徐平西[1]1999年在《垂体前叶细胞的神经营养功能》文中研究指明自鞠躬等人发现大鼠垂体前叶中存在着大量肽能神经纤维之时，便拉开了对垂体前叶神经支配机制深入探索的序幕。 多年来的努力，在诸多方面取得了令人鼓舞的进展。大量的SP和CGRP在人、猴、狗及大鼠垂体前叶中的存在，说明这种现象在哺乳动物中的普遍性；此类神经末梢与腺细胞的密切接触，尤其是与ACTH和GH免疫阳性细胞间形成突触联系的实验证据，为此类神经纤维分泌运动型定性、参与腺垂体功能的调节以及最终为“哺乳动物垂体前叶神经-体液双重调节假说”的提出提供了坚实的基础。 随后一系列垂体前叶的靶腺体切除—改变体内相关激素水平—引起神经纤维增生的实验观察，不仅揭示了神经纤维消长与垂体前叶功能的联系，还提示不同类型的神经纤维与一定的垂体前叶分泌细胞类型相偶联：去肾上腺导致CGRP能神经纤维增生，去卵巢引起SP能神经纤维的增加。GAP-43免疫阳性神经纤维在去肾上腺后的增加，表明这些神经纤维的增加可以是新的神经纤维的出现。 以前的实验证据暗示着垂体前叶具有神经营养功能，而且这种功能随体内垂体功能状态而变化。神经营养功能的表现是以神经营养因子的作用为基础的。已有文献报道，垂体前叶可表达NGF、BDNF、bFGF和IL6等神经营养因子。综上所述，促使我们得出以下的设想： 垂体前叶具有神经营养功能，它依赖于某些神经营养因子的作用。这些神经营养因子在一定的条件下，从质和量两个方面控制着垂体前叶中神经纤维的消长。垂体前叶中某一类型的腺细胞受控于对应的神经纤维亚群，而后者又接受某一或某些神经营养因子的支持。体内功能状态的改变，通过垂体前叶中特定神经营养因子的变化而改变特定的神经支配状态，最终达到调节特定垂
陈正礼[2]2004年在《雌激素对老龄和去卵巢大鼠脑及垂体ER、NGF和ChAT表达的影响》文中研究指明为了探讨雌激素对脑内ER、NGF和ChAT表达的影响及雌激素的作用形式，运用超敏感的免疫组织化学SP法，以SD大鼠为研究对象，建立老年和去卵巢大鼠模型，通过补充17β－雌二醇对ER、NGF和ChAT在小脑、间脑、端脑及垂体中的表达和分布变化进行研究，探讨雌激素对脑中三种物质的影响及其相互作用机制。另外，还通过在原代培养的神经细胞生长过程中添加17β－雌二醇来研究雌激素对体外培养神经元的生长及神经分泌功能的影响。主要实验结果如下：1. ER、NGF和ChAT免疫阳性反应物分布于小脑的蒲肯野氏细胞层、小脑齿状核、小脑间位核和小脑室顶核，ER阳性产物主要定位于细胞胞浆、胞膜和突起中，也存在于胞核中，表明ER、NGF和ChAT在小脑中发挥了作用，雌激素在小脑发挥作用可能既通过基因组机制，也通过非基因组机制途径。老年大鼠和去卵巢大鼠小脑皮质及小脑核中ER、NGF和ChAT的表达强度及阳性细胞数量总趋势是显著降低，而补充17β－雌二醇后三种阳性产物的强度和阳性细胞数目显著回升，蒲肯野氏细胞的阳性突起长度和数量也呈此变化趋势，表明雌激素可促进NGF和ChAT的表达，在维持和保护小脑神经元的结构和功能中发挥了重要作用；另外ER、NGF和ChAT表达变化的相似性提示三者在雌激素对小脑的作用中是相互调节和影响的。2. ER、NGF和ChAT广泛分布于间脑中，主要分布于缰核、外侧膝状体核、丘脑内侧核、外侧核、丘脑室旁核、带旁核、菱形核、下丘脑室周灰质、室周核、下丘脑腹内侧核、下丘脑前区外侧部和下丘脑后区。另外，还观察到在下丘脑前区和后区有阳性细胞成簇状密集分布的现象。ER阳性产物在细胞中呈多种形式分布，定位于胞浆、胞膜、胞核及突起中，NGF和ChAT主要定位于胞浆和突起中，表明雌激素、NGF和ChAT在间脑中发挥了作用，雌激素对间脑的作用途径是复杂的，有基因组形式，也有非基因组形式。老年大鼠和去卵巢大鼠间脑内ER、NGF和ChAT的表达强度和阳性细胞数目总趋势是显著降低，而补充外源性雌激素可以阻止其下降，表明雌激素可通过ER促进间脑中NGF和ChAT的表达，雌激素对间脑中神经元结构和功能维持是必须的，而且雌激素对间脑神经元的作用与NGF和ChAT的表达是协同和一致的。3. ER、NGF和ChAT在大脑皮质扣带回、顶叶、额叶、梨状皮质和皮质杏仁核，海马齿状回、下托、CA2和CA3区，隔－斜角带区内侧隔核、外侧隔核、斜角带垂直部等均有分布，另外，ER阳性产物在细胞上定位于胞浆、胞核、胞膜和突起中，表明雌激素、NGF和ChAT在端脑中发挥了作用，雌激素可能既通过基因组形式，也通过非基因组形式作用于端脑。老年大鼠和去卵巢大鼠端脑大部分区域内ER、NGF和ChAT的<WP=9>表达活性及阳性细胞数目均显著下降，而补充17β－雌二醇后得到回升，并基本恢复到正常水平，表明雌激素通过ER对端脑内NGF和ChAT的表达有促进作用，这种作用可能部分地与雌激素对NGF的上调而作用于胆碱能神经元有关，也可能是雌激素通过ER直接调控了ChAT的表达，增强神经信息的传递。4. 垂体中广泛分布着ER、NGF和ChAT三种免疫阳性产物，即分布于垂体前叶、中间叶和后叶。细胞定位形式为ER主要分布于细胞浆和细胞膜，有少部分位于细胞核；NGF主要位于细胞浆和细胞膜；ChAT免疫阳性纤维终末包绕于腺细胞周围。揭示ER、NGF和ChAT参与了垂体生理功能发挥的过程。老龄化大鼠和去卵巢大鼠垂体中ER、NGF和ChAT免疫阳性细胞数目和表达强度均显著下降，而补充17β－雌二醇后其数目和强度均恢复到正常水平，且三者分布和强度的变化趋势一致，表明雌激素在垂体结构和功能维持上发挥了重要作用，通过ER促进NGF和ChAT表达而共同调节垂体的生殖内分泌活动。5. 雌激素对体外培养神经元的生长、发育影响显著，可促进胞体生长、突起伸长，但对发出的突起数量影响不大。另外，可延长培养神经元的存活时间，阻止神经元退化、萎缩和死亡。雌激素对体外培养神经元的神经分泌功能影响显著，可显著提高ER、NGF和ChAT阳性神经元的数量并呈现出培养时间依赖性的变化。另外，雌激素还可促进培养神经元ER、NGF和ChAT的表达，也随着培养时间而呈现变化。总的来说，雌激素通过ER可直接或间接的作用于培养神经元，发挥神经营养和调控神经信息传递的作用。
