陈永红[1]2001年在《丹酚酸B保护线粒体和抗神经细胞凋亡作用及其作用机制研究》文中研究表明目前研究表明，线粒体损伤及细胞凋亡在多种神经系统疾病，如急慢性缺血性脑损伤，Alzheimer’s病(AD)、Parkinson’s病(PD)、Hungtington’s(HD)病的发病机制中发挥着重要的作用。线粒体不仅是细胞内能量的主要来源，而且是细胞内自由基的主要产生地。此外，线粒体还可以通过多种途径参与细胞凋亡过程，包括释放Caspase激活因子(细胞色素C)、改变电子传递、使膜电位丧失、细胞氧化还原状态改变、参与前凋亡或抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的形成。因此寻找有效的保护线粒体、抑制细胞凋亡的药物，可以改善能量代谢，降低自由基损伤，减少细胞凋亡，从而对多种神经系统疾病发挥治疗作用。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是由传统中药一丹参内提取出来的有效成分。体内外实验表明，它具有良好的抗氧化作用。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型和6-OHDA诱导Caspase 3高表达PC12细胞凋亡模型，应用行为学、生化、组化、细胞生物和分子生物等实验方，法，从整体、线粒体、细胞和分子水平等诸多方面观察了Sal B对线粒体功能的保护和抗细胞凋亡作用，并探讨其作用的可能机制。 第一部分：丹酚酸B对大鼠缺血再灌注脑损伤模型的保护作用 采用栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察丹酚酸B对大鼠行为学，缺血大脑皮层能量物质ATP、葡萄糖无氧酵解产物以及体内自由基清除剂SOD、GSH和脂质过氧化产物MDA等生化物质的影响。结果表明，大鼠脑缺血前10min静脉注射丹酚酸B 10mg／kg可明显改善由缺血再灌注脑损伤所致的神经症状异常，降低脑缺血再灌注大鼠休克指数，使其在倾斜板上停留的时问延长。同时，丹酚酸B 10mg／kg还可对脑能量代谢产生有益影响，使缺血大脑皮层内ATP含量升高，乳酸堆积减少；
胡利民[2]2004年在《冰片及配伍对血脑屏障通透性的影响和脑保护作用机制研究》文中研究指明目的 研究冰片对血脑屏障(BBB)的影响，探讨冰片促进其他物质透过血脑屏障的方式，并研究冰片、冰片与丹参叁七水溶性组分配伍对缺血性脑损伤的脑保护作用。方法1． 采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)和星形胶质细胞(AS)共培养方式建立体外BBB模型，以跨内皮细胞电阻(TEER)、γ-谷胺酰胺转肽酶(γ-GT)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测及紧密连接相关蛋白ZO-1蛋白免疫组化染色方法，验证该模型的BBB特征，比较其与单层BMEC模型的差别，应用该模型观察冰片对BBB及丹酚酸B通透性的影响，RT-PCR法检测了冰片及与丹酚酸B对BBB模型编码P-糖蛋白基因Mdr1a、Mdr1b mRNA表达的影响。2． 线栓法复制大鼠MCAO缺血2h再灌注损伤模型，随机分为冰片组、丹参叁七合剂组、丹参叁七合剂加冰片组和模型组，每组于再灌注后即刻、24h、48h、72h灌胃给药冰片、丹参叁七合剂(丹酚酸B与叁七总皂苷组分组成)、丹参叁七合剂加冰片、溶媒CMC-Na，以正常大鼠为对照组，每组分别于再灌注24h、48h、72h末次给药后处死取材，免疫组化法观察脑组织神经营养因子NGF、BDNF、GDNF、bFGF、VEGF蛋白的表达部位，RT-PCR法检测缺血侧脑组织NGF、BDNF、GDNF、bFGF、VEGFmRNA的表达。结果1． 成功培养了大鼠BMEC，应用细胞共培养池，建立了BMEC和AC两种细胞共培养BBB模型。跨内皮细胞电阻(TEER)、γ-谷胺酰胺转肽酶(γ-GT)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测及紧密连接相关蛋白ZO-1蛋白免疫组化观察表明，该模型基本具备BBB特征，较单层BMEC屏障模型更接近在体状态；2． 5ug／ml冰片作用于BBB模型，60min及24h内TEER值无明显改变，冰片与丹酚酸B共同作用于BBB模型24h，模型Mdr1a mRNA表达明显下调，而二者分别应用时无此作用。3． 在大鼠MCAO再灌注损伤模型，冰片在再灌注72h时可明显使NGF、BDNF、GDNF、bFGF、VEGFmRNA表达上调;与丹参叁七配伍屁丽赢蔽中文摘要VEG而RNA结论72h时GDNF、表达上调，并明显抑制再灌注48h时bFGF、BDNF、NGFmRNA表达的下调。·手功建立了由脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养体外血脑屏障模型;冰片对血脑屏障紧密连结无直接开放作用;冰片与丹酚酸B联合应用抑制脑微血管内皮细胞上影响其对药物的外排作用，P一糖蛋白基因表达，可能是其促进其他物质透过血脑屏障的机制之
