邵巍[1]2008年在《龙眼胚性培养物胞质型apx基因克隆及其表达研究》文中研究表明本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)“红核子”胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)体胚发生同步化调控而获取的各主要发育阶段胚性培养物以及经过NaCl、光、温度等逆境胁迫处理的龙眼LC2胚性愈伤组织为材料,进行如下研究:①在已有3′端序列基础上,采用同源克隆技术克隆胞质型apx基因5′端序列以获得完整的ORF;②进行胞质型apx基因的原核表达;③进行龙眼胚性培养物APX活性测定;④建立龙眼APX同工酶电泳分析方法,分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物以及逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化;⑤克隆龙眼胚性培养物中看家基因(β-actin),利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物以及逆境胁迫处理下龙眼EC胞质型apx基因转录水平表达变化。主要研究结果如下:1.龙眼胚性愈伤组织胞质型apx基因5′端序列克隆与cDNA全长序列获得以龙眼EC为材料,采用5′RACE方法,在已经获得的3′序列基础上设计反式引物,结合通用引物,进行巢式PCR,经过引物筛选和条件优化得到500 bp左右的特异条带。经测序发现该目的片段与已知3′序列有250 bp左右的重合序列,将二者拼接,得到1027 bp目的序列。该序列与登录Genbank的其它植物胞质型apx基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个753 bp的开放阅读框,编码251个氨基酸。推导的氨基酸序列与植物胞质型APX高度同源。经过分析,753 bp的开放阅读框中不含有内含子。2.龙眼胞质型apx基因原核表达根据拼接得到龙眼apx全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-29a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为28 kD的新蛋白出现。该诱导表达的蛋白分子量与理论推导龙眼胞质型APX的分子量27.7 kD相符。3.NaCl、光和温度胁迫下龙眼胚性愈伤组织APX酶活性变化在光、NaCl和温度胁迫处理下,龙眼胚性愈伤组织中APX酶活性均存在明显变化。本研究发现,与对照相比,叁种逆境胁迫都可不同程度的诱导APX活性增加;推测APX活性变化与胚性细胞抗逆性正相关。4.龙眼体胚发生过程不同阶段培养物和逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化本研究在APX同工酶提取、电泳、染色等几个方面进行了摸索,建立了一套适合分离龙眼胚性培养物APX同工酶的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法。并利用此方法分析龙眼体胚发生过程不同阶段培养物和逆境胁迫处理下龙眼EC的APX同工酶变化。发现在龙眼体胚发生这一氧化胁迫过程中,APX同工酶随胚性细胞分化会有酶谱带消失和新增,不同发育阶段存在明显差异。在叁种逆境胁迫处理下,龙眼EC中APX同工酶随胁迫条件的不同也会有酶谱带消失和新增。这些结果表明龙眼胚性细胞对氧化胁迫的应答不是依靠一种APX酶单独作用,而是多种APX同工酶一起协同作用。5.龙眼胞质型apx基因转录水平表达分析本研究从龙眼胚性愈伤组织中克隆到895 bp的β-actin基因3′端序列,做为实时荧光定量PCR技术分析胞质型apx基因表达变化的参照。分析结果显示,在龙眼体胚发生过程中,不同分化程度的胚性培养物的胞质型apx基因在转录水平的相对表达量均较胚性愈伤组织高,在紧实球形结构阶段相对表达量最大,之后在球形胚和子叶形胚阶段其相对表达量又有所降低。龙眼胚性愈伤组织温度胁迫下的分析结果显示,温度胁迫可诱导胞质型apx基因表达量增加,且低温诱导的增加趋势较高温明显。但在40℃时,apx基因相对表达量最大。
张冲[2]2016年在《甜瓜脂氧合酶基因家族成员鉴定、表达调控及CmLOX8在果实香气合成中的作用》文中提出薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)口感优良、香气独特,是中国重要的甜瓜品种资源。植物脂氧合酶(lipoxygenase, LOXs)是以多基因家族形式存在,不同基因家族成员在植物生长发育、成熟衰老、逆境调控以及香气物质合成中发挥重要的作用。香气物质是衡量薄皮甜瓜果实品质的重要指标之一,脂氧合酶可能在薄皮甜瓜果实挥发性物质合成中发挥重要作用。本试验以薄皮甜瓜“玉美人”(Cucumis melo var. makuwa Makino)为研究对象,鉴定了甜瓜LOX基因家族成员,并进行生物信息学分析；研究了LOX基因家族成员的时空表达特性；对不同类型的LOX基因家族成员进行克隆,并且研究了不同采后处理(乙烯、1-MCP、乙醇及低温)对LOX基因家族成员的表达调控；通过酵母真核表达系统对CmLOX18蛋白的生化特性进行研究；利用转基因技术将CmLOX18导入番茄(Solanum lycopersicum)植株中,探究了其在果实C6香气物质合成中的作用。主要研究结果如下：1.