杨红玉[1]1995年在《人补体C1抑制物基因在真核细胞中表达的研究》文中进行了进一步梳理补体系统是人体血液系统中的一个非常重要的效应系统。它与纤溶系统，激肽形成系统以及凝血系统一起互相关联，构成了人体防御的一道有效的屏障。在补体系统中，含有许多种蛋白因子，它们环环相扣，一旦第一种成分被激活则会导致下游因子的顺序活化，使信号得以放大而发挥效应。这些补体成分的活性部分都是蛋白裂解酶，称为丝氨酸蛋白酶。它们的调控由相应的特异性丝氨酸蛋白酶抑制物来完成。所有这类抑制物均具有同源性结构和共同的作用方式，被统称为Serpins(丝氨酸蛋白酶抑制物)超家族。人补体C1抑制物就是该超家族的一员。 人补体C1抑制物(C1-Inhibitor，C1 INH)是一种高度糖基化的血浆蛋白。自从1957年被发现以来，已受到人们广泛地研究。尤其是八十年代中期，多个实验室将编码该蛋白的基因克隆成功，为进一步从分子水平研究其功能打下了良好的开端。C1 INH为单一肽链，由478个氨基酸组成。大多数糖基化位点位于N-端，对于糖基的功能仍不清楚，可能与分子本身在体内的代谢有关。其基因组DNA全长17Kb左右，含有8个外显子和7个内含子，由第11号染色体p11.2-q13亚区上的单一基因所编码。编码结构蛋白的cDNA长约1.8Kb。C1 INH基因中含有大量的Alu元件，可能与其易于发生基因重排和缺失有关。 功能分析表明，C1 INH在调节补体活化和激肽形成过程中起非常重要的作用。它是血浆中C1r和C1s的唯一抑制物，此外还负责半数的激肽释放酶和大部分的血浆Ⅻa因子的灭活。因此确定了C1 INH在炎症应答过程中的重要调控作用。 C1 INH的遗传缺陷可引起遗传性血管性水肿(HAE)。这是一
张德庆[2]2011年在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中指出近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸(DNA)疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物(猪、鼠、鸡、鸭)间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪(哺乳动物)C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭(禽类动物)C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28(29).n(n=2、4、6)多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28(29)对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物(猪、鼠)的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物(鸡、鸭)C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物(猪、鼠)和禽类(鸡、鸭)的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物(猪、鼠)与禽类(鸡、鸭)C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28(29)至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28(29).n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28(29).n中p28(29).n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 (29).n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28(29)多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n)。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28(29).n PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).2.4.6)及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28(29).n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28(29)2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体(pcDNA3.1)和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显著(P<0.05),其中以pcDNA3.1-GP5-p28(29).6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28(29).n(n=2,4,6)相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显著(P<0.05)。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显著(P<0.05),与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显著(P<0.01),但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
