%和80%，p<0.05）（图1）。
图1 给予gastrodin对SW-ALI小鼠存活率的影响
2.2 天麻素抑制SW-ALI模型小鼠炎症因子的分泌
为验证天麻素是否影响了SW-ALI模型小鼠肺部炎症反应，我们提取了正常对照小鼠、SW-ALI组和SW-ALI+ gastrodin（30 mg/kg）组小鼠的肺泡灌洗液（BALF），ELISA检测IL-1β和TNFα的浓度。结果显示，与正常对照小鼠相比，SW-ALI组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β和TNFα水平逐渐升高。提前给予gastrodin（30 mg/kg）处理后，能够明显抑制IL-1β和TNFα分泌水平（图2A，B）。
在LPS刺激MLE12后0、4、8h收取细胞，LPS+gastrodin组同时给予20mM gastrodin，定量PCR检测IL-1β和TNF-α的表达。LPS+gastrodin与单纯LPS组相比*p<0.05，具有统计学意义。
2.4天麻素抑制肺上皮细胞NF-κB信号通路的活化
为进一步探讨天麻素抑制肺上皮细胞炎症因子表达的机制，我们检测了NF-κB信号通路P65和IκB磷酸化水平。结果显示，与单纯LPS组相比，LPS+gastrodin能够明显P65和IκB的磷酸化水平（图4）。
讨论
海战条件下海水淹溺型急性肺损伤是海水淹溺引起死亡的主要原因。机制研究表明，海水淹溺可直接导致肺部损伤，引起肺部急性炎症反应，多种炎症介质、炎症细胞参与到发病过程中，如TNFα、IL-1β等[6]。抑制海水淹溺诱发的炎症损伤，是治疗急性肺损伤的关键因素。我们的既往研究表明，肺上皮细胞能够识别外源性刺激物启动肺部炎症信号，加剧肺部的炎症反应[3]。因此，通过抑制肺上皮细胞的炎性信号，是控制海水淹溺型急性肺损伤的有效途径。
天麻素具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有缓解作用。最新研究表明，天麻素也具有抗炎及调节免疫活性的功能[7]。在本研究中，我们发现应用天麻素能够降低SW-ALI小鼠IL-1β、TNF-α的水平，延长小鼠生存时间。机制研究表明，天麻素能够抑制肺泡上皮细胞P65和IκB磷酸化水平，从而抑制其IL-1β、TNF-α的表达，进而缓解SW-ALI导致的肺部炎症。我们的研究首次发现，天麻素能够通过作用于肺上皮细胞影响SW-ALI的肺部炎症反应，为SW-ALI的治疗提供了新的思路。
参考文献
[1]Liu Q P，Zhou D X，Lin P，et al. Participation of autophagy in acute lung injury induced by seawater [J]. ExpLungRes，2013，39（10）：441-452.
[2]Ji M H，Tong J H，Tan Y H，et al. Erythropoietin pretreatment attenuates seawater aspiration-induced acute lung injury in rats [J]. Inflammation，2016，39（1）：447-456.
[3]Liu Y，Gu Y，Han Y，et al. Tumor exosomal RNAs promote lung pre-metastatic niche formation by activating alveolar epithelial TLR3 to recruit neutrophils.[J]. Cancer Cell，2016，30（2）：243.
[4]Zhang J S，Zhou S F，Wang Q，et al. Gastrodin suppresses BACE1 expression under oxidative stress condition via inhibition of the PKR/eIF2α pathway in Alzheimer's disease [J]. Neuroscience，2016，325：1.
[5]Zhang Z，Zhou J，Song D，et al. Gastrodin protects against LPS-induced acute lung injury by activating Nrf2 signaling pathway [J]. Oncotarget，2017，8（19）：32147-32156.
[6]Jin F，Li C. Seawater-drowning-induced acute lung injury：From molecular mechanisms to potential treatments [J]. Exp Ther Med，2017，13（6）：2591-2598.
[7]Du F，Wang X，Shang B，et al. Gastrodin ameliorates spinal cord injury via antioxidant and anti-inflammatory effects [J]. Acta Biochim Pol，2016，63（3）：589.
论文作者:顾炎1,朱婕1,刘艳芳2*
论文发表刊物:《航空军医》2017年29期
论文发表时间:2018/3/6
标签：小鼠论文; 炎症论文; 天麻论文; 淹溺论文; 肺泡论文; 肺部论文; 上皮细胞论文; 《航空军医》2017年29期论文;