张立阳[1]2003年在《多药耐药基因mdr1与胰腺癌细胞株耐药相关性的研究》文中提出近年来，胰腺癌发病率有逐年上升的趋势。在西方发达国家，其死亡率高居恶性肿瘤死亡率的第四位，因其临床表现隐匿，早期缺乏特异性症状，80％的患者就诊时已近晚期，手术切除率只有5％-25％左右，所以多数患者只能采用化疗、放疗等姑息治疗手段。即使对有手术切除机会的胰腺癌患者术后也常需要辅助化疗、放疗，以进一步消灭残余肿瘤细胞及预防肿瘤复发。化疗对于原发灶及转移灶都有一定疗效，对于缓解症状，改善患者生活质量具有更重要意义，在胰腺癌治疗中已越来越为人们所重视。然而，除骨髓抑制等毒副作用外，肿瘤细胞对化疗药物的耐药现象已成为目前影响包括胰腺癌在内的许多恶性肿瘤化疗效果的重要因素之一。因此，对于胰腺癌中多药耐药基因的表达情况及其与胰腺癌耐药及预后关系的研究显得极为重要。 与肿瘤耐药相关的机制很多，如多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，mdr1)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，mrp)、肺耐药蛋白(lung resistance protein，lrp)等的过度表达，拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽代谢的改变，DNA修复的增加等。但与多数肿瘤耐药相关且研究得比较深入的则是多药耐药基因mdr1。本课题采用分子生物学及细胞生物学方法对胰腺癌细胞株中多药耐药基因mdr1的表达、功能及其与胰腺癌耐药的相关性进行了研究；同时，在胰腺癌先天性耐药的基础上，对化疗药物诱导胰腺癌的获得性耐药机制亦进行了初步研究，并探讨其临床意义，以期为进一步指导临床胰腺癌化疗提供理论依据。
黄喆[2]2007年在《5-氟尿嘧啶和柳氮磺胺吡啶对胰腺癌细胞BxPC-3体内体外凋亡及增殖的作用》文中研究表明前言细胞凋亡(apoptosis)是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发，在基因调控下引起细胞主动死亡过程。细胞凋亡严重失衡对机体具有破坏作用。现已证实肿瘤发生、发展与细胞凋亡失衡有关。胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma)发病率占全部恶性肿瘤1％—2％，呈逐渐增加趋势；胰腺癌仍是难以攻克的顽疾，手术切除率24.5％-43.4％，术后5年生存率19.6％-26.1％：除手术治疗外唯一姑息选择大多选择化疗。采用吉西他滨(gemcitabine)和5-FU可适度缓解病情。目前化疗不佳主要原因为胰腺癌对化疗药物产生多药耐药(multiple drug resistance，MDR)，即不经药物诱导的固有耐药性。近年研究认为：转录因子NF-κB是新近予以关注的最重要的抗凋亡基因之一，参与肿瘤发生、进展过程，且具有强烈抗凋亡作用。封闭NF-κB活化通常被认为下调一些抗凋亡基因，如Bcl-2、XIAP而促进凋亡。最近研究认为：NF-κB活性升高在胰腺癌细胞多药耐药、浸润、转移、凋亡方面起到关键作用，其高表达是导致胰腺癌细胞产生耐药重要原因之一。Sulfasalazine为一种抑制NF-κB的有效制剂，封闭IKKs活化且临床用于治疗类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，NF-κB抑制剂的使用可消除这种耐药性。5-FU是用于治疗胃肠肿瘤的最有效化疗药物之一，它通过封闭胸苷酸激酶诱导某些敏感癌细胞株凋亡。本研究方向围绕着有效抑制胰腺癌NF-κB活化消除5-FU对胰腺癌细胞多药耐药，探讨5-FU、sulfasalazine联合作用是否有协同促进诱导胰腺癌细胞凋亡、抑制多药耐药基因表达和细胞增殖作用，并为此进行体内、体外条件下的相关的实验研究。目的本研究目的在于通过抑制NF-κB活性消除胰腺癌细胞对5-FU化疗耐药并探讨5-FU和sulfasalazine对胰腺癌细胞株BxPC-3抗增殖作用是否与诱导胰腺癌细胞凋亡有关。我们应用RT-PCR和Western Blot检测NF-κB(P65)、Bcl-2、MDR、cyclinD1 mRNA和蛋白水平的变化，探讨在体内、外条件下sulfasalazine，5-FU单独及联合作用于胰腺癌细胞株BxPC-3及细胞BxPC-3裸鼠异位移植瘤上述凋亡相关基因表达之间关系及相互作用机制，为深入研究胰腺癌凋亡机制、多药耐药及细胞增殖周期内在联系，为克服胰腺癌多药耐药提供一定的实验依据。方法一、细胞培养细胞株BxPC-3用RPMI1640培养液(10％胎牛血清，2.0mmol/L谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/L链霉素)在37℃，5％CO_2条件培养。二、采用四甲基唑蓝(MTT)法检测生长抑制率不同浓度的(12.5，25，50，100mg/L)5-FU、(25，50，100，200 mg/L)sulfasalazine单独及联合作用(终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100 mg/L)细胞BxPC-3在不同时间的生长抑制率，并设立各自同期阴性对照组，酶联免疫检测仪在波长570nm测吸收光度值(A值)，计算生长抑制率=(阴性对照组A_1值-用药组A值)/(阴性对照组A_1值-空白组A_0值)×100％，上述实验重复3次。叁、PI染色法检测细胞BxPC-3中晚期凋亡率及细胞周期的变化不同浓度的(12.5，25，50，100mg/L)5-FU、(25，50，100，200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用(终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100mg/L)同步化的细胞BxPC-3在不同时间(12，24，36，48h)的中晚期凋亡率及细胞周期变化，设3个阴性对照组(分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO)，低于G_1期亚二倍体细胞为凋亡细胞，用CELL Quest软件(Becton Dickson，美国)分析样本，测出各细胞周期百分率和凋亡率，并按以下公式计算增殖指数(PI)：PI=(S+G_2/M)/(G_0/G_1+S+G_2/M)。每个样本检测10，000个细胞，上述实验重复6次。