徐莉[3]2005年在《人补体调节蛋白基因的克隆、共表达及功能研究》文中提出异种器官移植成为解决器官短缺的有效途径正受到越来越多的关注。然而免疫排斥反应,特别是超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)很大程度上制约了它的发展。补体系统激活是异种器官移植超急性排斥反应发生的主要原因,抑制受体的补体系统就可以阻止超急性排斥反应的发生。膜补体调节蛋白衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF),膜辅蛋白(membrane cofactor protein,MCP)和保护素(protectin,CD59)是补体系统中具有明显的同种限制作用的3种补体下调因子,在补体攻击时能提供区分“自我”与“非我”的方式,保护宿主细胞不受同源性补体的伤害,从而延长移植物的存活时间,克服超急性排斥反应的发生,在异种器官移植方面有重大的应用价值。因此人补体调节蛋白(complement regulator proteins,CRPs)是目前异种移植界的研究热点之一。 本研究根据文献报道的衰变加速因子DAF cDNA的序列,设计并合成特异引物,以中国人胚胎mRNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出1684 bpDAF cDNA。序列分析表明,该cDNA含DAF全长编码区,共编码381个氨基酸,没有编码Alu家族的序列,为GPI锚连型DAF。 将DAF全长cDNA序列插入真核表达载体pcDNA3,成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3-DAF,以磷酸钙沉淀法转染NIH/3T3细胞,用G418筛选获得NIH/3T3DAF,PCR实验结果显示DAF基因整合在转化的NIH/3T3细胞的染色体上,RT-PCR和Western印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白DAF在NIH/3T3DAF细胞系中获得表达。检测连续传代30次NIH/3T3DAF结果表明人补体调节蛋白基因DAF仍稳定整合并高效表达,并未随着传代而丢失,以上结果显
陈又南[4]2007年在《家猪凝血相关因子的遗传分子研究》文中研究说明家猪由于资源丰富、成本低廉和在伦理学、种间传播疾病等方面的明显优势已经广泛应用于生物医学研究的各个领域。将猪作为器官供源的猪到人异种移植是缓解目前供器官严重短缺的有效途径，临床器官供求关系的持续紧张和近10年来异种移植研究的快速发展都迫切需要对家猪的基因组、蛋白质组等遗传学问题进行更深入广泛的研究来推动异种移植发展和开拓家猪的医学应用前景。αGT基因敲除猪和人补体调节蛋白转基因猪的培育成功有效解决了异种移植中首先面临的超急性排斥反应，在急性血管性排斥阶段，以微血管血栓为主要表现的凝血紊乱成为又一个导致供器官失功，阻碍异种移植发展的难题。在引起异种移植中凝血紊乱的主要原因中，除了免疫排斥引起的内皮细胞损伤、激活外，另一个重要原因就是猪内皮细胞表面的抗凝分子和人血循环中的凝血因子之间功能不匹配，使抗凝减弱而促凝增强。此外，猪到人肝脏移植后，猪肝脏合成异种凝血、抗凝、纤溶因子能否替代人源蛋白在人体内发挥正常的生理功能，能否与人内皮细胞和外周血中的凝血调节分子相互作用保证机体正常的血流和止血都是异种移植真正走向临床需要解答的问题。对家猪凝血系统的遗传特征和生理功能研究是探索异种移植中凝血紊乱机制和功能匹配问题的前提，也为寻找可能的基因改造途径奠定基础。版纳微型猪近交系(Banna Minipig Inbred line，BMI)是云南农业大学曾养志教授经过20多年连续同胞交配或半同胞交配培育成功的世界唯一的高度近交小型猪种，在生物医学和异种移植研究中都有重要的应用价值。本研究以BMI为研究对象，成功构建了肝脏组织cDNA表达文库。文库鉴定结果显示初级文库的滴度为0.70×10~6pfu，重组率为96.6％，库容量为1.05×10~6pfu；扩增文库的滴度为4.87×10~9，重组率为97.5％。文库随机克隆的插入片段长度平均在1200bp。该文库在复杂度、完整性等方面都达到了后续基因研究的要求。为了解BMI肝脏基因表达谱的特征，我们挑选了200个cDNA文库随机克隆进行单向测序，获得192条有效EST序列。BLAST程序比对结果显示，其中89个克隆的插入序列与数据库中已有的猪基因匹配，包括一些重要的肝脏功能基因，如白蛋白、细胞色素、载脂蛋白等；70个克隆的插入序列与已知猪基因无匹配，但和其他哺乳动物序列有高度同源性，可能为未知的家猪相应基因序列；另33个序列与核酸数据库中基因无匹配，为新发现的家猪EST序列。将得到的EST序列及翻译后的蛋白质序列与人相应序列进行同源比对显示了较高的同源性，但少数基因如carbamoyl-phosphate synthetasel基因、cytochrome c oxidase subunit 1、3、基因和catalase基因没有发现人的同源基因，推测可能是猪进化中特有基因。