利用甜瓜基因组数据库,鉴定了18个LOXs基因家族成员,分别命名为CmLOX01-CmLOX18,其中有11个成员(CmLOX03-10, CmLOX12-13和CmLOX18)具有完整的或者接近完整的核苷酸编码区(ORF),其余7个成员(CmLOX01-02, CmLOX11和CmLOX14-17)不具有完整的编码区,但均具备典型LOX保守的38个氨基酸结构域(His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His);甜瓜LOX基因家族成员的序列同源性存在差异,CmLOX12和CmLOX13的氨基酸序列同源性最高约为80%,而CmLOX01与CmLOX16之间的同源性仅为14%；系统发育树分析表明,甜瓜LOXs基因家族成员分别隶属于不同的类群,其中Ⅰ类LOX包含CmLOX01-07和CmLOX09,Ⅱ类LOX包含CmLOX08、CmLOX10-16和CmLOX18;根据特异性氧结合位点,发现仅有CmLOX07和CmLOX09具备9-LOX催化活性,而其余的除CmLOX17外均具备13-LOX催化活性。2.本试验通过半定量PCR技术(SqPCR)和实时荧光定量PCR技术(Qpcr),以薄皮甜瓜根、茎、幼叶、花、生长发育各个阶段的果实(花后5d至花后40d,每间隔5d,取一次样)、种子为试验材料,对甜瓜CmLOXs成员在长发育过程中的基因表达时空差异性进行了研究。甜瓜18个LOX基因家族成员中,其中17个家族成员广泛分布于不同的组织器官中,而CmLOX07在任何一个组织器官中均检测不到转录信号；CmLOX03、 CmLOX05和CmLOX06具有相同的组织表达模式,这3个基因家族成员在除幼叶外的器官中均存在；CmLOX09和CmLOX18在除雌花外的所有组织器官中均可以检测到转录信号；CmLOX15在营养器官中不表达,仅在生殖器官中表达；CmLOX11、 CmLOX12、CmLOX14、CmLOX16和CmLOX17在茎中均检测到转录信号,CmLOX12在雌花和雄花中均不表达,而CmLOX14和CmLOX17在幼叶中均不表达；CmLOX01、 CmLOX03和CmLOX18在果实生长发育各个时期表达水平相对稳定,在果实逐渐成熟过程中,基因表达水平逐渐增加；CmLOX06在花后5d到10d果实生长发育前期增加的水平相对缓慢;然而,《CmLOX02、CmLOX04、CmLOX08、CmLOX09、CmLOX10、 CmLOX11、CmLOX13、CmLOX14、CmLOX15和CmLOX16均在花后5d达到一个相对较高的水平,而随后下降。这些结果暗示了LOX基因家族在甜瓜不同器官及果实生长发育过程中起着关键作用,且存在成员之间的功能差异。3.为了研究不同采后处理对甜瓜脂氧合酶基因家族成员的影响,甜瓜中叁种类型的LOXs基因家族成员(类型1 13-LOXs,类型1 9-LOXs和类型2 13-LOXs)CmLOX03、 CmLXO09和CmLOX18被选为候选基因并进行了克隆。在薄皮甜瓜花后28d采收果实,分别进行外源乙烯、(1-methylcyclopropene) 1-MCP、乙醇和低温处理,研究了采后处理对这叁种不同类型的LOXs基因家族成员的表达调控。结果表明3个基因在甜瓜采后成熟衰老期间具有表达差异：CmLOX03和CmLOX18明显受乙烯的诱导,受1-MCP抑制；乙烯处理并没有影响CmLOX9在贮藏期间的转录水平,CmLOX9不受乙烯和1-MCP调控；乙醇和低温处理同样抑制了对乙烯敏感型LOX基因CmLOX03和CmLOX18成员的表达水平,但是对非乙烯敏感的CmLOX9并没有影响。这些结果表明CmLOX03和CmLOX18可能参与了果实的采后成熟衰老,且存在成员功能差异性,但是关于LOX与乙烯之间的相互调控机制还需进一步研究。4.通过酿酒酵母真核表达系对CmLOX18重组蛋白进行异源表达,并将重组体蛋白进行纯化,测定纯化蛋白的酶学特性；通过高效液相色谱法(HPLC)对CmLOX18重组体蛋白的催化生成产物进行研究,确定CmLOX18蛋白的催化特性；通过聚乙二醇(PEG)介导法,CmLOX18转入拟南芥原生质体中,对CmLOX18进行亚细胞定位。研究表明：在pH 3.0-pH 9.0的缓冲液中,CmLOX18酶最高活性出现在pH 4.5；在20℃-45℃温度范围内检测该酶活性的变化,表明在30℃条件下,CmLOX18催化活性最高；重组蛋白CmLOX18的酶动力学参数,检测发现米氏常数Km值在以亚油酸(linoleic acid, LA)为底物时,显着高于亚麻酸(linolenic acid, LeA);两种底物比较,酶促反应最大速度Vmax值,亚油酸约是亚麻酸的4倍,因此,亚油酸是重组蛋白CmLOX18的最适底物；HPLC分析表明,CmLOX18酶促反应产物13S-HPOD,因此确定CmLOX18为13S-LOX类型；亚细胞定位结果表明,CmLOX18定位于植物的非叶绿体细胞器中。5.通过Gateway技术将CmLOX18转入植物超表达载体中,利用农杆菌介导法,将甜瓜CmLOX18转入“中蔬6号”番茄中；利用PCR、Southern blot、western blot以及活体荧光成像仪鉴定T0代转基因植株；通过实时荧光定量技术检测T1代转基因果实中CmLOX18、LeHPL和番茄LOXs基因家族成员的表达水平；利用气质联用仪(GC-MS)对T1代转基因果实挥发性物质含量进行检测。结果表明：T1代转基因果实中,甜瓜CmLOX18转入引起了番茄LeHPL基因表达水平显着高于“中蔬6号”番茄,但是并未引起番茄内源LOX基因家族成员TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD、TomloxE和TomloxF基因表达水平的显着改变；转基因植株果实正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香气物质含量显着高于“中蔬6号”；C5化合物(1-戊醇和1-戊烯-3-酮)在“中蔬6号”和转基因果实中并没有显着差异。这些结果表明,转基因果实中C6挥发性物质的升高,是由于甜瓜CmLOX18导入和LeHPL基因表达水平升高引起的,CmLOX18可能通过hydroperoxide lyase (HPL)分支途径参与C6香气物质的合成。