四、PI/Annexin-V双染法检测早期凋亡率(100mg/L)5-FU、(200mg/L) sulfasalazine单独及联合作用同步化的胰腺癌细胞株BxPC-3在不同时间(12，24，36，48h)的早期凋亡率，设3个阴性对照组(分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO)，冷PBS洗涤2次，离心1000rpm 5分钟4℃，弃上清，细胞重悬于200ul binding buffer；加10ulAnnexin V-FITC和5ul PI，轻轻混匀，4℃避光反应30分钟，每个样品加300ulBinding buffer，在1小时内上机检测，上述实验重复6次。五、免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达(100mg/L)5-FU，(200mg/L) sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3 24h时NF-κB(P65)，Bcl-2，cyclinD1蛋白表达，并设立各自阴性对照组，95％乙醇固定30min，1％Triton-X-100作用30min，分别与兔抗人NF-κB(P65)，Bcl-2，cyclin D1抗体4℃结合24h，与生物素标记山羊抗兔IgG 37℃10min，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水中性树胶封固。根据阳性细胞数和染色强度行半定量分析。六、相差显微镜观察细胞形态变化观察(100mg/L)5-FU，(200mg/L) sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-324h及各自对照组细胞形态变化。七、透射电镜观察细胞内超微结构变化(100mg/L)5-FU，(200mg/L) sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，电子染色，透射电镜下观察。八、扫描电镜观察细胞表面的微细结构变化(100mg/L)5-FU，(200mg/L) sulfasalazine单独及联合处理细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，0.3％硝酸银染色20秒，脱水后液态CO_2干燥，喷金包埋。每个样本取8个区域，于10,000x扫描电镜下观察。九、实验裸鼠皮下异位移植瘤模型建立及实验分组BALB/c nu/nu裸小鼠雄：雌性比3:1，鼠龄4-6周，体重(20±2)g，共66只，在SPF条件下饲养。收集体外大量培养细胞株BxPC-3制成浓度为5.0×10~6个/ml单细胞悬液，在无菌条件下接种于裸小鼠肩胛背部为0.5ml/只，经过2-3个月，待移植瘤直径达到0.6-0.8cm，将移植瘤裸鼠随机分为11组，5-FU、sulfasalazine联合作用组(15+20，15+10，7.5+20，7.5+10mg/kg)、sulfasalazine单独作用组(20，10mg/kg)、5-FU单独作用组(15，7.5mg/kg)及各自阴性对照组分别为controll(NS：DMSO=1:1混合液)、controL2(DMSO)、control3(NS)：按上述方案移植瘤体内注射，隔日1次，治疗共4周，颈椎脱位处死裸鼠，取出肿瘤称重，测量大小，放入EP管中存于-70℃冰箱中备用。十、RT-PCR法检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因(Bcl-2，cyclinD1，Bax及NF-κB(P65))的mRNA水平变化收集移植瘤各处理组、收集各处理组细胞及各自对照组，RNAout提取总RNA，在紫外线分光光度仪测定总RNA含量，取1ul总RNA为模板按照TakaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作步骤，逆转录合成cDNA，其反应体系为10ul，PCR仪扩增反转录反应产物，反应体系为40ul，结果采用紫外凝胶成像分析系统行目的基因表达水平半定量分析，以上实验重复6次。十一、Western Blot检测检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因(Bcl-2，cyclinD1，Bax，MDR1及NF-κB(P65))的蛋白水平变化。取移植瘤各处理组或收集各处理组及各自对照组，冷PBS洗涤3次，置于冷裂解液(50mmol/L Tris[PH 7.4]，150mmol/L NaCl，2.0mmol/L EDTA，1％NP-40)中，4℃离心12,000g 15min，按上述方法制备的20μg溶胞产物加到样本缓冲液中，煮沸，取等量蛋白行SDS-PAGE电泳，分离蛋白转印，脱脂奶粉封闭，加入一抗(1:200) 4℃过夜，TTBS漂洗5min，2次，与二抗(1:200)反应2h，漂洗2次，AP显色30min，成像分析软件Fluorchem V 2.0测定主带吸光度值计算上述指标的蛋白表达水平，以上实验重复6次。结果一、MTT法测定细胞生长抑制率不同浓度5-FU、sulfasalazine联合作用细胞BxPC-3生长抑制作用明显增强呈时间、剂量依赖性；不同浓度5-FU作用细胞BxPC-3生长抑制率随时间延长逐渐升高，不同浓度sulfasalazine作用的生长抑制率下降。二、PI染色法测定细胞BxPC-3中晚期凋亡率及细胞周期变化200mg/L sulfasalazine、100 mg/L 5-FU单独及联合作用细胞BxPC-3 12h凋亡率分别为2.68％，6.59％，10.52％，与各自对照组3.17％，1.50％，4.08％比较(t=2.33，P＞0.05，9.78，17.56，P＜0.01))；作用48h凋亡率明显增加到7.63％，40.43％，64.69％，与对照组29.20％，5.61％，12.02％比较(t=17.06，33.66，94.51，P＜0.01))。不同浓度(12.5，25，50，75，100mg/L)5-FU作用24h细胞凋亡率、S期细胞比例和增殖指数增加：然而随着sulfasalazine浓度增加作用24h细胞凋亡率从2.68％缓慢增加到7.63％，G_0/G_1期细胞比例从35.13％增加到54.32％，S期细胞比例从45.37％下降到16.67％，PI呈递减趋势；100mg/L 5-FU联合200mg/L sulfasalazine作用细胞BxPC-3不同时间G_0/G_1期细胞比例从43.31％(12h)到85.05％(48h)，与对照组比较(t=7.93(12h)，21.30(48h)，P＜0.01)，S期细胞比例从11.63％(12h)下降到4.47％(48h)，与对照组比较(t=37.68(12h)，8.60(48h)，P＜0.01)。