谈寅飞[3]2000年在《β-酪啡肽_7对仔猪胃泌素分泌、垂体细胞和T细胞功能影响的机理研究》文中认为本实验研究了β-酪啡肽_7对仔猪、大、小鼠分泌胃泌素的影响；对仔猪垂体前叶细胞增殖的影响和对仔猪T淋巴细胞功能的影响。一．酪啡肽对胃窦分泌胃泌素的影响1．建立表面灌流（Superfusion）系统，再以该系统研究了β-酪啡肽_7（β-CM_7）对10日龄仔猪胃窦粘膜分泌胃泌素的影响机制和β-酪啡肽_7对不同日龄仔猪胃窦粘膜分泌胃泌素的动态影响。 实验首先建立表面灌流体外培养系统。然后以该系统研究了β-酪啡肽_7对仔猪胃窦分泌胃泌素的影响。实验发现：β-CM_7（2~*10~(-7)、10~(-5)mol/L）能促进10日龄仔猪胃窦粘膜分泌胃泌素，纳洛酮不能阻断该效应。β-酪啡肽_3（2~*10~(-7)mol/L）对胃泌素分泌无影响。β-内啡肽（2~*10~(-8)mol/L）能以不依赖其阿片活性的机制促进胃泌素的分泌。酪蛋白（14g/L）有限酶解物能促进胃窦粘膜分泌胃泌素，纳洛酮亦不能阻断该效应，而酪蛋白对胃窦分泌胃泌素无影响。谷胱甘肽（GSH，2~*10~(-7)mol/L）亦能促进胃泌素的分泌。有/无小牛血清的培养液对胃泌素分泌无影响。β-CM_7等的促胃泌素分泌效应具有失敏现象。β-CM_7（10~(-5)mol/L）对不同日龄仔猪的促胃泌素分泌效应不同，其中对1日龄仔猪胃窦的促进效应最强；在28日龄仔猪，胃窦分泌胃泌素所具的失敏现象延迟产生。2．酪啡肽对原代培养的胃窦粘膜细胞分泌胃泌素的影响。 以细胞培养的方法研究了β-酪啡肽，对仔猪胃窦粘膜细胞分泌激素的影响。实验初步表明：以β-CM_7孵育胃窦粘膜细胞3h、12h，2~*10~(-7)mol/L和10~(-5)mol/L的β-CM_7能通过非阿片机制促进胃窦粘膜细胞分泌胃泌素。3．胃饲酪啡肽对新生大鼠、成年小鼠血浆胃泌素水平的影响及腹腔注射酪啡肽对新生大鼠血浆胃泌素水平的影响。 以胃饲的方法研究了β-酪啡_7对新生大鼠分泌胃泌素的影响，结果表明：β-CM_7能促进禁乳8h的10日龄的SD大鼠分泌胃泌素；对禁乳8h的10日龄的SD大鼠腹腔注射β-CM_7表明：β-CM_7能抑制胃泌素的分泌。胃饲β- 谈寅飞；p－酪啡肽，对仔猪胃泌素分泌、垂体纫胞和T细胞功能影响的机理研究＊M、＊SH均能促进空腹成年小鼠分泌胃泌素，且＊SH效应优于卜＊M：胃饲p（M3对小鼠胃泌素分泌无影响；胃饲卜CM，对进食豆饼后小鼠胃泌素的分泌无影响。二．酪啡肽对原代培养的垂体前叶细胞增殖影响 以细胞培养的方法研究了p－酪啡肽，对仔猪垂体前叶细胞增殖的影响。实验表明：0（M，Qq 勺能促进10R龄仔猪垂体前叶细胞增殖（MTT法人 0（M；门门 能促进不同R龄的仔猪垂体前叶细胞增殖广H1dR掺入法），且对SH龄仟猪促进效应比1、28日龄仔猪明显。三．酪啡肽对10日龄仔猪淋巴细胞转化、不同日龄仔猪淋巴细胞自然分裂的影响及酪啡肽对淋巳细胞C＊＊P水平的影响 以h1dR掺入法研究表明：在不同浓度的 PHA下，B－酪啡肽，（2叫－’。10－’mol几）、酪蛋白水解液和 fi－内啡肽能促进 10日龄仔猪血淋巴细胞转化，纳洛酮不能阻断此效应。卜酪啡肽，对1、SH龄仔猪淋巴细胞自然增殖有促进作用。卜－酪啡肽，对淋巴细胞。AMP水平有促进作用。 实验总体说明：p－酪啡肽，能促进仔猪胃窦粘膜分泌胃泌素，促进垂体细胞增殖，促进血淋巴细胞的自然增殖和 PHA诱导的转化。卜酪啡肽，是哺乳期新生动物食乳后，消化道中产生的主要活性肽，故对于新生动物胃肠道、内分泌和免疫系统的发育有着积极的意义。
何玉琴[4]2004年在《鸡胚腺垂体激素特异性细胞的发生及蛋白转录因子Isl-1对其表达的调控性研究》文中研究说明本文以不同发育时期鸡胚腺垂体为研究对象，采用免疫组织化学技术和免疫荧光标记法，对鸡胚腺垂体激素特异性内分泌细胞和蛋白转录因子Isl-1细胞的个体发生、发育和分布规律以及蛋白转录因子Isl-1与垂体特异性激素细胞类型发育表达的调控关系进行了系统的研究。结果证明：在鸡胚发育过程中，垂体激素特异性内分泌细胞发生的时间和顺序依次为：促黄体生成素（LH?）细胞—第4.5天，糖蛋白激素α亚单位（Common α）细胞—第6.5天，生长激素（GH）细胞—第9.5天，促肾上腺皮质激素（ACTH）细胞、促卵泡剌激素（FSHβ）细胞和促甲状腺激素（TSHβ）—第10.5天，催乳素（PRL）细胞—第14.5天；这些特异性内分泌细胞发生开始时的数目很少，随胚龄增加而明显增加，细胞体积增大，细胞浆增多，细胞着色程度加深，细胞增殖、分化和功能活动在胚胎的中后期最为活跃；各类细胞的平均直径，从大到小依次为：GH细胞，PRL细胞，TSHβ细胞，ACTH细胞和促性腺激素细胞；在胚胎时期，激素阳性细胞率（激素细胞占腺垂体细胞总数的百分比），从多到少，依次为，LHβ细胞（42.77%），Common α细胞（41.82%），PRL细胞（18.85%），GH细胞(18.60%)，FSH细胞（15.35%），ACTH细胞（11.02%）和TSH细胞(10.75%)；激素特异性细胞在发育过程中，ACTH细胞和PRL细胞全部分布于腺垂体前叶，GH细胞全部分布于腺垂体后叶，LHβ细胞和Common α细胞广泛分布于腺垂体的前、后两叶，FSHβ细胞分布于前、后叶，后叶细胞数明显多于前叶，TSHβ细胞主要分布于腺垂体前叶的外侧缘，明显可见有少量细胞分布于后叶背侧缘。TSHβ细胞的特殊分布突破了前人关于TSHβ细胞仅仅分布于腺垂体前叶的研究结论。鸡胚腺垂体蛋白转录因子Isl-1细胞发生在胚胎发育的早期—第6.5天；Isl-l阳性细胞率，在胚胎发育的第6.5天至第10.5天显著增加（P<0.05），第10.5天增加到整个孵化期的最大值，第12.5天至出生，Isl-l阳性细胞率无显著变化（P>0.05），但Isl-1细胞核染色程度逐渐变淡；Isl-1细胞分布于整个腺垂体后叶，前叶阳性细胞数量少。以上研究结果阐明，Isl-1细胞的增殖、分化过程和功能活动主要发生在发育的第10.5天以前，在胚胎早期和中期，Isl-1参与垂体细胞的增殖和分化，在后期，Isl-1参与维持已分化细胞表型和垂体内<WP=8>分泌细胞功能活动； Isl-1细胞在垂体内的分布特点揭示，Isl-1决定垂体细胞的位置发育。为进一步分析Isl-l在发育的胚胎腺垂体细胞中的作用，本研究应用免疫组织化学双染技术对Isl-l在垂体激素特异性细胞类型的表达、分布进行了共存定位研究。研究结果首次证明： Isl-l表达在鸡胚腺垂体LHβ、TSHβ和FSHβ细胞核中，在鸡胚腺垂体的GH细胞、ACTH细胞和PRL细胞内均未见到Isl-l的表达；垂体蛋白Isl-1表达在LHβ、TSHβ和FSHβ细胞的时间和顺序依次为：Isl-l+/ LHβ+双染细胞—第6.5天，Isl-l+/TSHβ+双染细胞—第10.5天，Isl-l+/FSHβ+双染细胞—第14.5天。胚胎发育的第14.5天，Isl－1表达在激素细胞类型的双染细胞率，最多的是Isl-l+/FSHβ+双染细胞（64.30％），其次是Isl-l+/LHβ+双染细胞（63.07％）和Isl-l+/TSHβ+双染细胞（49.82％）；在整个胚胎发育期间，腺垂体后叶的Isl-l+/LHβ+细胞和Isl-l+/FSHβ+细胞数明显多于腺垂体前叶。综上研究阐明：在发育的鸡胚腺垂体中，Isl-l以特定时间和空间的方式表达在LHβ、TSHβ和FSHβ细胞核中，它对鸡胚垂体特异性激素细胞的分化、增殖和表型的维持发挥着重要作用；蛋白转录因子Isl-l在调控这三种垂体激素中是一个重要的调节因子。 Isl-l可能作为分子信号，共同调控垂体的个体发生和LHβ、TSHβ和FSHβ细胞的增殖和分化，并维持着这些已分化激素细胞的表型和正常的分泌功能。