柯贞进[3]2015年在《谷子萌发过程中贮藏物质变化及赤霉素代谢关键酶基因表达的分析》文中指出为研究不同品种谷子萌发的差异和赤霉素在谷子萌发过程中的作用机理,本研究以晋谷42和晋谷45两个谷子品种为材料,通过对种子萌发过程中可溶性蛋白、碳水化合物等指标的变化测定,以及利用实时荧光定量PCR对GA代谢酶基因的表达模式检测分析,从物质代谢水平和分子水平研究晋谷42和晋谷45萌发的差异。另外用250mg/L赤霉素(GA3)和50mg/L多效唑(PP333)对谷子种子浸种3h处理,研究了GA3、PP333浸种对晋谷42和晋谷45种子萌发过程中贮藏物质代谢以及GA代谢酶基因表达的影响,试验结果表明：1、谷子种子萌发过程中,淀粉含量降低,淀粉酶活性逐渐上升；可溶性蛋白含量呈先降低后增加然后又降低的趋势；可溶性糖是先降低后上升,而还原糖呈逐渐上升趋势。晋谷45在萌发过程中吸水速率大于晋谷42。晋谷45的淀粉含量高于晋谷42,在整个萌发过程中,晋谷42的淀粉酶活性低于晋谷45,而可溶性蛋白高于晋谷45,可溶性糖在萌发的前24h低于45。2、从谷子基因组中筛选和鉴定了编码七种GA代谢酶的26个候选基因,其中CPS、 KS和GA20ox各有4个,KAO与GA3ox各有2个,KO与GA2ox分别有3、7个.它们都单独分布在谷子基因组中；在谷子种子萌发过程中检测到了18个基因的转录物,这些基因在晋谷42和晋谷45萌发过程中的表达模式不同。3、通过系统进化发育分析,推测GA合成代谢途径中SiCPS3、SiCPS4、SiKS4、 SiGA20ox3、SiGA3ox2、SiGA2ox5等基因在谷子萌发过程起着重要的调控作用。根据GA代谢酶基因的表达模式分析,在整个萌发过程中GA合成代谢途径前期的SiCPS3、 SiKS4、SiGA20ox3、SiGA3ox2基因在晋谷45中的相对表达量均高于晋谷42,而SiGA2ox5基因表达水平相反。4、赤霉素浸种促进谷子种子萌发和幼苗伸长,却降低了根冠比；多效唑明显抑制了种子萌发,但显着促进了谷子根系的生长,提高了根冠比；GA对晋谷42的萌发的促进作用明显大于晋谷45,而PP333对晋谷45的作用效果明显大于晋谷42。5、赤霉素浸种能够明显促进谷子种子在萌发过程中对贮藏物质的利用,经GA3浸种处理后,谷子种子的淀粉酶活性增加,对淀粉的利用也加强,可溶性蛋白和还原糖含量也增加；而经PP333浸种后,抑制了谷子种子淀粉酶活性,从而降低对淀粉的利用,同时也降低了可溶性蛋白和还原糖含量,但可溶性糖含量有所积累。6、种子经PP333处理后,SiKS4、SiGA3ox2等基因的表达下调,SiGA20ox4等基因的表达量增加；外源GA3抑制了KO2、SiKS4、SiGA20ox4等基因的表达,而提高了SiCPS2、SiGA20ox3、SiGA2ox5、SiGA2ox6等基因表达水平。另外,这些GA代谢酶基因的表达水平变化在晋谷42和晋谷45中不同。
肖友伦[4]2007年在《水稻黄单胞菌感知的水稻信号分子的分离及hcm1转基因烟草的研究》文中研究表明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas_oryzae pv._oryzicola,Xooc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas_oryzae,Xo)种下的两个致病变种,分别引起的水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)在生产上造成较大危害。Xoo和Xooc均拥有决定在非寄主植物上激发过敏反应和在寄主植物上产生致病性的hrp(hypersensitiveresponse on nonhost plants and pathogenicity on host plants)基因簇。通过改良Xcv(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)hrp基因的诱导培养基XVM2,本实验室获得了适合Xoo与Xooc hrp基因诱导表达的基本培养基XOM3。用N6液体培养基振荡培养,本研究有效建立起水稻的悬浮细胞系。为研究hrp基因的功能,本研究将Xooc的hrpX和hpal基因启动子与绿色荧光蛋白基因gfp(green fluorescenceprotein)构建为融合基因。荧光显微检测表明,Xo的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达;与水稻悬浮细胞、水稻愈伤细胞互作,Xo的hrp基因被高效诱导表达。这些结果表明,Xo的hrp基因是诱导表达的,本研究已成功建立起Xo的hrp基因诱导表达系统。Xo hrp诱导表达系统的建立为研究hrp基因的功能,发掘T3SS(typeⅢsecretion system)效应分子以及开展Xoo和Xooc致病性比较遗传学研究奠定了基础。为研究不同遗传背景下Xooc hpal和hrpX基因的表达情况,本研究将hrpX::gfp、hpal::gfp融合基因导入Xooc的hrpX、hpal、hrpF、hrcV突变体中。绿色荧光蛋白表达揭示,在诱导表达条件下,hpal、hrpF、hrcV基因突变体中hpal和hrpX基因的表达水平与野生型相当,表明hpal、hrpF、hrcV基因突变不影响hpal和hrpX基因的表达;而在诱导表达条件下hrpX突变体中,hpal基因不能被诱导表达,hrpX基因仍能维持野生型背景下的表达水平,表明hpal基因的表达受HrpX蛋白的调控,hrpX基因的表达不受自身的调控,在hrpX基因的上游还存在别的调控因子。