叁、PI/Annexin-V双染法测定100mg/L 5-Fu，200mg/L sulfasalazine单独及联合作用BxPC-3不同时间的早期凋亡率随着时间延长，5-Fu单独作用时早期凋亡率逐渐升高，与阴性对照组(0.09％NaCl)比较(t=5.41，2.06，13.38，22.99，除24h P＞0.05外，其余均P＜0.01)；sulfasalazille单独作用时早期凋亡率呈先升高后下降趋势，不如5-Fu单独作用，与阴性对照组(0.2％DMSO)比较(t=2.65，4.53，2.32，3.78，P＜0.05)；但二者联合作用时早期凋亡率呈明显升高趋势，优于两个单独作用组，与阴性对照组(0.09％NaCl+0.2％DMSO)比较(t=5.58，17.35，24.95，33.67，P＜0.01)；100mg/L 5-Fu，200mg/L sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3早期凋亡率及阴性对照组(0.09％NaCl+0.2％DMSO)在12，24，36，48h经多因素方差分析表明二者之间存在明显交互作用即分别为F=52.23，245.14，277.34，418.93，P=0.000四、免疫细胞化学法检测结果(100mg/L)5-FU，(200mg/L) sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3 24h时NF-κB(P65)，Bcl-2，cyclin D1蛋白表达与各自对照组比较叁个指标平均吸光度值差异有统计学意义；同一指标各作用组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。多因素方差分析显示Bcl-2平均吸光度值在5-FU、sulfasalazine单独及联合作用组与阴性对照组(0.09％NaCl+0.2％DMSO)之间比较，二者存在明显交互作用，F=1216.57，P=0.000。五、相差显微镜下的细胞形态变化相差显微镜观察二者联合作用24h大量细胞固缩变圆，其阴性对照组少量细胞固缩变圆，胞体略肿胀：100mg/L5-FU作用24h较多细胞固缩变圆，其阴性对照组细胞基本无改变：200mg/L sulfasalazine作用24h少量细胞固缩变圆，其阴性对照组细胞胞体略肿胀。六、透射电镜观察细胞BxPC-3的超微结构变化(100mg/L)5-FU联合(200mg/L)sulfasalazine作用组细胞BxPC-3染色质向核膜下积聚，有凋亡小体形成，对照组细胞内质网较丰富；(100mg/L)5-FU作用时细胞核碎裂，对照组细胞微绒毛粗大，内质网丰富；(200mg/L)sulfasalazine作用时细胞核固缩，对照组细胞核分解。七、扫描电镜观察细胞表面的微细结构变化联合作用组细胞绒毛大量脱落变小，对照组细胞绒毛部分变小；100mg/L 5-FU作用绒毛大量萎缩，而对照组细胞绒毛粗大；200mg/L sulfaalazine作用时细胞绒毛较大，而对照组细胞绒毛变小，部分脱落；八、5-FU，sulfasalazino单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3mRNA和蛋白水平变化(100，50mg/L)5-FU，(100，200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-324h NF-κB(P65)mRNA相对含量为(0.51±0.06)，(0.57±0.06)，(0.19±0.03)，(0.15±0.03)，(0.24±0.04)，(0.10±0.01)，(0.40±0.06)，(0.21±0.06)，与各自对照组比较t=11.08，9.12，7.94，9.96，17.64，34.45，7.58，12.82，P＜0.01；作用24h其蛋白表达量为(2980.60±153.77)，(2209.87±143.04)，(3294.90±61.57)，(1451.47±68.19)，(2615.60±237.03)，(440.27±31.73)，(2483.33±241.72)，(1289.67±183.11)，与各自对照组比较t=7.99，12.08，23.79，10.40，6.49，59.97，7.27，19.49，P＜0.01：作用24h Bcl-2，cyclinD1在mRNA相对含量和蛋白表达量均与各自对照组比较P＜0.01：上述指标经多因素方差分析显示二者存在明显交互作用。九、5-Fu、sulfasalazine单独及联合作用皮下异位移植瘤mRNA和蛋白水平变化(7.5，15 mg/kg)5-FU，(10，20 mg/kg)sulfasalazine单独及联合作用皮下异位移植瘤NF-κB(P65)mRNA相对含量分别为(0.42±0.07)，(0.50±0.05)，(0.35±0.06)，(0.22±0.03)，(0.26±0.05)，(0.21±0.02)，(0.15±0.02)，(0.09±0.03)，与各自对照组比较t=19.16，17.67，0.71，9.61，13.58，18.56，21.78，24.89除t=0.71，P=0.48外，其余均P＜0.01，各作用组间经多因素方差分析显示二者存在明显交互作用(F=35.04，P=0.00)；其蛋白含量为(2070.45±93.09)，(2594.74±76.55)，(3574.78±117.54)，(1837.57±104.25)，(1998.90±168.06)，(1156.31±96.45)，(2474.04±114.22)，(669.92±98.75)，与各自对照组比较t=79.01，67.49，43.38，0.71，37.03，64.84，31.85，76.09(除t=0.71，P=0.49外，其余均P＜0.01)：Bcl-2，cyclinD1，MDR1叁个指标在mRNA相对含量和蛋白表达量均与各自对照组比较P＜0.01：这些指标经多因素方差分析显示二者间存在明显交互作用。结论Sulfasalazine有抑制胰腺癌细胞BxPC-3增殖和增强5-FU诱导细胞凋亡作用，二者作用细胞BxPC-3有协同生长抑制作用，此作用与二者协同诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞于G_0/G_1期密切相关。Bcl-2，cyclinD1，MDR1及NF-κB(P65)mRNA和蛋白水平下调是sulfasalazine协同增强5-FU诱导细胞BxPC-3凋亡作用机制之一。Sulfasalazine可协同增强5-FU诱导裸鼠皮下异位移植瘤胰腺癌细胞BxPC-3凋亡作用：Bax水平上调，Bcl-2，cyclinD1，MDR1及NF-κB(P65)水平下调可能是二者联合作用皮下异位移植瘤凋亡机制之一。