吴雪梅[5]1998年在《垂体催乳素瘤的病因及发病机理的实验研究》文中认为垂体催乳素瘤(Prolactin-producing tumor或prolactinoma，简称PRL瘤)是内分泌系统较常见的疾病之一，且发病人群以青壮年为主，主要表现为闭经、泌乳及巨大瘤体对周围组织(如蝶窦、视神经和下丘脑等)的压迫症状，严重威胁人们的身体健康。遗憾的是，长期以来有关PRL瘤的病因和发病机制尚不完全清楚，以至于临床上对该病的诊断和治疗还存在一些困难。本文通过证明垂体PRL瘤原发于腺垂体的可能性、检测垂体局部自分泌／旁分泌性生长因子在垂体前叶细胞中的表达与作用、及初步探讨垂体PRL瘤形成过程PRL基因高表达的分子机制等三方面的研究，旨在揭示垂体PRL瘤形成的部分机制，从而为最终阐明垂体PRL瘤的病因和发病机理，以及临床诊断与治疗垂体PRL瘤等提供一些理论与实验依据。 第一部分的工作，我们建立了移植另一异体垂体于SD大鼠肾囊内的动物模型(即每只大鼠除具有本身的原位垂体外，肾囊内另移植入一异体垂体，下称垂体异体移植大鼠)，用17-β-雌二醇(estradiol，E_2)处理60d和120d后，经整体、组织学、细胞超微结构等三个水平的形态学观察，以及采用原位杂交方法检测细胞内PRL基因表达等方面的实验研究，证明了垂体PRL瘤原发于腺垂体的可能性；随之在第二部分工作中我们采用垂体前叶细胞原代培养及激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)扫描、分子杂交等方法进一步探讨了垂体局部的某些自分泌／旁分泌性生长因子对垂体前叶细胞增殖活性和PRL基因表达的影响，以及在E_2体内、体外作用期间，PRL基因、转化生长因子α(transforming growth faotor α，TGFα；其功能之一可促进细胞增殖。)和转化生长因子β1(TGFβl；其功能之一可抑制细胞增殖。)基因表达水平的改变；第三部分，我们首先采用PCR-SSCP和DNA测序
季佳佳[6]2011年在《CS_2致男（雄）性下丘脑—垂体—性腺轴功能紊乱机制初探及NO的干预作用》文中进行了进一步梳理二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是一种应用广泛的有机溶剂,主要用于橡胶的硫化、谷物蒸熏、石蜡、石油的精炼以及粘胶纤维的制造等。CS2为多系统毒物,其对神经系统、心血管系统、视觉系统和生殖系统的影响已有报道。CS2对男(雄)性生殖系统的影响主要表现为性功能由亢进到减退,精子数减少,活力下降和畸形精子数增多等。本实验室在前期的动物实验中发现,CS2可引起雄性大鼠血清性激素水平发生改变,导致雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonad axis, HPGA)功能紊乱。性激素的分泌主要受HPGA的调节,通过一系列正反馈及负反馈作用来调节激素的分泌,使外周血激素的水平保持相对稳定,对维持生殖系统脏器发育、生殖功能及第二性征具有重要作用。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一种兼有第二信使、神经递质和效应分子等多种生理功能的生物信号分子,在生物体内发挥着十分重要的作用。NO广泛分布于男性生殖系统的各个器官,对生殖的调节作用具有双重性。研究表明,NO参与了整个HPGA的平衡调节,NO合成的多寡是机体生殖内分泌功能紊乱的重要步骤。本实验室前期研究发现CS2可造成雄性大鼠睾丸组织的氧化损伤,导致睾丸组织中NO含量、总一氧化氮合酶(NOS)活力和诱导型NOS(iNOS)活力下降,因而推测,NO可能在CS2导致的HPGA功能紊乱的过程中发挥重要作用。目前,有关CS2对男(雄)性HPGA影响的研究鲜有报道,其具体的分子调控机制尚不清楚。本项目以CS2为受试物,以HPGA为研究对象,将职业人群调查、整体动物实验和体外细胞培养相结合,探讨CS2对男(雄)性HPGA功能的影响及其机制,并探讨NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside, SNP)和总NOS抑制剂N-甲基-L-精氨酸(NG-Monomethyl-L-arginine,L-NMMA)的干预作用,为进一步阐明NO对生殖内分泌的作用,丰富对CS2致男(雄)性生殖损伤分子机制的认识提供科学依据。第一部分CS2职业接触人群调查研究一、CS2职业暴露对男工性功能和生殖结局的影响目的：探讨CS2对接触男工性功能及生殖结局的影响。方法：对276名CS2暴露男工和126名非CS2暴露男工的基本情况、性功能及其配偶生殖结局进行调查研究。结果：性功能调查结果显示,CS2暴露组男工性生活和谐比例及性生活频度降低,性生活厌恶感增加(P<0.05)；各组间男工妻子妊娠并发症发生率无统计学差异(P>0.05)。生殖结局调查结果表明,混合组(夫妻双方均接触CS2)的自然流产率与单纯组(只有男工接触CS2而其妻子不接触)和对照组比较均具有统计学差异(P<0.05)；混合组与对照组比较,子代低出生体重发生比例增高(P<0.05),子代智力发育及生长发育无统计学差异(P>0.05)。结论：CS2职业暴露可导致男性性功能障碍和不良生殖结局,但对子代的智力和生长发育影响不明显。二、CS2职业暴露对男工血清性激素水平的影响目的：探讨CS2对职业接触男工血清性激素水平的影响。方法：选择工龄、文化程度、生活条件等基本情况相似的CS2暴露男工63名和非CS2暴露男工69名,对其血清GnRH、FSH、LH和T水平进行检测。结果：工龄2～8年的CS2暴露组男工,血清T和LH水平明显高于对照组(P<0.05);工龄8年以上的CS2暴露组男工,血清T、FSH、GnRH水平明显高于对照组,具有统计学差异(P<0.05)。结论：职业接触CS2可导致男性生殖内分泌功能紊乱,血清LH水平首先发生改变,可作为反映CS2生殖损伤的早期指标。第二部分CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴超微病理结构的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴超微病理结构的影响及NO的干预作用。