为研究Xooc的Harpin和Avr蛋白的泌出特性,本研究构建了harpin::gfp、avr/pth13::gfp的融合蛋白基因,使其在诱导条件下表达。荧光显微检测结果表明,与水稻细胞共培养16h导入融合蛋白基因的RS105菌株在诱导条件下菌体不发荧光,且也没有观察到水稻细胞部位有荧光;导入融合蛋白基因的RS105菌株hrcV基因突变体在诱导条件下菌体可见荧光,与水稻悬浮细胞互作也未见水稻细胞部位有荧光,揭示Harpin::GFP、Avr/pth13::GFP融合蛋白通过T3SS才能泌出至水稻细胞中。由于GFP的瞬时表达特性,在荧光激发光下难以观察到水稻细胞部位有融合蛋白结合。以Xooc的RS105/pXG为供试菌株,本研究试图从水稻悬浮细胞中分离能诱导hrp基因表达的水稻信号分子。RS105/pXG与水稻悬浮细胞互作16h,在悬浮培养液中游离的菌体hrp基因也能被诱导表达。根据这一结果,本研究在RS105与水稻悬浮细胞互作16h后的共培养液的基础上获得了RCM2,荧光检测发现RCM2能诱导,hrpX基因的表达,表明其中含有能诱导hrp基因表达的信号分子。通过超滤离心,发现诱导信号分子存在于分子量小于5000D的溶液中。紫外-可见光(190nm-780nm)扫描结果表明,RCM2最大吸收峰在190-238nm处,在360-780nm处基本没有吸收。进一步的研究发现,诱导信号分子是亲水性的物质,不能被乙酸乙酯、氯仿、等萃取,也不能被80%甲醇、乙醇沉淀,对蛋白酶K不敏感,100℃20min信号分子不会失活。薄层层析结果揭示,RCM1与RCM2中主要物质成分均为为糖类,两者比较主要是所含糖类的种类和含量不同。Harpin_(Xooc)蛋白可在植物上激发HR(hypersensitive response)与诱导产生多种有益表型,如抗病、抗虫、抗旱以及促进植物生长等,但它没有直接的杀菌活性。将Harpin_(xooc)和Cecropin以及Melittin的活性结构域通过polylinker与自由环进行分子组合,重组表达后的Hcm1(Hpal-Cecropin-Melittin)融合蛋白在植物上可激发过敏反应和诱导产生SAR(system acquired resistance),对革兰氏阴性植物病原细菌和植物病原真菌具有杀菌功能。为研究Hcm1蛋白在植物体内表达后是否也能赋予植物产生SAR,本研究通过土壤杆菌介导法将含hcm1基因的pBI121重组载体导入基因工程模式植物烟草中。在含Km(100mg/L)的MS固体培养基上筛选到具有抗性的烟草转化植株,初步认为是转化成功的植株。PCR和Southern杂交证明融合基因已经整合到植物染色体上,RT-PCR结果证明转化成功的植株中hcm1基因能够正常转录表达。Hcm1融合蛋白含有Hpa1蛋白完整的功能域,能在植物上激发HR反应和诱导植物产生SAR,本研究通过RT-PCR检测植物防卫反应途径与HR反应标志基因的转录表达情况。结果表明,Hcm1融合蛋白在烟草中表达后,HR反应标志基因hin1与hsr203j的转录被激活,植物防卫反应途径下游PRla基因的表达也被激活,而相应转空载体的植株检测不到这些基因的转录表达。TMV抗性测定结果表明,表达Hcm1融合蛋白的烟草对TMV的抗性显着增强;喷雾接种烟草野火病菌,结果发现转基因烟草的病斑数明显较转空载体植株少。这些结果表明Hcm1蛋白通过激活植物抗病反应途径赋予了转基因烟草广谱的抗病活性。
高慧杰[5]2015年在《PA-X基因影响A型流感病毒致病性的分子机制》文中研究说明近年来,流感病毒感染性与致病性的改变给公共卫生安全造成了越来越严重的威胁。因此,流感病毒的毒力因子及致病机制研究对于流感的防控及抗病毒药物的研制至关重要。最近研究发现流感病毒片段3不仅编码PA蛋白,还编码一种新型蛋白"PA-X"。PA-X是一种融合蛋白,其N-末端的191个氨基酸由PA开放阅读框编码,而C末端氨基酸由+1核糖体移码而产生的开放阅读框编码。之前对PA-X的功能研究仅局限于1918H1N1历史上流行的具有特殊性的病毒株。PA-X在当前流行的流感病毒毒株,包括2009大流行H1N1人群流行毒株以及H5亚型禽流感病毒中的功能及其作用机制需要进一步阐明。为了了解PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能及其作用机制,我们利用定点突变技术及反向遗传操作技术构建了pHIN1和H5N1PA-X缺失病毒,通过比较分析pHINl和H5N1亲本病毒及其对应的PA-X缺失病毒在体外细胞系及小鼠模型中的复制力及致病性,来探究PA-X基因在pH1N1和H5N1病毒中的作用。为了进一步揭示PA-X影响病毒致病性的机制,本研究评价了PA-X缺失后病毒的聚合酶活性、PA蛋白的表达水平以及PA蛋白的功能变化包括PA蛋白的核蓄积能力及PA蛋白抑制基因合成能力等。研究结果表明：(1)PA-X缺失增强了pH1N1和H5N1病毒在A549细胞中的复制水平及诱导A549细胞的凋亡水平。(2)小鼠实验表明PA-X缺失显着增强了pH1N1和H5N1病毒的致病性,这与PA-X缺失病毒在小鼠肺脏中的高水平复制和诱导产生高表达的炎性细胞因子有关。(3)进一步研究发现：PA-X缺失可能是通过提高pH1N1和H5N1病毒PA蛋白的表达水平,增强病毒的聚合酶活性,从而增强病毒的复制力及致病性。(4)PA-X缺失还影响PA蛋白功能。在pHlNl和H5N1病毒背景下,PA-X缺失的PA蛋白核蓄积能力明显增强,然而其抑制共转染基因的能力发生了显着性下降,表明PA-X在抑制宿主蛋白合成中起到重要的作用。