从序列比对中还发现，在这些EST序列中，22个含有完整的读码框，38个有完整的5’末端序列，140个有完整的3’末端序列。凝血因子(coagulation factor，CF)Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ，抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)和纤溶酶原(plasminogen，PLG)是凝血、抗凝和纤溶系统中的重要因子，目前猪的这些基因序列都还未见报道。我们通过噬菌斑杂交方法和PCR方法筛选BMI肝脏cDNA文库得到插入有目的基因的阳性克隆，再结合5'RACE末端扩增技术，得到BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ的全长cDNA；通过电子克隆方法得到BMI PLG的全长cDNA。测序结果显示，克隆得到BMI CFⅡ全长cDNA 2027bp，CFⅦ1416bp，CFⅩ1856bp，AT-Ⅲ1498bp，PLG 2768bp。以上序列均提交GenBank，获得基因登记号分别为：DQ530370、DQ530371、DQ530372、DQ530373、DQ5303704。在得到克隆的新基因序列后，我们利用生物信息学方法对BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG核酸及蛋白质序列进行了初步分析，通过与人相应序列的同源性比对和蛋白质模拟三维结构的比较，初步分析了猪与人凝血因子的相似性和可能存在的差异。结果显示：和人相应基因比较，BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG的核酸序列同源性分别为83.84％、78.34％、79.81％、87.67％、80.21％；蛋白质序列同源性分别为83％、74.08％、73.10％、89.06％、80.67％；序列比对提示所有的半胱胺酸位点在不同物种间都高度保守；主要催化活性位点在序列和空间位置上也都高度保守；猪和人相应蛋白质的三维结构中，蛋白骨架的空间构相都非常相似。提示这些凝血因子在猪和人之间可能具有相似的生理功能和催化活性，但是在一些特殊位点的序列差异可能造成空间构相和空间位阻的变化，在和底物结合以及其他大分子结合的能力上产生差异。此外，我们还初步探索了BMI CFⅡ基因的体外蛋白表达方法。分别构建了重组CFⅡ的原核表达载体PET22b-cfⅡ、毕赤酵母表达载体pPIC-9K-cfⅡ和真核细胞表达载体pcDNA3.1~+-cfⅡ。在原核表达中目标蛋白主要以包涵体形式诱导表达。在毕赤酵母表达过程中，在筛选得到的His+和Geneticin+重组克隆诱导培养上清中检测到了目标蛋白的存在，但结果提示表达量很小，培养上清用二期法未检测到cfⅡ活性。真核细胞表达过程中，经G418抗性筛选得到了含有pcDNA3.1~+-cfⅡ的重组CHO细胞株。但在重组细胞的培养上清中未检测到目的蛋白的表达。CFⅡ是一种分子量较大的真核蛋白，空间结构复杂，需要经过复杂的翻译后修饰过程，所以体外表达难度较大。建立有效的凝血因子体外表达系统还需更多的实验摸索。综上所述，本研究成功构建了版纳微型猪近交系(BMI)肝脏cDNA表达文库；并初步研究BMI肝脏基因表达谱特征，鉴定得到了多个家猪新基因EST序列；克隆得到了重要的凝血相关因子CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ和PLG的全长cDNA序列；通过生物信息学分析初步比较了BMI凝血因子与人的差异；并对体外表达凝血因子方法进行了初步探索，为今后对家猪凝血相关因子进行功能学研究，探索异种移植中凝血紊乱的分子机制和肝脏功能匹配问题奠定了基础，也为寻找家猪凝血系统的基因改造靶点，提供了分子遗传基础。
马志方[5]2005年在《人α1，2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移及其抗异种移植免疫排斥的研究》文中研究表明第一部分 人HT基因在猪细胞的表达 目的 运用分子生物学和基因工程技术构建含人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因的重组质粒pcDNA3-HTcDNA并在猪细胞表达,合成H抗原,同时降低异种抗原α-Gal的表达。方法 用Hind Ⅲ/Xba Ⅰ双酶切pRc/CMV-HTcDNA和pcDNA3质粒,将切下来的HTcDNA定向连接在pcDNA3质粒,构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,对其进行PCR、多酶切和测序鉴定。建立猪主动脉内皮细胞原代培养、猪髂动脉内皮细胞(PIEC)系和猪肾PK-15细胞系传代培养的方法。采用脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染上述猪细胞,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,用PCR检测重组HT基因的整合,RT-PCR检测重组HT基因mRNA的表达,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原α-Gal的表达。