仇宝玲[3]2014年在《多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达模式及其临床意义》文中指出本论文包括叁个部分：（一）多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族6个家族成员（MRP1-6）基因荧光定量RT-PCR的优化；（二）儿童急性淋巴细胞白血病MRP1的表达及意义；（叁）儿童急性淋巴细胞性白血病MRP2-6的表达及意义。第一部分多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族荧光定量RT-PCR的优化目的：通过定量PCR技术检测MRP1-6基因mRNA在白血病细胞株中的表达水平，优化荧光定量RT-PCR的条件，鉴定引物的特异性，为研究MRP1-6基因在儿童急性淋巴细胞性细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）中的表达及意义提供基础。方法：培养和收集3株白血病细胞株为模板，提取总RNA，逆转录合成cDNA，优化实时定量RT-PCR条件，通过测定MRP1-6基因在各个细胞株中的表达水平和溶解曲线分析，鉴定MRP1-6基因引物的特异性。结果：MRP1-6基因引物具有特异性，通过优化荧光定量RT-PCR条件为研究MRPs在儿童ALL中的表达奠定了基础。第二部分儿童急性淋巴细胞白血病MRP1基因的表达及临床意义目的：多药耐药相关蛋白基因（multidrug resistance associated protein-1，MRP1）在多种肿瘤中高表达，与肿瘤多药耐药具有密切相关性。通过定量PCR检测儿童急性淋巴细胞细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）MRP1基因mRNA的表达水平，分析其在儿童ALL中的表达特点及临床意义。方法：收集2013年期间在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患儿146例（初诊=67例，完全缓解=70例，复发=9例），10例特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenic purpura，ITP）患儿骨髓为对照。应用定量RT-PCR方法检测MRP1基因的表达水平，利用SPSS18统计学软件，分析MRP1基因表达水平与儿童ALL临床预后指标的相关性。结果：(1)初诊组和复发组MRP1的中位表达水平分别为5.82和8.49，明显高于完全缓解组（1.99），P值均＜0.05；其中复发组表达水平最高。(2) MRP1的表达水平与ALL危险程度具有密切相关性，低危组表达水平最低、中危组居中、高危组最高，中位数依次为4.28、5.62和7.56，中危组与标危组、高危组与标危组之间的差异具有统计学意义，P值分别为0.015、0.007。(3)以中位表达水平为界将初诊患儿分为高、低表达量两组，高表达组（n=34例）第7天强的松预处理敏感率为70.6%，而低表达组（n=33例）敏感率为90.9%，P=0.035；第33天骨髓完全缓解率高表达组为64.7%，低表达组为87.9%，P=0.026；第15天骨髓完全缓解率高表达组为68.8%，低表达组为69.7%，P=0.664。（4）初诊T-ALL组（n=10例）MRP1的表达水平高于B-ALL组（n=57例），中位数分别为7.71和5.18，差异有统计学意义（P=0.007）。（5）单因素分析显示MRP1mRNA表达水平与患儿性别、年龄、初诊时白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、外周血涂片幼稚细胞比例及骨髓涂片幼稚细胞比例无相关性。结论：在儿童急性淋巴细胞性白血病中，MRP1的表达与免疫分型、治疗反应、危险程度及疾病复发密切相关，是ALL预后差的有效指标。第叁部分儿童急性淋巴细胞白血病MRP2-6的表达及临床意义目的：MRP2-6基因在多种肿瘤中高表达，与肿瘤多药耐药具有密切相关性，目前有关它们在儿童ALL中的表达及意义国内鲜见报道，使用荧光定量PCR检测MRP2-6mRNA在儿童ALL中的表达水平，分析其在儿童ALL中的表达特点及临床预后指标的相关性。方法：于2013年收集在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患儿133例（初诊=56例，完全缓解=68例，复发=9例），10例特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenic purpura，ITP）患儿骨髓为对照。应用定量RT-PCR方法检测MRP2-6基因的表达水平，利用SPSS18统计学软件，分析它们在儿童ALL预后指标的相关性。结果：(1)初诊组MRP2基因的中位表达水平最高（2.99），复发组次之（1.18）完全缓解组最低（1.17），但各组比较差异无统计学意义，P值分别为0.065和0.763；完全缓解组MRP3基因的中位表达水平为2.09，高于初诊组、复发组，后两者中位表达水平分别为0.52和0.38，且初诊组与完全缓解组之间差异有统计学意义，P值＜0.001；MRP4在初诊组和复发组的中位表达水平分别为2.46和5.47，均高于完全缓解组（1.64），差异有统计学意义，P值分别为0.039、0.029，以复发组表达水平最高；MRP5的在儿童ALL中的表达模式与MRP4相似，其中位表达水平在初诊组和复发组分别为1.60和3.84，高于完全缓解组（0.91），且差异有统计学意义，P值分别为0.003、0.002，以复发组表达水平最高； MRP6的中位表达水平在复发组最高，为2.0，高于初诊组、完全缓解组，后二者分别为0.56和1.13，但差异无统计学意义。(2)最终危险程度分级显示MRP2和MRP5的表达在中危组最高，分别为4.62和1.71，但与低危组、高危组比较没有统计学意义；MRP4的中位表达水平以高危组最高，但与中危组、低危组比较，差异无统计学意义。（3）以MRP2-6mRNA中位表达水平为界，将初诊ALL患儿分为高、低表达组，分析它们在3个治疗反应评估点（第7天、15天和33天）的表达差异，发现没有统计学意义。且与免疫分型没有相关性。（4）单因素分析显示MRP2与初诊时血小板计数呈负相关、MRP4与性别具有有关性。结论：在儿童急性淋巴细胞性白血病中，MRP2-6mRNA的表达水平具有不同的表达模式，其中MRP4和MRP5mRNA的表达水平在疾病复发时最高。