PA-X基因遗传进化分析表明,流感病毒根据PA-X的X-ORF长度可分为两组：表达全长PA-X的病毒(X-ORF是61个氨基酸,全长252个氨基酸)和表达截短PA-X的病毒(X-ORF是41个氨基酸,全长232个氨基酸)。全长和截短的PA-X相差ORF C末端233-252位的20个氨基酸。所有的禽流感病毒包括H5N1和H9N2病毒均表达全长的PA-X蛋白,而以pHlNl病毒为代表表达截短的PA-X蛋白。然而,这两种形式的PA-X蛋白在流感病毒中的功能是否相同仍不得而知。为了确定这两种形式的PA-X在流感病毒中的功能是否存在差异,我们以pHIN1、H5N1和H9N2病毒为现流行于人群和禽群中的代表毒株探究了PA-X基因C末端20个氨基端对流感病毒复制力及致病性的影响。本研究通过延长pH1N1病毒的PA-X以及截短H5N1和H9N2病毒的PA-X,并评价PA-X延长或截短后病毒体内外生物学特性的变化,以揭示PA-X蛋白C末端233-252位的20个氨基酸在流感病毒中的作用。研究结果表明：(1)在这叁株病毒背景下,表达全长PA-X的病毒与表达截短PA-X的病毒相比能够在人肺脏细胞系中更好的复制和诱导更高的细胞凋亡水平。(2)小鼠实验表明表达全长PA-X的pHIN1、H5N1和H9N2病毒对小鼠致病性显着强于其对应的PA-X截短病毒。表达全长PA-X的病毒较PA-X截短病毒在小鼠肺脏中的高病毒滴度和诱导的高表达的炎性细胞因子可能是其致病性增强的关键因素。(3)进一步实验证明：PA-X延长或截短虽不影响PA蛋白的表达水平,但是表达全长PA-X的PA质粒较PA-X截短的PA质粒能够更有效地抑制外源蛋白的表达。而且,体外共转染pEGFP和只表达C末端20个氨基酸的质粒试验直接验证了PA-X基因C末端233-252位氨基酸具有强烈地抑制蛋白合成的能力。这一结果暗示：表达全长PA-X的病毒能够更有效的抑制宿主蛋白的合成,有利于病毒本身的复制及传播,这可能与其致病性增强密切相关。上述研究结果表明PA-X基因C末端233-252位氨基酸是A型流感病毒的重要毒力调控因子。综上所述,研究表明PA-X缺失可能通过上调PA蛋白的表达水平来增强病毒的聚合酶活性,从而有利于病毒本身的复制：PA-X缺失病毒诱导的细胞凋亡水平上调及宿主炎症反应增强可能是其致病性增强的关键因素。PA-X蛋白C末端20个氨基酸能够强烈抑制共转染基因的表达,这可能会增强全长PA-X蛋白抑制宿主蛋白合成的能力,从而增强病毒体内外的复制力及致病性。本研究解析了PA-X基因在调控目前流行流感病毒致病性及致病机制中的作用,并揭示了不同形式的PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能差异,为阐明流感病毒致病性的分子机制奠定了重要的理论基础。
申晓贺[6]2016年在《HBV病毒x蛋白诱导的肝细胞内miRNA表达谱变化对肝细胞癌发展的影响》文中指出肝细胞癌(Hepatocllucler carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,乙型肝炎病毒HBV持续性感染与HCC的发生发展密切相关。HBV病毒X基因(Hepatitis B virus X gene,HBX)编码的乙肝病毒x蛋白(Hepatitis B virus x protein,HBx)是病毒在感染细胞内复制,以及HBV病毒诱导HCC发生发展过程中的重要影响因子。近年来,微小RNA(micro RNA,mi RNA)在HBV诱导的HCC病理进程中的关键作用逐渐受到重视,但是,关于HBx蛋白影响肝细胞内mi RNA表达谱变化,以及系统的对这些mi RNA可能参与的HBV致病过程进行生物信息学分析尚未报道。本研究目的通过构建稳定表达HBV病毒X基因编码蛋白的人肝细胞系,研究HBV病毒X蛋白对肝细胞内mi RNA整体表达水平的影响,并对HBx诱导的mi RNA调控的生物学过程或细胞通路进行系统分析。第一部分HBX稳定表达细胞系的构建及验证目的:通过构建慢病毒载体Lenti-HBX,转染人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2细胞,构建稳定表达HBx蛋白的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞。方法:1.根据Gen Bank数据库中HBV病毒X基因序列设计克隆引物,进行HBX基因克隆,将扩增后的HBX基因序列通过TOPO克隆反应整合至p ENTR/D-TOPO质粒,通过LR重组反应构建慢病毒表达载体p Lenti6.3-HBX,然后与包装质粒体系共转染293T细胞进行慢病毒包装。2.将人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2铺在24孔板中,待细胞完全贴壁并且生长至70%-80%孔底面积时进行慢病毒转染,转染24h后,筛选阳性转染细胞,并进行传代培养。3.利用实时定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和免疫组化(IHC)两种方法鉴定转染HBX基因的人肝细胞系内HBx的表达。结果:1.成功构建了慢病毒表达质粒p Lenti6.3-HBX,质粒测序验证了p Lenti6.3-HBX质粒中的HBX基因序列与Gen Bank提供的序列完全一致。将p Lenti6.3-HBX质粒和空白质粒p Lenti6.3-Control分别与包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装,分离纯化并测定了慢病毒Lenti-HBX和Lenti-Control的滴度。2.