分别以未转染的相应正常猪细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照。结果 重组质粒转染3种猪细胞经筛选均得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,RT-PCR证实人HT基因mRNA在猪细胞表达,FCM检测转染细胞H抗原表达升高,α-Gal表达明显降低。结论 转移的重组人HT基因可以在猪细胞表达,合成H抗原,同时降低异种抗原α-Gal的表达。选用巨细胞病毒(CMV)启动子可以使人HT基因在各种猪细胞广泛表达。 第二部分 转人HT基因猪动脉内皮细胞抗异种移植排斥功能试验 目的 探讨转人HT基因猪动脉内皮细胞抗异种移植排斥反应的作用和机制。方法 1.将转人HT基因的猪动脉内皮细胞和正常内皮细胞分别与20%、40%和60%等不同浓度的人血清孵育2小时,采用非放射性细胞毒性分
李冰[6]2006年在《钝顶螺旋藻/节旋藻藻蓝蛋白的提取纯化及抗肿瘤免疫效应研究》文中研究说明从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。近年来,随着海洋生物药学研究的不断深入,发现许多海洋生物尤其许多藻类,其体内含有各种特有药物功能。其中钝顶螺旋藻(Spirulina platensis,又称钝顶节旋藻Arthrospira platensis)中的藻蓝蛋白(C-phycocyanin, CPC)以其特有的营养和保健价值受到广泛的重视。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点,CPC被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。带有荧光,可用作荧光标记物。另有研究表明藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性,这为螺旋藻在功能性食品和药品领域的开发提供重要的决策依据。目前有关藻蓝蛋白抗肿瘤免疫机理的研究国内外报道较少,本课题研究的主要目的旨在揭示藻蓝蛋白发挥作用的深层机理,以期更深层次的发挥其应用价值。首先对钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法,50%硫酸铵沉淀获得CPC,提取率达到13.1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化,纯度达到4.71%。纯化后的CPC在12% SDS-PAGE中得到两条带,分别是α和β两个亚基,分子量分别为21.4ku和17.0ku。结果表明,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的CPC。然后我们对CPC的抗肿瘤免疫活性进行了研究。主要包括5个方面:①CPC的体外抑瘤作用研究:检测CPC对人宫颈癌细胞(HeLa)、乳腺癌细胞(MCF)、胃癌细胞(NKM)、卵巢癌细胞(SVOA)、人胚肺细胞(HEL)体外生长的影响。在体外培养条件下用不同浓度的CPC(终浓度为20,40,80,160μg/ml)处理这4种癌细胞和1株正常细胞,运用MTT法检测CPC对细胞生长的影响。结果显示CPC对这4种癌细胞均有不同程度的抑制作用,并存在浓度剂量效应,高浓度抑制作用强,但对正常细胞无明显影响。②CPC诱导HeLa细胞凋亡的分子免疫机理探讨:通过流式细胞仪检测CPC对HeLa细胞的细胞周期变化的影响,结果发现出现一个亚二倍体峰(G0/G1);电镜检测细胞的凋亡形态;琼脂糖凝
高卓[7]2014年在《GalTKO.hCD46.hTM转基因猪异种肺移植的初步研究及mfat-1转基因小鼠血清中miRNAs的表达分析》文中提出肺移植术是治疗各种晚期阻塞性、限制性、感染性肺部疾病和肺血管病等终末期肺病的有效方法。随着临床医学的发展以及免疫抑制剂的广泛利用,同种器官移植已获得显著成效。但器官资源缺乏严重阻碍其广泛应用,因而异种器官移植包括异种肺移植受到了高度重视。猪因其器官形状和大小适宜,易进行基因调控和控制病毒传播等因素成为异种移植的理想供体。然而,异种移植虽然可以有效解决器官来源的问题,但却也面临比同种异体移植更为复杂的免疫排斥反应,这一难题成为摆在研究者们面前的第一道屏障。异种移植免疫排斥反应中最先发生的也是需要首先解决的就是超急性免疫排斥反应,会导致移植物出血和血小板血栓形成,从而破坏内皮功能。它的发生是由于人体内预存的异种反应性天然抗体与异种器官血管内皮细胞表面的抗原结合,从而引发的补体系统链式激活所致。被天然抗体识别的异种抗原主要是Gala(1,3)Gal,也称Gal表位,其在α1,3-半乳糖苷转移酶(al,3galactosyltransferase, al,3-GT)作用下合成。因而从理论上我们需要从异种移植物抗原和补体方面考虑克服超急性免疫排斥反应的发生。我们的课题组建立了GalTKO.hCD46.hTM转基因猪模型,这一转基因猪敲除了α1,3-半乳糖苷转移酶基因,并通过进一步人源化修饰,转入人膜辅助调节蛋白(membrane cofactor protein, MCP/CD46)和在凝血机制中发挥重要作用的人血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM),使转基因猪的血管内皮细胞表面表达人源化的补体调节蛋白和血栓调节蛋白,从而抑制补体活化反应和凝血反应,进一步降低异种移植排斥反应。