汪涛[4]2003年在《高分化胰腺癌多药耐药机制及靶向逆转的初步研究》文中认为目的：从多药耐药膜转运蛋白角度探讨高分化胰腺癌的耐药及调控机制；研究阻断体外培养的人高分化胰腺癌细胞株SW1990 IGF-ⅠR环路对多药耐药蛋白MRP表达的调节作用；评价IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染对SW1990胰腺癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：1、收集2000.4-2001.12月间四家医院的高分化胰腺癌手术切除病理标本26例，每个标本作连续切片，采用免疫组化SP法分别检测叁种多药耐药膜转运蛋白P-gp、MRP、LRP和IGF-ⅠR在胰腺癌组织和癌周组织中的表达，并作对比研究和相关性分析；2、采用自行设计的混合骨架IGF-ⅠR反义寡核苷酸，在非脂质体配方的FugeneTM6试剂介导下转染体外培养指数期生长的高分化胰腺癌细胞株SW1990，在转染后12、24、48、72、96小时连续观测IGF-ⅠR的水平变化，了解该序列IGF-ⅠR反义寡核苷酸对IGF-ⅠR表达的干预效果；同时，免疫组化、Wester-blot和RT-PCR检测转染对MRP在蛋白和mRNA水平表达的影响。3、在前面研究的基础上，采用不同剂量IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染SW1990细胞，高效液相色谱仪比较转染前后5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、Gemcitabine叁种不同结构化疗药物在细胞内蓄积浓度的变化；四氮唑蓝法、流式细胞仪和AO荧光染色检测转染联合化疗对胰腺癌细胞杀伤效应、细胞周期和凋亡易感性的影响。设立空白转染、DMEM假转染和IGF-ⅠR正义寡核苷酸转染作为对照组。结果：1.1、在高分化胰腺癌组织中，叁种多药耐药膜转运蛋白呈差异性表达：MRP最高（76.9%），P-gp次之（42.3%），LRP仅7.69%；而癌旁组织中，其表达亦不均衡：P-gp为34.6%，MRP7.69%，LRP未检测到表达；MRP在胰腺癌组织中的表达显着高于癌旁组织（P<0.05），但P-gp和LRP在胰腺癌和癌旁组织的表达则无明显差异（P＞0.05）；1.2、IGF-ⅠR在高分化胰腺癌组织中过度表达（73.1%），而在癌周基本不表达，相关分析显示，IGF-ⅠR与MRP在高分化胰腺癌组织中的表达明显正相<WP=10>关（rs=0.711，P<0.02）。2.1、体外培养的SW1990胰腺癌细胞呈典型的上皮样细胞生长特征，高表达IGF-ⅠR和MRP，免疫组化显示表达部位主要位于细胞的胞浆和胞膜，而部分胞核也可着色；2.2、IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染后，SW1990胰腺癌细胞的IGF-ⅠR在蛋白和mRNA水平均明显下降，与对照组相比差异显着（P<0.05）：免疫组化显示IGF-ⅠR蛋白的阳性表达率在空白对照组为84.2%，转染后12、24、48、72、96小时分别为51.3%、22.6%、19.7%、38.8%和62.4%；RT-PCR显示各时相点IGF-ⅠR mRNA的表达量分别是空白对照组SW1990胰腺癌细胞表达水平的60.6%、34.2%、26.3%、45.8%和76.5%；2.3、IGF-ⅠR反义寡核苷酸能显着下调SW1990胰腺癌细胞MRP在蛋白和mRNA水平的表达（P<0.05），且与IGF-ⅠR变化规律一致：在转染12、24、48、72、96小时，MRP的表达量分别是空白转染组的83.6%、52.6%、39.3%、62.6%和91.8%（免疫组化SP）；58.3%、38.6%、29.5%、54.4%和81.1%（Western-blot）；52.6%、30.9%、25.5%、48.3%和76.8%(RT-PCR)。3.1、IGF-ⅠR反义寡核苷酸能明显提高化疗药物在SW1990胰腺癌细胞内的蓄积浓度，与对照组比较差异显着（P<0.05），蓄积浓度随反义寡核苷酸转染剂量的升高而增加；3.2、单纯IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染对SW1990胰腺癌细胞有低水平的杀伤效应，而转染联合化疗对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强，显着高于单纯化疗组和转染组（P<0.05），并分别随转染剂量和化疗给药浓度的增加而增强；3.3、流式细胞仪检测发现，给予单纯化疗干预或反义寡核苷酸转染，细胞周期均出现相同变化：G0/G1期细胞比例上升，G2、M期比例下降；而反义寡核苷酸转染联合化疗，则对SW1990的细胞周期抑制作用更为明显，无论与单纯反义寡核苷酸转染还是化疗相比，G0/G1期细胞比率均有显着上升；3.4、AO荧光染色显示，指数期生长的人胰腺癌细胞株SW1990自然凋亡率极低，仅为0.72%左右；在与化疗药物共同孵育后，出现典型的凋亡表现，凋亡率随化疗浓度升高而增加；在IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染后，可出现SW1990细胞凋亡的显着增加（P<0.05），两者有量效关系；但在IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染联合化疗时，细胞凋亡率只在较低转染水平和化疗浓度时呈上升趋势，而在较高的转染水平和化疗浓度时反而下降。结论：1、MRP是高分化胰腺癌组织中的“优势耐药蛋白”，在胰腺癌和癌周组织中的差异性表达提示它是肿瘤发生和行进过程中获得的一种新型耐药机制；2、IGF-ⅠR作为许多恶性肿瘤的共性标志物，是一种具有强大生物学活性的调节因子，在高分化胰腺癌组织中过度表达，可能参与多药耐药蛋白MRP的调控，是MRP的重要上游事件；3、体外培养的SW1990人胰腺癌细胞株同时高表达IGF-ⅠR和MRP，可作为研究原发性多药耐药的良好细胞模型；4、与前期的反义技术相比较，本研究所设计的IGF-ⅠR反义寡核苷酸对IGF-ⅠR的干预在起效时间、下调幅度和持续抑制上都有明显提高，这得益于IGF-ⅠR反义寡核苷酸靶序列的确立、活性基团的修饰和<WP=11>FugeneTM6试剂的辅助转染；5、IGF-ⅠR反义寡核苷酸可明显抑制胰腺癌细胞株SW1990的MRP表达，证实IGF-ⅠR对MRP的调控作用，即通过某种内在化机制在mRNA水平干扰MRP