用包装了空白质粒的慢病毒载体Lenti-Control与慢病毒载体Lenti-HBX分别转染人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2,使用1ug/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选出阳性转染细胞L02-Control、L02-HBx、Hep G2-Control和Hep G2-HBx,进行传代培养。3.RT-PCR结果证明,相对于阴性对照细胞L02-Control和Hep G2-Control,转染Lenti-HBX的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞内,HBx的m RNA水平显着升高6000倍左右,另外,细胞爬片免疫组化(IHC)结果同样证明了HBx蛋白在L02-HBx和Hep G2-HBx细胞内显着表达,而在阴性对照细胞L02-Control和Hep G2-Control内不表达。结论:成功构建了稳定表达HBx蛋白的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞系,RT-PCR和细胞爬片免疫组化验证了细胞系内HBX基因的表达。第二部分生物信息学分析HBx蛋白诱导的异常表达的mi RNA目的:通过mi RNA芯片分析,筛选出由HBx蛋白诱导的表达变化差异明显的mi RNA,并对mi RNA及其靶基因参与的细胞生物学过程进行GO和KEGG pathway分析,预测这些mi RNA参与的可能与HBV诱导HCC发生相关的通路。方法:1.采用Trizol法抽提HBX稳定表达的人肝细胞系和转染空白质粒的阴性对照细胞系的总RNA,委托上海康成生物工程有限公司进行mi RNA芯片分析。2.利用mi Randa、Microcosom和Target Scan叁种mi RNA靶基因预测程序,预测芯片分析结果中mi RNA的靶基因,并对mi RNA及其靶基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析。3.利用RT-PCR,在转染HBX基因的细胞系和感染HBV阳性的肝癌组织中,进一步鉴定芯片分析结果中mi RNA-211、mi RNA-219和mi RNA-663a的表达,以及上述叁种mi RNA的靶基因长链乙酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A Synthetase Long-chain family member 3,ACSL3)和YY1转录因子(Yin Yang 1 transciption factor,YY1的表达变化。结果:1.分别抽提L02-Control,L02-HBx,Hep G2-Control和Hep G2-HBx四种细胞系的总RNA,mi RNA芯片分析结果表明,在HBX高表达的L02-HBx和Hep G2-HBx两种细胞系中,共有19个mi RNA的表达水平发生了2倍以上显着变化。2.利用mi Randa、Microcosom和Target Scan叁种程序对上述发现的19个mi RNA的靶基因进行预测,分别预测到38187、9684和5459个靶基因,其中有304个最有可能的靶基因在叁种预测程序中都有预测到。通过Gene ontology(GO)分析和KEGG pathway分析,对mi RNA及其靶基因可能参与的生物学过程和功能进行深入探讨,发现mi RNA及其靶基因共同参与细胞的代谢、生物合成、信号转导调控等生理过程,并与多种人类癌症发生过程密切相关,而且,我们发现HBx诱导的mi RNA-211、mi RNA-219和mi RNA-663a参与乙型肝炎的发生过程。3.RT-PCR结果表明,在表达HBx蛋白的Hep G2-HBx细胞系和HCC癌组织中,mi RNA-211和mi RNA-219表达下降,mi RNA-663a表达上升,这与芯片结果一致,另外,mi RNA-663a的靶基因ACSL3表达下调,而mi RNA-211和mi RNA-219的靶基因YY1表达上升。结论:1.我们首次通过mi RNA芯片高通量分析,在mi RNA表达谱水平证实了HBx蛋白能够诱导人肝细胞内多种mi RNA的表达变化。2.通过GO分析、KEGG pathway生物信息学分析,我们发现HBx诱导的mi RNA主要参与细胞代谢、信号转导以及多种人类癌症的发生。在HBV感染引起的肝细胞癌中,HBx蛋白可能通过诱导肝细胞内多种mi RNA表达改变,共同作用于一种或几种细胞通路,促进HBV感染引起的HCC的发生发展。
佚名[7]2004年在《肿瘤流行病学与肿瘤病因学》文中进行了进一步梳理肿瘤高发人群上消化道肿瘤筛查方法的应用与体会贺立绩黄瑞德山西省阳城县肿瘤防治办公室,山西阳城,048100 摘要目的:肿瘤筛查是癌症“叁早”的唯一途径,应用胃液隐血技术隐血珠+胃镜+活检的筛查方法在肿瘤高发人群中对30岁以上的居民进行了叁级筛查,以期降低人群晚期肿瘤发生率及死亡率,提高患者生存率。方法:1、全县30岁以上人群均为筛查对象;2、《防癌自查隐血试剂盒》即隐血珠为筛查药具;3、筛查方法采用一级隐血珠初筛,二级电子胃镜检查,叁级病理确诊的.“叁级法”。结果:1、隐血珠人群筛查,