方法：36只雄性SD大鼠随机分为6组,以不同浓度CS2(0、50、250、1250 mg/m3)静式吸入染毒,共10周,另设CS2(1250 mg/m3)+SNP(5mg/kg)和CS2(1250 mg/m3)+L-NMMA(2mg/kg)干预组,SNP和L-NMMA从动物染毒结束前10 d开始腹腔注射,1次/d。染毒结束后,采用透射电镜观察大鼠下丘脑、垂体和睾丸组织超微病理结构的改变。结果：CS2染毒可造成下丘脑神经元、垂体促性腺激素细胞、生长激素细胞和睾丸支持细胞线粒体肿胀,内质网扩张,NO供体对CS2引起的下丘脑、垂体、睾丸组织的损伤具有拮抗作用,而NOS抑制剂则进一步导致病变的发生。结论：CS2可造成下丘脑、垂体和睾丸组织超微病理结构的改变,NO在这过程中发挥重要作用。第三部分大鼠下丘脑神经元和垂体前叶细胞体外培养方法的建立一、新生大鼠下丘脑神经元原代培养和鉴定目的：探讨大鼠下丘脑神经元体外培养技术。方法：选用新生SD大鼠,取下丘脑组织进行单细胞原代培养,倒置显微镜下动态观察培养细胞在体外生长的情况,并采用尼氏染色法对体外培养的神经元进行鉴定。结果：培养3d时观察发现下丘脑神经元具有双极突起,突起较短；培养7d时神经元突起长度达到最高峰；尼氏染色可见胞质内有颗粒状的尼氏体,呈深蓝色。结论：本实验室采用的大鼠下丘脑神经元原代培养方法能够为开展神经内分泌的分子生物学研究提供理想的体外实验模型。二、大鼠垂体前叶细胞体外培养和鉴定目的：探讨大鼠垂体前叶细胞体外培养技术。方法：选用成年雄性SD大鼠,取垂体前叶进行单细胞原代培养,倒置显微镜下动态观察培养细胞在体外生长的情况,并采用免疫细胞化学染色技术对垂体前叶细胞LH和FSH分泌细胞进行鉴定。结果：垂体前叶细胞呈圆形,折光性较强,成纤维细胞生长明显,原代培养后期成纤维细胞已为主要细胞。免疫细胞化学染色结果显示,LH和FSH免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色。结论：体外培养的垂体细胞中有多种细胞的生长,反复差速贴壁法能较好的去除成纤维细胞,提高垂体前叶细胞的纯度,但LH和FSH免疫反应阳性细胞比例较低。第四部分CS2致雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱机制的研究一、CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴激素和激素受体mRNA表达水平的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴激素和激素受体mRNA表达水平的影响以及NO的干预作用方法：对体外培养的大鼠垂体前叶细胞进行染毒,共设6个染毒组,分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(2.5、5.0、10.0μmol/ml CS2)、SNP干预组(10.0μmol/ml CS2+20μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(10.0μmol/ml CS2+50μmol/ml L-NMMA),支持细胞的6个染毒组分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(1.25、2.50、5.00μmol/ml CS2)、SNP干预组(5.00μmol/ml CS2+10μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(5.00μmol/ml CS2+25μmol/ml L-NMMA),采用Real-time PCR对垂体前叶细胞中GnRHR mRNA和睾丸支持细胞中FSHR、ABP、INH mRNA表达水平进行检测。结果：垂体前叶细胞中GnRHR mRNA表达水平在10.0μmol/ml CS2染毒时显著降低(P<0.05),NOS抑制剂L-NMMA可拮抗CS2的作用,使GnRHR mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；在睾丸支持细胞中,不同浓度CS2染毒组与对照组比较,ABP和INHαmRNA表达水平没有明显变化(P>0.05),5.0μmol/ml CS2染毒组FSHR和INHpb mRNA表达水平显著降低,INHpa mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；NO供体SNP干预组与5.0μmol/ml CS2染毒组比较,INHa mRNA表达水平显著增高(P<0.05),ABP、FSHR、INHβa和INHβb mRNA表达水平改变均不明显(P>0.05)；NOS抑制剂L-NMMA干预组与5.0μmol/ml CS2染毒组比较,ABP mRNA表达水平显著增高(P<0.05),FSHR、INHα、INHβa和INHβb mRNA表达水平改变均不明显(P>0.05)。结论：CS2可抑制垂体前叶细胞中GnRHR、支持细胞中FSHR和INHβb的表达,通过抑制HPGA中多种激素和激素受体的合成,导致HPGA功能紊乱,CS2对垂体GnRHR的抑制作用与NOS活性有关。二、CS2对大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞内cAMP/cGMP的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞内cAMP/cGMP的影响以及NO的干预作用。方法：对体外培养的大鼠下丘脑神经元和垂体前叶细胞进行染毒,共设6个染毒组,分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(2.5、5.0、10.0μmol/ml CS2)、SNP干预组(10.0μmol/ml CS2+20μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(10.0μmol/ml CS2+50μmol/ml L-NMMA),支持细胞的6个染毒组分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(1.25、2.50、5.00μmol/ml CS2)、SNP干预组(5.00μmol/ml CS2+10μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(5.00μmol/ml CS2+25μmol/ml L-NMMA),采用酶联免疫吸附试验对下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞中cAMP和cGMP水平进行检测。结果：下丘脑神经元中,各染毒组cAMP水平变化不明显(P>0.05),cGMP水平在10.0μmol/ml CS2染毒组显著降低,SNP可拮抗CS2的作用,使cGMP水平显著增高(P<0.05)；垂体前叶细胞中cAMP和cGMP水平不随CS2染毒浓度的增加而发生改变(P>0.05),但L-NMMA干预组与10.0μmol/ml CS2染毒组比较,细胞中cAMP和cGMP水平均显著增高(P<0.05)；睾丸支持细胞中各染毒组cAMP和cGMP水平均无明显改变(P>0.05)。结论：CS2可明显降低大鼠下丘脑神经元中cGMP水平,并能被SNP拮抗,但对垂体和睾丸cAMP和cGMP没有影响,提示CS2可能通过NO-cGMP途径影响下丘脑分泌功能,而CS2对垂体和支持细胞分泌功能的影响则不依赖于cAMP和cGMP。