张德宝[5]2008年在《人骨肉瘤多药耐药细胞模型的建立及蛋白质组学分析》文中研究表明骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,儿童和青少年多发,预后极差。目前的治疗主要是以手术、化疗为主的综合治疗。临床上发现骨肉瘤细胞对化疗药物的耐受,特别是交叉耐受是导致化疗失败的主要原因,因此,近年来骨肉瘤多药耐药机制的研究已逐渐成为人们研究的热点。然而针对骨肉瘤多药耐药机制的研究尽管在基因水平上已取得了不少进展,但还不能完全解释多药耐药现象。蛋白质组学是后基因组时代新兴的学科,应用差异蛋白质组学的方法对骨肉瘤多药耐药细胞蛋白质组进行研究有可能为骨肉瘤多药耐药机制提供新的线索。1、人骨肉瘤多药耐药细胞模型的建立及生物学特性分析:以人骨肉瘤细胞MG-63为亲本细胞,小剂量阿霉素经过6个月诱导,成功建立了人骨肉瘤细胞的多药耐药模型,并进行了相关生物学特性分析:(1)多药耐药MG-63/DXR100与其亲本细胞相比,细胞表面突起较多,细胞内大量糖原样空泡及脂滴,粗面内质网更为丰富。(2)MG-63/DXR100仍有较强的增殖能力,但较亲本细胞增殖能力差,流式细胞周期分析显示细胞阻滞于S期。(3)MG-63/DXR100除了对阿霉素有较高的耐药性外,对甲氨蝶呤、环磷酰胺和长春新碱也有不同程度的交叉耐药性。(4)在mRNA和蛋白质水平上,P-gp、MRP3在MG-63细胞均不表达,而在MG-63/DXR100细胞中均有较强表达。2、人骨肉瘤多药耐药细胞蛋白质组学分析:应用差异蛋白质组学的方法比较MG-63/DXR100与其亲本细胞的蛋白质组成差别。经双向电泳及质谱分析,共有5个蛋白点被成功鉴定,它们分别是:具有细胞内解毒功能的乙醇脱氢酶6(ADH6);与肿瘤细胞转移关系密切的基质金属蛋白酶1(MMP1);可能具有抑癌基因功能的FRMD3;分别由128个和300个氨基酸残基组成的两个未知蛋白。其中ADH6、MMP1和两种未知蛋白在实验组MG-63/DXR100中表达增高,而FRMD3在MG-63/DXR100中表达降低。这些差异表达的蛋白可能参与了骨肉瘤多药耐药发生机制,为更深入的研究提供了新的线索。
张汉阳[6]2012年在《LIMK1在骨肉瘤多药耐药中的作用及机制研究》文中研究指明骨肉瘤是临床上一种儿童以及青少年常多发的最常见的恶性骨肿瘤，其数量可占原发的恶性骨肿瘤的30%左右，骨肉瘤因其进展迅速，预后较差而成为恶性程度很高的一种恶性肿瘤。随着医疗水平的提高，骨肉瘤的治疗策略主要是手术治疗辅之以放、化疗，多种药物联合化疗的治疗方案的实施会很大的提高骨肉瘤患者的治疗效果，然而骨肉瘤细胞多药耐药(Multidrug resistance, MDR)的出现成为了化疗成功的主要障碍。所以，现在医务工作者对骨肉瘤的耐药性研究成为了一个热点。本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象，应用临床治疗骨肉瘤的常用药物长春新碱，采用小剂量浓度递增的方法，经过长期诱导成功建立了人骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/VCR，并对其生物学特性进行了分析和鉴定。在此基础之上，我们发现LIMK1及其下游通路分子P-Cofilin在骨肉瘤多药耐药细胞中呈高表达，并且通过基因转染技术验证了LIMK1在骨肉瘤多药耐药细胞迁移和多药耐药中的作用。最后通过RT-PCR、RealTime-PCR及Westernblot等方法检测LIMK1与P-gp表达及功能的关系，以及LIMK1调节药物引发的细胞凋亡的作用，进一步阐明LIMK1编码基因在骨肉瘤多药耐药形成中的作用及其机制，使我们更全面、深入地理解和认识骨肉瘤产生多药耐药的过程及发生及调节机制，为骨肉瘤多药耐药的逆转研究提供依据。
曾玮[7]2010年在《抑制P-糖蛋白表达逆转胰腺癌多药耐药》文中研究说明目的：研究黄芪(Astragalus, AST)对人胰腺癌细胞株PANC-1中的P-糖蛋白的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法：选用人胰腺癌耐药细胞株PANC-1,通过MTT法和免疫组织化学等方法,评价黄芪对P-糖蛋白(P-gp)介导的耐药机制的逆转作用。采用MTT法测定不同浓度的黄芪,5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)及黄芪和5-Fu联合用药的情况下对胰腺癌细胞增殖作用的抑制效果,用免疫组织化学的方法检测使用不同浓度的黄芪,5-氟尿嘧啶的情况下对P-糖蛋白表达的影响。结果：由MTT法检测AST和5-Fu对PANC-1细胞单独抑制情况结果可见,两种药物与各自对应的对照组相比,均能明显抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,同一药物不同浓度组间均数的两两比较结果显示：AST随其浓度的增高,对PANC-1细胞的抑制变化无明显差异,而5-Fu随其浓度的增加出现抑制性增强,提示5-Fu对PANC-1细胞的增殖抑制作用在一定范围内具有浓度依赖性。由5-Fu单独作用于PANC-1细胞的增殖抑制作用结果可见,5-Fu对PANC-1细胞增殖抑制率达15-30%时的药物浓度为0.5ug/ml和5ug/ml,为减少药物浓度过大时可能产生的药物毒性作用,我们选择0.5ug/ml作为与不同浓度的AST联合用药时的最终浓度。由AST与5-Fu联合用药对胰腺癌PANC-1细胞的抑制作用结果可见,不同浓度AST联合5-Fu(0.5ug/ml)后,对胰腺癌PANC-1细胞的增殖抑制率明显升高,接近或大于两种药物单独用药抑制率之和,与单独5-Fu或相应浓度AST组比较,差异有显着性,表明联合用药可显着提高单独用药对胰腺癌PANC-1细胞的增殖抑制作用。联合效应分析结果显示,2.5mg/ml、5 mg/ml的AST与5-Fu的联合效应为相加效应,10mg/ml、20 mg/ml的AST与5-Fu的联合效应为协同效应。由各组实验Akt与Mdr-1蛋白表达免疫细胞化学染色结果可见,Mdr-1、Akt在PANC-1细胞中的阳性表达均呈棕色反应。与Akt对照组相比,分别加入AST和5-Fu作用24h后,胞质的棕色颗粒都出现明显减少,其中5-Fu组比AST组作用下棕色着色颗粒多,AST在20mg/ml的浓度下颜色变化比5mg/ml更为明显,表明药物作用下,Akt蛋白的表达量出现明显降低。IOD值的统计分析显示,不同实验组间与对照组相比Akt蛋白表达差异具有显着性,Akt对照组与5-Fu组之间Akt表达无明显差异；5mg/mlAST组与20mg/mlAST组之间Akt表达差异有显着性。Mdr-1蛋白在不同组间的表达情况与Akt蛋白变化相似,各实验组与对照组相比差异有统计学意义,Mdr-1对照组与5-Fu组之间Mdr-1表达无明显差异；5mg/mlAST组与20mg/mlAST组之间Mdr-1表达差异有显着性。结论：在胰腺癌细胞中,P-糖蛋白呈高表达,针对P-糖蛋白,黄芪能有效地抑制P-gp的表达及功能,从而拮抗P-gp介导的多药耐药,显着提高化疗药物5-Fu对胰腺癌PANC-1细胞的增值抑制作用,为逆转多药耐药展示了良好的前景。