陈红英, 陈治新, 王小众[8]2013年在《HBV X基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达》文中研究说明目的研究乙型肝炎病毒X(HBV X)基因在肝细胞HL-7702中的稳定表达对其细胞凋亡和表达HSP70的影响,并探讨二者之间的关联。方法将已构建好的HBV X基因真核表达载体pcDNA3-X转染人肝细胞HL-7702,48h后经G418筛选出稳定表达HBV X基因的肝细胞株(L02/HBx)。RT-PCR、蛋白印迹实验鉴定L02/HBx细胞HBV X基因的稳定表达。以转染空质粒肝细胞(L02/pcDNA3)为对照,运用流式细胞分析、TUNEL分析和DNA ladder观察检测L02/HBx细胞凋亡情况。基因芯片技术筛查L02/HBx和L02/pcDNA3两组肝细胞差异表达的凋亡相关基因,并运用蛋白印迹实验技术对差异表达的HSP70基因进行蛋白水平验证。结果 RT-PCR和蛋白印迹实验显示,L02/HBx细胞中有HBV X基因mRNA和蛋白的表达。流式细胞和TUNEL分析显示,L02/HBx细胞组的凋亡率显着高于对照组L02/pcDNA3,DNA ladder可观测到L02/HBx的凋亡现象,而对照组未观测到。两次基因芯片结果筛查出L02/HBx细胞组与对照组差异表达基因HSP70,蛋白印迹实验进一步证实HSP70在L02/HBx细胞中的蛋白表达显着高于未表达X基因的肝细胞组。结论 HBV X基因在肝细胞HL-7702中的表达促进了肝细胞的凋亡,上调了肝细胞中HSP70基因的表达,从而在乙型肝炎病毒致肝细胞癌变的过程中起重要作用。
林静, 朱明华, 曲建慧, 李芳梅, 倪灿荣[9]2004年在《乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21~(WAF1)表达的影响》文中研究指明背景与目的研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒X基因(HBx)对p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚。本研究的目的是探讨HBx对p53下游基因p21WAF1的影响。方法通过正、反义野生型p53(wtp53)与HBx单转染及共转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,以及HBx转染不同内源性p53状态的肝癌细胞株,检测p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化,Westernblot法比较p53、p21WAF1表达水平的变化。结果正、反义wtp53与HBx单转染及共转染SMMC-7721细胞,HBx与正义wtp53共转染组(1.007±0.098)与单转染正义wtp53(0.490±0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P<0.05),其余各组HBx均可导致p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P<0.05)。Westernblot法表明HBx可导致p53的表达增加,但p53表达较低的SMMC-7721细胞转染HBx后p21WAF1蛋白的表达减弱,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053±0.010)也较对照组(0.094±0.013)明显减少(P<0.05),而p53表达较强的HepG2细胞转染HBx后p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252±0.052)较对照组明显升高(0.767±0.031)(P<0.05)。细胞周期结果表明瞬时转染HBx的SMMC-7721和Hep3B细胞停滞在G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%
孙云[10]2009年在《茶叶抗坏血酸过氧化物酶（APX）的生理学与分子生物学研究》文中研究指明抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，又是维生素C代谢的主要酶类。茶叶中富含维生素C，作为茶叶中重要活性营养成分，维生素C在茶叶加工和储存过程中易造成大量损失。开展茶叶中维生素C代谢相关基因的研究，将有助于了解茶叶中维生素C代谢的机制，为调控茶叶维生素C水平提供理论依据。本研究以茶叶(Camellia sinensis)为供试材料，研究了茶叶抗坏血酸过氧化物酶的生理特性及分子机理。通过对茶叶APX活性测定条件的探讨和建立，研究茶树不同品种、茶叶新梢不同生育时期、茶叶加工过程APX活性、同工酶的动态变化以及及维生素C含量的变化特点，探讨茶叶APX的代谢生理和作用机制；克隆了茶叶cAPX基因，并利用生物信息学方法对它的结构和功能进行预测和分析；在此基础上应用荧光定量PCR技术分析了茶叶cAPX基因的定量表达。研究结果如下：1．茶叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定方法建立探讨了茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件。结果表明，茶叶APX测定的最佳条件为，聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1．5倍，酶提取液pH为7．8，反应液pH为7．0，抗坏血酸(AsA)浓度为0．50 mmol／L时茶树鲜叶APX活性最高。试验样品APX活性随冷冻贮藏天数增加，不断降低，样品应可能保持芽叶的新鲜度。2．不同茶树品种、新梢不同生育时期APX酶活性研究选择福建代表性的绿茶品种(福鼎大白茶、福云6号)和乌龙茶品种(铁观音、毛蟹、黄旦、本山、肉桂)，分析了不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位APX活性的变化。