兰云贤[7]2007年在《GHRP-2对猪GH分泌的作用规律及促生长效果研究》文中研究说明本研究通过系列实验，用GHRP-2处理猪垂体腺细胞和生长猪，揭示GHRP-2促进垂体腺细胞分泌GH的作用特点、GHRP-2同GHRH、SS对垂体腺细胞作用的关系；探索GHRP-2促GH分泌可能的信号途径，以揭示GHRP-2促生长的规律及可能机制；研究GHRP-2对猪生产性能、氮代谢、血液中GH浓度的影响，以探索GHRP-2对猪生产的应用前景，为GHRPs在生产实践中的开发和利用提供理论依据。实验一：GHRP-2对猪腺垂体细胞分泌GH规律的影响研究。共进行三个实验，分离1～3日龄新生仔猪腺垂体细胞，贴壁培养形成单层后，①分别用0、10~(-12)、10~(-11)、10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)Mol浓度的GHRP-2处理垂体细胞2h；②用10~(-6)Mol浓度的GHRP-2处理垂体细胞5min至180min；③用10~(-6)Mol GHRP-2连续依次处理垂体细胞6次，每次1h。处理结束后，收集培养基，测定GH浓度。结果表明：①10~(-12)～10~(-5)Mol浓度的GHRP-2都能作用于体外培养的垂体细胞，刺激垂体细胞分泌GH(P＜0.01)，10~(-12)～10~(-8)Mol浓度之间差异不显著(P＞0.05)，10~(-7)～10~(-5)组极显著高于10~(-12)～10~(-8)Mol(P＜0.01)，GHRP-2适宜浓度为10~(-6)Mol；②GHRP-2能引起GH的快速分泌，在5min就可使GH的分泌达到最大，并与以后时间的处理效应无差异；③在连续处理的前三次，GHRP-2能促进GH的分泌，从第四次开始，GH的分泌出现抑制状态，并随着处理次数的增加抑制状态更强。结论：GHRP-2能够促进垂体细胞分泌GH，其作用效果与处理剂量、时间和次数有关。实验二：GHRP-2对猪腺垂体细胞分泌GH机理的研究。共进行三个实验。分离1～3日龄新生仔猪腺垂体细胞，在培养成单层垂体细胞的培养板中，①分别用GHRP-2、GHRH、SS、GHRP-2+GHRH、SS+GHRP-2、GHRH+SS处理垂体细胞2h；②GHRP-2、GHRH、PMA、PMA+GHRP-2、GHRP-2+GHRH处理垂体细胞2h；③将垂体细胞同10~(-6)M PMA温育24h耗竭胞内的PKC前、后，用GHRP-2、GHRH、GHRP-2+GHRH处理垂体细胞2h。处理结束后，收集培养基，测定GH浓度。结果表明：①GHRP-2和GHRH单独或联合处理猪垂体细胞能显著增加GH的分泌(P＜0.01)，SS能完全抑制GHRH的促GH分泌的效应(P＜0.01)，SS不影响GHRP-2的促GH分泌的效应，GHRP-2+GHRH具有协同促GH分泌的作用；②GHRP-2、GHRH、PMA都能刺激腺垂体细胞分泌GH，其中以GHRP-2的作用最强，GHRH、PMA次之；而GHRP和GHRH与PMA联合作用都能极显著地促进GH的分泌(P＜0.01)；③GHRH促GH分泌的效应不受PMA预处理的影响，而GHRP-2促GH分泌的效应却因PMA的预处理使PKC的耗竭而与对照组相比显著降低(P＜0.01)，GHRP-2和GHRH的联合处理效应与PMA处理前相比也显著降低(P＜0.01)，但预处理组GHRP-2+GHRH仍有协同效应存在。结论：GHRP-2作用于猪的垂体细胞促GH的机制与GHRH不同，GHRP与胞内PKC信号转导途径相关。实验三：GHRP-2对生长猪GH分泌模式的影响研究。选择25kg体重的去势公猪，通过外科手术安装颈静脉插管，将8只猪随机地分为两组，每组4只，一组为对照，一组为处理组，处理组肌肉注射30μgGHRP-2／kgBW，于注射后的0、15、30、45、60、90、120、180min以及6h、9h、12h通过插管采取5ml血样，分离血清，用放免法测定GH含量。结果表明：处理组在30～90min期间血中GH的含量极显著高于对照组(p＜0.01)，并在60min达到分泌高峰，120min后回落到对照组水平。结论：肌肉注射30μg GHRP-2／kgBW能够提高外周血液中的GH浓度，并在30～90min分泌量极显著大于对照组，60min达到峰值。实验四：GHRP-2对生长猪生产性能和氮代谢的影响。选择体重(33±2)kg的DLY猪20头，随机分成4组，每组5头，分别以0、3、9、27μg／kgBW的剂量每日肌肉注射GHRP-2，试验期28d。在试验的第三周进行4d的代谢试验：在第四周末测量活体背膘和眼肌厚度。结果表明：在处理的第一、二周末日增重随着处理剂量的增加而增加，27μg／kgBW组的日增重和饲料转化效率显著高于对照组；连续处理的第三周出现生长抑制现象，第四周又能恢复到对照水平，实验期的采食量处理与对照组间无明显差异。饲料氮在第三周的消化率各组分别为82.92％、81.29％、82.3％、85.15％；代谢率52.59％、51.8％、53.20％、56.67％。GHRP-2处理组有减少背膘和增加眼肌厚度的趋势。结论：生长猪肌肉注射GHRP-2 27μg／kgBW在两周范围内达到提高日增重和降低料重比的作用，第三周出现生长抑制现象；GHRP-2对生长猪生产性能的影响依赖于GHRP-2处理的剂量，时间和频率。体内外试验表明，GHRP-2能促进猪垂体细胞GH的释放，作用效果与处理剂量和频率有关，作用的信号途径与GHRH不同、而与PKC有关。生长猪肌肉注射27μgGHRP-2／kgBW在两周内有明显促进生长、改善饲料利用率的作用。连续多次使用GHRP-2可抑制GH分泌和动物生长，其机制有待进一步研究。