利用GalTKO.hCD46.hTM转基因猪模型,我们采用多种研究手段对异种肺移植进行了有效研究,包括离体肺灌注、检测人源化修饰基因在细胞水平的表达及功能、体外细胞灌流等,以验证这些表型的转入对异种移植肺在移植后抗器官损伤、抗免疫排斥反应以及抗凝血反应方面的作用。在离体肺灌注实验中,我们利用体外循环系统采用肝素化的新鲜人血对GalTKO.hCD46.hTM转基因猪(n=14)、野生型猪(n=16)、Ga1TKO转基因敲除猪(n=16)进行了异种灌注,对12只猪肺进行了自体血液灌注,并监测了灌注过程中的各项生理、血液和生化指标。结果显示,GalTKO.hCD46.hTM的转基因猪肺平均生存期为175分钟(生存期范围：15-240分钟),Ga1TKO猪肺为120分钟(生存期范围：15-240分钟,p=0.24),而野生型猪肺平均灌注存活时间仅为10分钟(p<0.001)。与GalTKO猪相比,GalTKO.hCD46.hTM异种灌注猪肺中的补体激活水平、血小板活化水平显著降低,在240分钟时,ΔC3a：238±22VS572±162, p=0.03; ACD62P:11.9±6VS25.4±7.4, p=0.03。 GalTKO.hCD46.hTM猪肺在抑制凝血级联活化反应和中性粒细胞封存等方面也显示出了明显的优势。此外通过免疫组化结果显示在灌注过程中,肺组织始终有血栓调节蛋白的表达。体外实验结果显示,Ga1TKO.hCD46.hTM的转基因猪的血管内皮细胞具有极高的hCD46及血栓调节蛋白表达率,且针对血栓调节蛋白的功能检测结果也显示,血管内皮细胞表达的血栓调节蛋白可以有效激活蛋白C,其所辅助活化的蛋白C含量是Ga1TKO组的14倍,是阳性对照组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的5.5倍。在体外细胞灌流过程中,Ga1TKO.hCD46.hTM组的内皮细胞发挥了良好的抗凝血功能,与Ga1TKO组相比,使血栓体积降低了84%(P=0.0001),使黏附和聚集率降低了58%和65%(P<0.001)。以上均说明我们对于转基因猪的人源化修饰是有效的,这些表型的转入对移植后抗器官损伤、抗免疫排斥反应以及抗凝血反应均产生了积极的作用。我们将进一步探讨不同表型转入对于异种移植物抗免疫排斥反应的影响,并通过药物干预等合理的方式对其进行进一步修饰与补充。研究证实,机体内多不饱和脂肪酸的含量与构成对癌细胞的分化、增殖和凋亡有着复杂而重要的作用,尤其是n-3多不饱和脂肪酸被认为在细胞的功能和分化中发挥功能,可起到降血脂、舒张血管、抑制过敏与炎症反应、抑癌及预防心血管疾病等作用,但其作用的分子机制尚不明确。microRNA (miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的小分子单链RNA,它由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。miRNA通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域(3'-UTR)互补配对,使目标mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性的针对mRNA分子的切割,从而在转录后水平对靶基因的表达进行调控。自在秀丽隐杆线虫中发现第一个miRNA以来,越来越多的miRNA在其他物种中被发现。保守估计miRNA调控着基因组中30%以上基因的表达。大量研究成果表明,miRNA参与着生物体中包括癌症的发生等基本生命过程的调控,在生命活动中起着非常重要的作用。miRNA在各种组织中的表达失调已经被证实与多种疾病相关,如癌症和糖尿病等。血清中的循环miRNA以其良好的个体间稳定性和重复性,被认为是各种癌症和其他疾病检测的潜在生物标志物。课题组建立了mfat-1转基因小鼠动物模型,特异性的表达来源于秀丽隐杆线虫的fat-1基因,这一基因编码n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,可以n-6多不饱和脂肪酸为底物,将其转换为n-3多不饱和脂肪酸。采用Solexa基因芯片测序的方法,我们分析了野生型小鼠与mfat-1转基因小鼠血清中miRNA的表达谱差异,并通过定量RT-PCR验证确认了12种miRNA在mfat-1转基因小鼠中高表达。针对这12种miRNA所调控的靶基因的进一步分析显示,其靶标基因均为癌症发生发展相关的多种信号通路中的关键基因,包括PI3K, MAPK, mTOR等多条信号通路,揭示了n-3多不饱和脂肪酸对于癌症发生发展的影响。
参考文献：
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[2]. C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学. 2011
[3]. 人补体调节蛋白基因的克隆、共表达及功能研究[D]. 徐莉. 武汉大学. 2005
[4]. 家猪凝血相关因子的遗传分子研究[D]. 陈又南. 四川大学. 2007
[5]. 人α1，2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移及其抗异种移植免疫排斥的研究[D]. 马志方. 天津医科大学. 2005
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