吴敏[8]2009年在《洛贝林逆转结肠癌细胞株HCT-8/VCR多药耐药的实验研究》文中认为背景与目的:化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一,肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是化疗失败的主要原因,占化疗失败的90%以上。因此,MDR的逆转有着重要的意义和临床应用价值。生物碱类的天然有效成分被证明具有逆转肿瘤多药耐药的作用。洛贝林(Lobeline),是一种哌啶类生物碱,能选择性地兴奋颈动脉体化学感受器,反射地兴奋呼吸中枢,大剂量也能直接兴奋呼吸中枢。国外有学者通过研究证明洛贝林能抑制P-gp的活性,洛贝林的MDR逆转可能性能在阿霉素化疗的细胞中得到证明,洛贝林能增加耐药肿瘤细胞的化疗敏感性。本实验的目的在于探讨洛贝林逆转多药耐药的机制,并与已知的具有逆转P-gp介导的MDR的药物维拉帕米比较,评估其有效性。方法:以人结肠癌细胞株HCT-8/VCR为研究对象,用四氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度的长春新碱和5-氟尿嘧啶对细胞的抑制率及在洛贝林干预下二者对细胞的抑制率,由此求取耐药逆转的倍数;用微孔板荧光分光光度计测定在无干预措施、不同浓度的洛贝林干预下HCT-8/VCR细胞内罗丹明123的荧光强度;用流式细胞术测定在无干预措施、洛贝林20μM、维拉帕米20μM干预下HCT-8/VCR细胞内罗丹明123的积聚浓度。统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析。结果:通过MTT法求得上述实验条件下细胞生长抑制率,表明不同浓度的长春新碱和5-氟尿嘧啶对HCT-8/VCR细胞株具有抑制作用,其抑制作用与浓度呈正相关;加洛贝林干预后,HCT-8/VCR细胞株对长春新碱和5-氟尿嘧啶的敏感性增加;罗丹明123排出实验示经洛贝林处理的HCT-8/VCR细胞内罗丹明123的荧光强度高于未经处理的细胞内荧光强度,且细胞内罗丹明123的荧光强度与洛贝林的浓度呈正相关;流式细胞术显示,20μM洛贝林的逆转MDR的有效率是20μM维拉帕米有效率的68%。结论:洛贝林可以逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对VCR和5-FU的耐药性。洛贝林可以增加人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR细胞内的罗丹明123的荧光强度,抑制P-gp的外排。
樊红琼[9]2008年在《抑制细胞外信号调节激酶对叁氧化二砷诱导K562/A02细胞凋亡的作用》文中进行了进一步梳理多药耐药或多药抗性(multidrug resistance,MDR)系指肿瘤细胞对结构和作用靶点不同的多种化疗药物有交叉耐药性,为化疗失败主要原因之一。叁氧化二砷(AS_2O_3)能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,只杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞,对急性早幼粒细胞性白血病,其它类型的白血病以及许多恶性肿瘤都有良好的疗效。AS_2O_3是一种细胞原浆毒,与含琉基蛋白结合后,可抑制蛋白活性,干扰蛋白的正常结构和功能,因此在对肿瘤多药耐药细胞作用过程中,AS_2O_3可抑制膜转运蛋白功能,阻止药物外排,诱导耐药细胞凋亡,从而逆转其耐药性。MAPK通路是连接细胞外刺激和细胞内基因表达的桥梁,在肿瘤化疗耐药中发挥着重要作用。其中,细胞外信号调节激酶(extracellular regulated Kinase,ERK)是经典的MAPK通路,包括ERK1(P44)和ERK2(P42),可以被生长因子激活,促进细胞的生长和增殖,目前大多数研究表明,ERK信号通路的过度激活,与许多肿瘤的化疗的耐药存在明显的正相关。因此研究ERK信号通路在AS_2O_3诱导耐药细胞凋亡的过程中的作用,为难治、复发及耐药的白血病患者的临床治疗提供理论和实验依据。实验目的:通过检测抑制细胞外信号调节激酶(ERK)对叁氧化二砷(AS_2O_3)诱导人白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞凋亡效应有无影响,探讨ERK信号通路在AS_2O_3诱导白血病多药耐药细胞凋亡的信号转导途径中的作用。实验方法:实验前两周将K562/A02细胞置于无阿霉素(Adriamycin,ADM)的培养基中培养,取对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞用于实验。以K562细胞为对照组(K562细胞+ DMSO),K562/A02细胞为实验组。实验组分为空白对照组(K562/A02细胞+DMSO)、单用AS_2O_3组(K562/A02细胞+DMSO+AS_2O_3)、单用ERK抑制剂组(K562/A02细胞+U0126)、AS_2O_3与ERK抑制剂合用组(K562/A02细胞+ AS_2O_3+U0126)。应用噻唑蓝(MTT)比色法、普通光镜和流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡的效应和细胞周期分布的情况;逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)方法检测mdrl,Survivin和caspase-3 mRNA的表达;Western-blot法检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2及Survivin蛋白的表达变化情况。实验结果:MTT结果显示:AS_2O_3可抑制K562/A02细胞增殖,呈浓度依赖性和时间依赖性(R24h=0.81,R48h=0.86,R72h=0.90,P<0.01);单用ERK抑制剂也可抑制K562/A02细胞增殖,但作用不明显,且无浓度依赖性和时间依赖性;二者合用细胞生长抑制率显着增加。细胞周期分析示:单用AS_2O_3组诱导细胞发生G2/M期,合用组发生G0/G1期阻滞(P<0.05);annexin-Ⅴ法测细胞凋亡结果提示:AS_2O_3+ERK抑制剂组凋亡率显着高于空白对照组、单用AS_2O_3组、单用ERK抑制剂组及单用AS_2O_3组和单用ERK抑制剂组的凋亡率之和(P<0.05)。