位兰[8]2008年在《育雏期鸵鸟睾丸的发育及硼对其下丘脑—垂体—睾丸轴的影响研究》文中研究指明非洲鸵鸟属鸟纲、鸵形目、鸵鸟科,是世界上现存最大的鸟。与其他鸟类相比非洲鸵鸟有着独特的繁殖特性,即性成熟比较晚,雌鸟2岁到2.5岁达性成熟;而雄鸟2.5岁到3岁才达性成熟。鸵鸟的这种繁殖特性决定了其养殖周期比较长,这对鸵鸟养殖来说是一个很不利的因素。鸵鸟作为一种经济养殖动物,国内外学者对其进行了大量研究,有关鸵鸟组织器官的形态学特点也有报道,但关于雏鸵鸟性腺轴的发育特点以及微量元素硼对其下丘脑-垂体-睾丸轴的影响未见详细报道。本研究以育雏期鸵鸟作为试验动物,分3个试验组和1个对照组,给其饮水中添加不同剂量硼,利用石蜡切片和HE染色技术、透射电镜技术、放射免疫测定、组织化学法、免疫组化定位表达及原位缺口末端标记等多种方法,从亚细胞、组织细胞及激素水平等角度系统研究雏鸵鸟睾丸的发育特点及硼对下丘脑、垂体和睾丸组织结构、血清激素水平、细胞凋亡的影响。主要研究内容和结果包括以下几个方面:1雏鸵鸟睾丸发育的形态学研究本研究以1 d、30 d、45 d和90 d健康非洲雏鸵鸟作为试验动物,通过光镜和电镜样本制作,采用HE染色及TUNEL技术,研究雏鸵鸟睾丸发育的形态学特点。结果显示,雏鸵鸟睾丸的外形与其它物种存在明显差异,睾丸组织结构同其它禽类的一样没有睾丸纵隔和睾丸小隔;精原细胞的胞质内所含细胞器不丰富,精母细胞胞质内富含线粒体、游离核糖体和粗面内质网。1 d雏鸵鸟睾丸内以原始生殖细胞为主,30 d时原始生殖细胞全部分化为精原细胞,45 d时生精小管内已开始出现初级精母细胞,45～90 d内精原细胞分裂增殖速度变化不明显。1-90 d的雏鸵鸟睾丸内均存在细胞凋亡现象,但凋亡程度有所不同,45 d睾丸内发生凋亡的细胞数目最多。表明,雏鸵鸟在生后早期睾丸发育较快,且刚出生时睾丸的组织结构与其他禽类有明显差异。2雏鸵鸟睾丸发育过程中黄体生成素和褪黑素受体的表达研究采用免疫组织化学SABC法对1 d、30 d、45 d和90 d雏鸵鸟睾丸内黄体生成素(LH)和褪黑素受体(MR)的分布进行定位,结果显示:LH阳性细胞胞质或胞膜出现棕黄色,胞核无阳性反应;MR阳性反应颗粒呈棕褐色或棕黄色,可位于胞质、胞膜或胞核,呈散在均一或不均匀分布。LH和MR在雏鸵鸟睾丸内的分布特点均随年龄变化,这两种物质在1 d鸵鸟睾丸内均有分布,但在30 d睾丸内两者均未检测到;LH在90 d鸵鸟睾丸内有分布,但阳性表达较弱,而在此发育阶段仍未检测到MR阳性产物。表明,LH和MR在鸵鸟刚出生时原始生殖细胞分化为精原细胞的过程中和间质细胞分化过程中起着一定的调节作用。3雏鸵鸟发育过程中血清激素水平的年龄性变化采用放射免疫测定法(RIA)检测1d、30d、45d和90d雏鸵鸟血清激素水平,结果如下:雏鸵鸟血清中生殖激素促卵泡素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)和雌二醇(E_2)的水平随其年龄的增长而发生变化,血清中FSH含量先逐渐增加,到45 d时开始下降,90 d时其血清FSH水平甚至低于1 d血清中的水平;LH和T的含量随年龄增大而逐渐增加,基本呈直线增加;E_2的含量在1-45 d之间缓慢降低,45 d后开始迅速降低;且T与E_2的比值在1-45 d之间缓慢减小,45 d后开始迅速增加。结果表明,血清生殖激素水平随年龄发生变化,且45 d前后变化比较大,提示雏鸵鸟在45 d前后的发育可能比较特殊。4雏鸵鸟下丘脑-垂体-睾丸轴的组织学研究采用石蜡切片及HE染色技术对雏鸵鸟下丘脑弓状核(ARC)、视上核(SON)、室旁核(PVN)、视交叉上核(SCN)进行了细胞构筑研究;采用Orange G-AcidFuchsin-Light Green(OFG)染色方法对垂体的组织结构进行了研究,结果显示,垂体前叶的嗜酸性细胞被染成黄色,此类细胞的胞质丰富,核偏于细胞一侧,细胞轮廓清晰;嗜碱性细胞被染成紫红色,细胞界限清晰,一般由若干个细胞呈团状分布;嫌色细胞和间质组织被染成绿色,嫌色细胞界限不清。结果表明,雏鸵鸟下丘脑核团的特征与北京鸭的大体相似,差别在于核团内细胞的大小;OFG染色比HE染色更容易分辨这3类细胞,便于观察垂体前叶细胞的结构特征。5硼对下丘脑-垂体-睾丸轴组织学的影响研究以90 d的雏鸵鸟作为试验动物,随机分为4组:3个试验组和1个对照组,采用HE染色方法及TUNEL技术,研究不同硼水平下下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT)各器官的组织学变化及细胞凋亡特点。结果显示,硼对雏鸵鸟下丘脑、垂体和睾丸的组织结构均有一定的影响,且低硼组(100mg/L)对其HPT轴的发育良好,而中硼组(200mg/L)和高硼组(400mg/L)HPT轴各器官均产生不同程度的病理组织学变化。TUNEL技术检测结果显示,生理状态下HPT轴各器官内均存在细胞凋亡现象,而不同硼水平下雄性雏鸵鸟性腺轴各器官内发生细胞凋亡的程度不同,神经细胞的凋亡数量随硼含量的增加而增加;神经胶质细胞、垂体细胞及睾丸细胞均表现为低硼减少,中硼和高硼显著增加(P＜0.05)。上述结果表明,适量的硼对HPT的发育有起一定的促进作用,而过量硼对机体产生一定的毒性作用,因此,建议给鸵鸟补硼以不超过100mg/L为宜。6不同硼水平下HPT轴内LH和MR的表达研究采用免疫组织化学SABC法研究不同硼水平下LH和MR在90 d雏鸵鸟HPT轴内的分布进行研究。结果如下,雏鸵鸟下丘脑视上核、室旁核和弓状核内以及垂体和睾丸内均有LH阳性产物,其表达量均受硼的影响,表现为低硼表达增强,中硼和高硼减弱。雏鸵鸟下丘脑视上核、室旁核和视交叉上核内有MR分布,而垂体和睾丸内未见MR阳性产物,且硼对MR在下丘脑内的表达有抑制作用。该试验结果表明,不同硼水平下LH和MR在HPT轴的分布和表达存在差异,推测硼可能通过影响LH和MR在HPT轴各器官内的分布的表达来调节雏鸵鸟HPT轴的活动。7硼对雏鸵鸟血清激素水平的影响研究采用RIA法对不同硼水平下雏鸵鸟血清激素水平进行测定,结果显示,不同硼水平对雏鸵鸟血清FSH、LH、T、E_2及T/E_2均有一定的影响,其变化规律存在差异。与对照组比较,低硼组血清LH水平有所提高,但差异不显著,而血清T的水平显著提高(P＜0.05);中硼组和高硼组LH和T的与对照组和低硼组相比均显著降低(P＜0.05),且这两个组之间差异不显著。血清T和LH的变化随硼添加量的改变呈一定的相关性,均表现为低硼升高,中硼和高硼降低。血清FSH和E_2含量均随硼添加量的增加而增加,而T与E_2的比值随硼剂量的增加而减小。以上结果表明,硼对血清生殖激素的水平有一定影响,而激素水平是衡量性腺功能的重要指标,提示硼对雏鸵鸟HPT轴的影响也可能通过改变其激素的分泌活动来实现的。