结果表明，福建主要7个茶树品种以福云6号的APX活性最高，铁观音的APX活性最低，绿茶品种的APX活性高于乌龙茶品种，不同品种APX活性大小依次为福云6号＞福鼎大白茶＞肉桂＞毛蟹＞黄旦＞本山＞铁观音；茶树鲜叶不同叶位APX活性变化趋势为：芽＞第一叶＞第二叶＞第叁叶＞老叶＞嫩茎，随着鲜叶成熟度增加，APX活性下降。3．茶叶加工过程中APX活性及维生素C动态变化研究探讨茶叶不同萎凋程度及乌龙茶加工过程APX和维生素C的动态变化。结果表明，茶叶萎凋过程中APX活性呈“下降—上升—下降”趋势，相对活性由100％降至1．7％，萎凋不同阶段APX活性差异显着；萎凋过程中茶叶维生素C含量呈缓慢减少趋势，维生素C保留在鲜叶的80％以上，只经过萎凋的茶类(传统白茶)维生素C保留较为丰富。乌龙茶加工过程APX活性也呈“下降—上升—下降”趋势，相对活性由100％降至17．45％，炒青前各工序茶叶的APX活性差异显着，炒青后各工序茶叶的APX活性差异不显着；维生素C含量呈减少趋势，相对保留量由100％降至9．01％，揉捻工序维生素C含量下降幅度最大，其次是摇青工序。4．不同茶树品种及茶叶加工过程中APX同工酶的研究运用同工酶技术分析福建代表性绿茶、乌龙茶品种APX同工酶差异，分析探讨茶叶不同萎凋程度APX同工酶动态变化。结果表明，不同茶树品种APX同工酶存在差异，茶叶APX同工酶共有6条谱带，其中A2、A4、A5和A6四条为不同品种茶树所共有，A4、A5谱带为茶叶APX的重要同工酶。7个不同茶树品种的酶带，福鼎大白茶与毛蟹的酶带最亮最强，铁观音、黄旦与福云6号酶带最弱，除福云6号外，其他品种同工酶的表达量与APX活性存在相关性。茶叶萎凋茶叶APX同工酶谱带数量减少，起主要作用的为A4、A5同工酶也逐渐减弱，但萎凋18 h同工酶谱带强度与数量增加。同工酶的变化与APX酶活性具有相关性。5．茶叶APX的cDNA克隆从茶叶中克隆出了一个长度为1 083 bP的cAPX基因的cDNA序列，经测序分析，其包含750 bP的开放读码框，编码250个氨基酸。该基因在3’RACE与保守区重迭碱基数为321 bp，与5’RACE重迭碱基数是77 bp，非编码区5’有94 bp，3’有136 bp。已将该基因序列登录Genbank，登录号为Eu547804。6．茶叶APX基因的生物信息学分析利用生物信息学的方法对克隆的茶树cAPX基因的核酸序列及对应氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能及系统演化关系等进行预测分析。结果表明，茶叶cAPX是一分子量27．53 kDa，等电点pI 5．59，比较稳定的酸性蛋白，属于亲水性蛋白，不含有跨膜信号，不具有信号肽；茶叶cAPX磷酸化位点有10个，丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点的各4个，苏氨酸(Thr)磷酸化位点2个，蛋白氨基酸序列9-31区域最有可能形成卷曲螺旋结构，α螺旋和不规则卷曲是茶叶cAPX蛋白最大量的结构元件。茶叶cAPX基因参与的生物过程主要是响应化学刺激和应激反应，具有四吡咯结合、过氧化物酶活性和氧化活性分子功能。蛋白的功能预测进一步证实茶叶cAPX属植物抗坏血酸过氧化物酶(Plant ascorbate-peroxidase)的蛋白质家族成员。7．茶叶主要品种及茶叶加工中APX基因的定量表达应用荧光定量PCR的方法对不同茶树品种APX基因的表达以及萎凋工艺过程中APX基因的表达进行定量分析。结果表明，茶树不同品种APX基因表达量存在显着差异，相对表达量变化范围为0．65-5．69，6个茶树品种APX基因相对表达量的大小为毛蟹＞福云6号＞肉桂＞福鼎大白茶＞黄旦＞铁观音。茶叶萎凋过程中APX基因的表达量呈现“升高—降低—再升高—再降低”的趋势，相对表达量变化范围为0．02-7．46，茶叶APX基因的表达明显受到萎凋工艺处理的影响。
参考文献：
[1]. 龙眼胚性培养物胞质型apx基因克隆及其表达研究[D]. 邵巍. 福建农林大学. 2008
[2]. 甜瓜脂氧合酶基因家族成员鉴定、表达调控及CmLOX8在果实香气合成中的作用[D]. 张冲. 沈阳农业大学. 2016
[3]. 谷子萌发过程中贮藏物质变化及赤霉素代谢关键酶基因表达的分析[D]. 柯贞进. 山西农业大学. 2015
[4]. 水稻黄单胞菌感知的水稻信号分子的分离及hcm1转基因烟草的研究[D]. 肖友伦. 南京农业大学. 2007
[5]. PA-X基因影响A型流感病毒致病性的分子机制[D]. 高慧杰. 中国农业大学. 2015
[6]. HBV病毒x蛋白诱导的肝细胞内miRNA表达谱变化对肝细胞癌发展的影响[D]. 申晓贺. 山西医科大学. 2016
[7]. 肿瘤流行病学与肿瘤病因学[C]. 佚名. 第叁届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[8]. HBV X基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达[J]. 陈红英, 陈治新, 王小众. 福建医科大学学报. 2013
[9]. 乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21~(WAF1)表达的影响[J]. 林静, 朱明华, 曲建慧, 李芳梅, 倪灿荣. 癌症. 2004
[10]. 茶叶抗坏血酸过氧化物酶（APX）的生理学与分子生物学研究[D]. 孙云. 福建农林大学. 2009
标签：肿瘤学论文; 肝细胞论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 基因表达论文; 水稻品种论文; 科普论文; bv论文;