RT-PCR结果显示: 5μmol/L AS_2O_3作用48h后,mdr1和Survivin mRNA水平降低,caspase 3 mRNA水平升高。单用ERK抑制剂组,mdr1和Survivin mRNA水平降低,而caspase-3 mRNA水平无显着变化。合用组较空白对照组、单用AS_2O_3组、单用ERK抑制剂组,mdr1和Survivin mRNA水平显着降低,caspase 3 mRNA水平显着升高。weatern-blot结果显示:各实验组总的ERK表达水平无明显变化,而磷酸化ERK水平,单用AS_2O_3组较空白对照组略有增高,而单用抑制剂组较空白对照显着降低,合用组较空白对照、单用抑制剂组均显着降低。合用组Survivin蛋白表达水平显着降低。实验结论:1.AS_2O_3以时间-剂量依赖方式抑制K562/A02细胞增殖,并且诱导凋亡,诱导K562/A02细胞G2/M期细胞周期阻滞,下调耐药细胞mdr1和Survivin表达活化caspase-3,启动了细胞凋亡过程,但同时却激活了ERK1/2信号通路。2.单独应用U0126可抑制K562/A02细胞增殖,显着抑制ERK1/2信号通路的活性,诱导细胞发生G1/G0期阻滞;下调耐药细胞mdr1和Survivin表达。但无明显诱导凋亡的作用。3.AS_2O_3与ERK抑制剂合用可协同抑制K562/A02细胞增殖并诱导其凋亡,诱导细胞发生G1/G0期阻滞,协同下调耐药细胞mdr1和Survivin表达并活化caspase-3。提示ERK1/2通路可能参与了AS_2O_3诱导K562/A02细胞的凋亡的过程并发挥重要作用,抑制该通路可增强AS_2O_3诱导耐药细胞凋亡的敏感性。
张帆[10]2009年在《细胞凋亡抑制蛋白2在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌吉西他滨化疗的关系》文中研究表明目的本研究观察细胞凋亡抑制蛋白2(cell inhibitor of apoptosis protein 2,C-IAP2)在胰腺癌组织以及胰腺癌细胞中的表达情况并分析其与病理分级、临床分期之间的关系,并进一步阐明C-IAP2的表达与吉西他滨化疗促胰腺癌凋亡作用和胰腺癌吉西他滨化疗耐药的关系。方法1.收集本院普通外科2005年8月至2008年3月手术切除的胰腺癌组织标本32例,癌旁正常胰腺组织标本18例,运用免疫组织化学染色方法观察C-IAP2在胰腺癌组织以及癌旁正常胰腺组织的表达情况,分析C-IAP2的表达水平与胰腺癌组织的病理分级和临床分期之间的关系。Western blot进一步观察C-IAP2在低分化的胰腺癌PANC-1细胞、中分化的胰腺癌AsPC-1细胞、高分化的胰腺癌BxPC-3细胞中的表达情况,分析C-IAP2的表达水平与胰腺癌细胞的病理分级之间的关系。2.研究吉西他滨体外诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡作用和分子机理,MTT比色法测定细胞增殖活性,透射电子显微镜观察凋亡细胞形态,AnnexinV-PI双标记法流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR分析细胞C-IAP2的mRNA表达,Western blot法检测不同浓度吉西他滨作用后C-IAP2、第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)、Bcl(B cell lymphoma)-2和Bax的表达变化,分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性。3.采用间歇浓度梯度递增法诱导胰腺癌PANC-1细胞株对吉西他滨耐药,检测其生物学性状变化,免疫荧光和免疫印迹法对比观察C-IAP2活性变化。结果1.C-IAP2在胰腺癌组织均有表达(32/32,100%)、癌旁正常胰腺组织(8/18,44.4%)中有表达,胰腺癌组织中表达水平显着强于癌旁正常胰腺组织。C-IAP2的表达强度在不同分化程度的肿瘤组织中的差异有统计学意义(P <0.05)。C-IAP2在低分化的胰腺癌细胞PANC-1中呈高表达,而在中分化和高分化的胰腺癌细胞AsPC-1和BxPc-3中表达较低(P <0.05)。2.MTT比色法测定显示:吉西他滨抑制人胰腺癌细胞株PANC-1增殖,呈浓度依赖性;其IC50值为5.79ug/ml。AnnexinV-PI双标记法FCM分析、透射电子显微镜观察的结果证实:吉西他滨具有诱导人胰腺癌PANC-1细胞株凋亡作用。RT-PCR分析发现吉西他滨能显着下调PANC-1细胞C-IAP2的mRNA表达,Western blot分析发现吉西他滨能显着下调胰腺癌细胞PANC-1的C-IAP2、Bcl-2蛋白表达水平,上调Smac、Bax蛋白表达水平,分光光度法分析发现吉西他滨作用后胰腺癌PANC-1细胞的Caspase-3、Caspase-9活性显着升高。3.药物培养3个月后,得到稳定传代的PANC-1/Gem耐药细胞株,其形态学、生长特征等均发生了明显变化,细胞变圆、体积缩小、颗粒样物质增多及细胞倍增时间延长,对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素的耐药性均显着增加;耐药细胞PANC-1/Gem的C-IAP2的蛋白表达水平也明显增高。结论1.C-IAP2在胰腺癌组织中的表达水平以及阳性率均显着高于癌旁的正常胰腺组织,推测C-IAP2的表达升高可能在胰腺癌的发生中起一定作用。C-IAP2的表达强度在不同分化程度的肿瘤组织和细胞中的差异有统计学意义,通过检测术后组织标本中C-IAP2的表达有可能对胰腺癌的恶性程度作出预测。2.吉西他滨可诱导人胰腺癌细胞PANC-1凋亡,作用与其下调凋亡抑制因子C-IAP2、Bcl-2表达水平,上调促凋亡因子Smac、Bax表达水平,活化Caspase- 3、Caspase-9有关。3.间歇浓度梯度递增法可诱导胰腺癌PANC-1细胞株对吉西他滨耐药,PANC-1/Gem有多药耐药现象,C-IAP2在耐药过程中起一定作用。
参考文献：
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[9]. 抑制细胞外信号调节激酶对叁氧化二砷诱导K562/A02细胞凋亡的作用[D]. 樊红琼. 吉林大学. 2008
[10]. 细胞凋亡抑制蛋白2在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌吉西他滨化疗的关系[D]. 张帆. 福建医科大学. 2009
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