祝春梅[9]2008年在《大豆异黄酮对大鼠下丘脑—垂体—脾脏ERα、NGF、IL-2、AR表达的影响》文中指出目的:本实验研究了大豆异黄酮(SI)对去卵巢大鼠下丘脑—垂体—脾脏内雌激素受体-alpha(ERα)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素-2(IL-2)、雄激素受体(AR)蛋白和mRNA表达及分布的影响,探讨ERα、NGF、IL-2和AR在下丘脑、垂体、脾脏中表达的意义及大豆异黄酮对下丘脑—垂体—脾脏中四种物质的影响及其相互作用机制。并通过分离肠道内容物来研究大豆异黄酮对肠道菌群的影响。方法:将50只雌性青年大鼠随机分为假手术组和去卵巢组,去卵巢组分别补充高、中、低、对照(溶剂)剂量大豆异黄酮,补充至2周和6周每组各宰杀5只,运用免疫组织化学SABC法和寡核苷酸探针原位组织杂交方法,对大鼠的下丘脑、垂体、脾脏中ERα、NGF、IL-2、AR的表达和分布变化进行研究,并运用活菌计数法对肠道内容物进行初步研究。结果:①ERα、NGF、IL-2、AR蛋白和mRNA分布于下丘脑的弓状核、背内侧核、腹内侧核、室周核和室旁核,表明ERα、NGF、IL-2、AR在下丘脑发挥了广泛的作用,而四种产物主要定位于细胞胞核和突起,少量存在于胞浆和胞膜中,表明内源性雌激素主要通过经典的核受体途径进行基因转录调控,也有部分通过非基因组机制。去卵巢大鼠下丘脑各核团中ERα、NGF、IL-2、AR的表达强度和阳性神经元数目总趋势是显著降低,而补充SI后四种阳性产物的强度和数目均得到不同程度的回升,其中6H(6周高剂量)组基本恢复到假手术组水平,6L(6周低剂量)组仅有少许回升,6M(6周中剂量)组介于两者之间,2周各剂量组中仅在2H(2周高剂量)组有回升,表明SI可提高体内雌激素水平,进而促进NGF、IL-2、AR的表达,在维持和保护下丘脑神经元的结构和功能中发挥了重要作用,而且这种作用存在时间和剂量的依赖性;另外ERα、NGF、IL-2、AR表达变化的相似性提示四者在SI对下丘脑的作用中是相互协调和联系的。②ERα、NGF、IL-2、AR蛋白和mRNA在垂体前叶、中叶和后叶均有分布,且主要定位于胞核,胞膜和胞浆中很少,表明ERα、NGF、IL-2、AR参与了垂体生理功能的发挥。去卵巢大鼠垂体中ERα、NGF、IL-2、AR的表达强度和阳性细胞数目均显著下降,而且6C(6周去卵巢对照)组比2C(2周去卵巢对照)组下降更多。体外补充SI后,垂体ERα、NGF、IL-2、AR的表达强度和阳性细胞数目均有不同程度升高,其中6H组基本恢复至假手术组的水平,而2周各剂量组和6M、6L组仅有部分恢复或无明显变化,且四者分布和强度的变化趋势一致,表明SI在垂体结构和功能维持上发挥了重要作用,且存在时间和剂量的依赖性,也表明SI在垂体中的作用是相互协调和影响的。③脾脏中广泛分布着ERα、NGF、IL-2、AR蛋白,主要分布于被膜下方的红髓区,而在白髓仅有极少量分布,mRNA分布区域与蛋白表达基本一致,仅在量上存在差异,即mRNA较蛋白表达多,表明ERα、NGF、IL-2、AR参与了脾脏免疫调节功能的发挥。去卵巢大鼠脾脏中ERα、NGF、IL-2、AR的表达强度和阳性细胞数目均显著下降,而且随着去除卵巢时间的延长下降更多。体外补充高剂量SI6周后,脾脏ERα、NGF、IL-2、AR的表达强度和阳性细胞数目基本恢复至假手术组的水平,而2周各剂量组和6M、6L组仅有部分恢复或无明显变化,表明SI通过ERα对脾脏内NGF、IL-2、AR的表达有促进作用,且存在时间和剂量的依赖性;而四者分布和强度的变化趋势一致,表明SI在脾脏中的作用是相互协调和联系的。④ERα、NGF、IL-2、AR蛋白和mRNA在下丘脑、垂体、脾脏中的分布区域基本相似,推测它们在下丘脑、垂体、脾脏可能存在共表达区域,且相互影响来调节它们在这三个组织器官中的共表达位点。而且在去卵巢和补充SI的大鼠下丘脑、垂体、脾脏中ERα、NGF、IL-2、AR分布和强度的变化趋势基本一致,表明SI对下丘脑—垂体—脾脏及ERα、NGF、IL-2、AR的作用是相互调节和影响的。⑤SI能够选择性地抑制大肠杆菌的生长,促进乳酸杆菌的生长,表明SI能够调节肠道微生物的微生态平衡。
苏娟[10]2008年在《Orexin在体内外对母猪下丘脑—垂体—性腺轴作用机理的研究》文中指出Orexin是近年发现的一种神经肽,分为orexin A和orexin B。Orexin通过其受体发挥作用,参与摄食、能量稳态、睡眠和觉醒周期、生殖、内脏活动和神经内分泌等多种生理功能的调节。有关orexin参与生殖调控的资料大多数是在鼠上获得的,并且相关研究较少。关于orexin在猪体内的分布定位及其参与猪生殖调控的研究未见报道。因此,本实验以苏种猪为研究对象,采用免疫组织学、荧光双标记并结合激光共聚焦显微镜技术、real time-PCR和放射免疫测定(RIA)等方法研究了orexin B在猪体内的分布定位,orexin B在前脑与GnRH和OB-Rb的形态学关系,侧脑室注射orexin A后对下丘脑和垂体中相关神经肽的表达和血清PRL、FSH、Leptin及insulin水平的影响以及体外orexin对下丘脑脑片、腺垂体和卵巢颗粒细胞GnRH、LH和E2释放的影响,以期为orexin调控猪的生殖活动提供形态学和生理学资料。一、Orexin B在猪体内的分布定位本实验用免疫组织化学方法研究了10头1～2月龄苏钟猪脑、脊髓、部分内脏器官和内分泌腺内)orexin B免疫阳性细胞的分布定位及其纤维的投射,结果如下:1 Orexin B免疫阳性细胞在猪前脑、脑干、脊髓、部分内脏器官和内分泌腺均有分布。在前脑orexin B免疫阳性神经元胞体主要分布于视前区、下丘脑前区、室旁核、室周核、后区、背内侧核、外侧区、穹隆周核、未定带、乳头体核等部位。在脑干,orexin B免疫阳性神经元分布于从中脑到延髓的许多核团,包括前庭神经核、蓝斑、孤束核、下橄榄核和中缝苍白核等。在脊髓,orexin B免疫阳性神经元胞体,分布于颈部脊髓背角。在内脏器官,orexin B免疫阳性细胞主要分布于卵巢、睾丸、附睾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、胰和脾脏;在内分泌腺,主要分布于垂体和甲状腺。2 Orexin B免疫阳性纤维在中枢神经系统都有广泛的分布。在端脑,orexinB免疫阳性纤维在大脑皮质、隔区、终纹床核、杏仁核和斜角带均有分布。大脑皮质内也有少量阳性纤维分布。在间脑,主要分布于缰核、背内侧核、室周核、视上核、视交叉上核和穹隆周核,在乳头体上核、腹内侧核、下丘脑前区、后区和弓状核/正中隆起也有中等量分布。在脑干,前丘、后丘、脚间核、中缝背核和中央灰质等有密集的阳性纤维分布。在脑桥,蓝斑,被盖背侧核有大量的阳性纤维分布,在第四脑室底、极后区、臂旁内侧核有中等量的阳性纤维分布。此外,在小脑、脊髓和垂体柄及垂体后叶也有少量的阳性纤维的分布。二、在猪前脑orexin B与GnRH和OB-Rb的形态学关系本实验采用荧光双标记并结合激光共聚焦显微镜技术分析了10头1～2月龄苏钟猪前脑内orexin B与GnRH和OB-Rb之间的形态学关系。研究结果显示:在前脑的隔区、终纹床核和整个下丘脑(包括视前区、结节区和乳头体区),均见部分orexin B和GnRH在轴突中的共存;在视前区吻侧部、视前外侧区,GnRH神经元胞体较大,orexin B阳性纤维投射到GnRH神经元的胞体上;在下丘脑前区、视上核和视交叉上核存在少量的orexin B和GnRH在同一神经元中的共存。从前脑的隔区到正乳头体区,大约有30%左右的GnRH神经元胞体接受orexinB免疫阳性纤维的投射,其中有6%的是GnRH和orexin B在同一神经元中共存。在下丘脑前区、室周核、室旁核、未定带、外侧区和腹内侧核发现orexin B神经元内有OB-Rb免疫阳性反应。三、去卵巢猪侧脑室微量注射orexin A对下丘脑和垂体中相关基因表达的影响为探讨orexin A对生殖调控的途径。本实验采用real time PCR方法,研究了10头去卵巢苏钟母猪侧脑室注射orexin A或生理盐水后,对下丘脑PRL、FSH、leptin及OB-Rb mRNA表达的影响,结果如下:1侧脑室注射orexin A后,垂体内PRL mRNA的表达显著降低。2侧脑室注射orexin A后,leptin及OB-Rb mRNA的表达显著降低,而OX1R mRNA的表达显著升高,OX2R mRNA有升高的趋势但差异不显著。四、去卵巢猪侧脑室微量注射orexin A对血清PRL、FSH、leptin及insulin水平的影响Orexin是摄食、能量平衡和生殖之间的信号分子,在动物的营养状态和生殖之间起着桥梁作用。为此,我们研究了向去卵巢猪侧脑室注射orexin A对血清PRL、FSH、leptin及insulin水平的影响。结果如下:1侧脑室注射orexin A后,可引起血清中leptin水平显著下降。注射orexinA 10 min后开始下降,在30 min时降至最低,与对照组相比差异极显著(P＜0.01),随后,有所上升,但与对照组相比差异显著。其作用可持续80 min(P＜0.05)2侧脑室注射orexin A后,可引起血液中insulin显著升高。注射orexin A10 min后开始上升,在30 min时升至最高,与对照组相比差异极显著(P＜0.01),随后,有所下降,但与对照组相比差异显著。其作用可持续110 min(P＜0.05)3侧脑室注射orexin A能够抑制血清中PRL的水平。注射10min开始降低,注射后第40min时降到最低,与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。其抑制作用可持续80 min(P＜0.05)4侧脑室注射orexin A后,血清中FSH有所上升,但差异不显著。五、Orexin对性成熟青年母猪下丘脑组织-垂体-卵巢轴作用的体外研究为探讨orexin在生殖调节中直接作用的靶位点,我们在体外培养了猪下丘脑脑片、垂体和卵巢细胞,研究了orexin A和orexin B在体外对下丘脑、腺垂体和卵巢GnRH、LH和E2释放的影响。结果显示:1 Orexin A(100和1000 nM)能显著的刺激下丘脑脑片GnRH的释放,差异极显著(P＜0.01),而orexin B只有1000 nM剂量组能显著刺激GnRH的释放,差异极显著(P＜0.05)。2 Orexin A(10、100和1000 nM)均能剂量依赖性地刺激腺垂体细胞LH的释放(P＜0.05),其中100和1000 nM剂量组与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。orexin B(100、1000 nM)也能极显著刺激腺垂体细胞LH的释放(P＜0.01)。3 Orexin A(10、100和1000 nM)均能显著刺激卵巢颗粒细胞E2的释放,100nM剂量对卵巢颗粒细胞E2的释放的刺激作用最强,1000nM剂量组的刺激作用反而比100nM剂量组相比的有所下降。Orexin B 100和1000nM剂量组能显著的刺激卵巢颗粒细胞E2的释放(p＜0.05),其中1000 nM剂量组与对照组相比,差异极显著(p＜0.01)。上述研究表明,orexin B在猪下丘脑、垂体和卵巢均有分布,为orexin参与生殖调控提供了形态学依据。Orexin B在猪前脑与GnRH和OB-Rb有共存,提示Orexin参与生殖活动的调节可能是直接作用于GnRH神经元发挥作用也可能是经由leptin介导。侧脑室注射orexin A后,orexin能抑制下丘脑和垂体中PRL、leptin及OB-Rb mRNA的表达,可促进OX1R mRNA的表达,并降低血清中PRL、leptin和升高血清胰岛素的水平。体外试验研究表明orexin A和orexin B能够刺激下丘脑脑片GnRH、腺垂体和卵巢颗粒细胞LH和E2的释放。这些结果表明orexin既可直接影响生殖相关激素的分泌和释放,又可能通过leptin及胰岛素等摄食相关激素间接参与生殖活动的调节。本研究为orexin参与生殖调控提供了形态学和生理学资料。
参考文献：
[1]. 垂体前叶细胞的神经营养功能[D]. 徐平西. 第四军医大学. 1999
[2]. 雌激素对老龄和去卵巢大鼠脑及垂体ER、NGF和ChAT表达的影响[D]. 陈正礼. 西北农林科技大学. 2004
[3]. β-酪啡肽_7对仔猪胃泌素分泌、垂体细胞和T细胞功能影响的机理研究[D]. 谈寅飞. 南京农业大学. 2000
[4]. 鸡胚腺垂体激素特异性细胞的发生及蛋白转录因子Isl-1对其表达的调控性研究[D]. 何玉琴. 甘肃农业大学. 2004
[5]. 垂体催乳素瘤的病因及发病机理的实验研究[D]. 吴雪梅. 中国协和医科大学. 1998
[6]. CS_2致男（雄）性下丘脑—垂体—性腺轴功能紊乱机制初探及NO的干预作用[D]. 季佳佳. 华中科技大学. 2011
[7]. GHRP-2对猪GH分泌的作用规律及促生长效果研究[D]. 兰云贤. 四川农业大学. 2007
[8]. 育雏期鸵鸟睾丸的发育及硼对其下丘脑—垂体—睾丸轴的影响研究[D]. 位兰. 华中农业大学. 2008
[9]. 大豆异黄酮对大鼠下丘脑—垂体—脾脏ERα、NGF、IL-2、AR表达的影响[D]. 祝春梅. 四川农业大学. 2008
[10]. Orexin在体内外对母猪下丘脑—垂体—性腺轴作用机理的研究[D]. 苏娟. 南京农业大学. 2008
标签：生物学论文; 下丘脑论文; 胃泌素论文; 雌激素受体论文; 神经元细胞论文; 睾丸激素论文; 下丘脑激素论文; 睾丸萎缩论文; 睾丸肿胀论文; 雌激素论文; mol论文;