方蕾[3]2009年在《丹酚酸B抑制小鼠脑缺血再灌注炎症反应的机制研究》文中指出脑血管病,隶属中医“中风”、“卒中”之范畴,是一种高致残、高死亡率的常见病,已成为当今危害人类,特别是中老年人健康的重症疾病之一。缺血性脑血管病在脑血管病的发病中占60%-80%。临床治疗以溶栓为主,但在恢复缺血的脑组织血供的同时,有时却造成再灌注损伤,其发生机制与细胞内能量代谢障碍、Ca~(2+)超载、活性氧、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、一氧化氮的细胞毒作用、炎症反应、细胞凋亡等因素有关,这些因素相互影响或互为因果,最终导致神经细胞死亡。其中脑缺血过程中的炎症反应越来越受到人们的关注。传统中医认为缺血性中风系由于本虚,产生风火痰瘀,导致脑络闭阻而发病。以气虚血瘀、痰瘀互阻、痰热腑实、毒损脑络、气血逆乱为病机特点。临床中医治疗中,活血化瘀法对缺血性卒中的治疗作用已得到广泛的认同。现代中药药理研究表明,活血化瘀中药具有扩张血管、改善循环血量、抑制血小板凝聚、溶栓、保护缺血脑组织等作用。丹参是临床常用的活血化瘀药,国内广泛应用于心脑血管疾病的治疗。丹参的化学成分主要可分为水溶性成分和脂溶性成分两大部分,其中丹酚酸B(SalB)是丹参的主要水溶性成分,为叁分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。大量研究已证明,SalB具有抗氧化和清除自由基、改善脑血流和脑能量代谢、维持脑血管内皮细胞功能以及减少神经元凋亡等作用,通过这些环节,对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。因此,深入探讨SalB防治缺血性脑血管病的作用机制,将为临床应用提供可靠的实验依据。目的:复制小鼠脑缺血再灌注模型,探讨SalB对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响及作用机制。方法:采用NIH小鼠随机分假手术组、模型组、尼莫地平组(Nim)和SalB组。模型组:尾静脉注射5mL/kg生理盐水,30 min后腹腔注射水合氯醛麻醉,颈正中切口,分离双侧颈总动脉,在腹腔注射硝普钠(2.25 mg/kg)的同时迅速用动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min,然后松开动脉夹再灌注6h、12h。假手术组:模型复制同模型组,但腹腔不注射硝普钠,双侧颈总动脉不夹闭。Nim组和SalB组模型复制前尾静脉分别注射Nim(1 mg/kg)和SalB(22.5 mg/kg),作为阳性对照与中药治疗,余同模型组。以上各组分别于脑缺血再灌注6h、12h取血与脑组织,干湿重法测定脑含水量、脑指数,脑组织HE染色观察脑皮质形态学改变,放射免疫法测定血浆血栓素B_2(TXB_2)、6-酮-前列腺素F1_α(6-keto-PGF1_α)、脑组织白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α),免疫组化法观察脑皮质细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素的表达。结果:1.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑含水量和脑指数的影响模型组随着脑缺血再灌注时间的延长,脑含水量和脑指数呈上升趋势,与假手术组相比有显着性差异(P＜0.01);用SalB和Nim治疗,脑含水量和脑指数均降低,尤其在再灌注12h时,与模型组相比有显着性差异(P＜0.01)。2.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质病理形态学的影响假手术组小鼠脑皮质神经细胞形态结构正常,血管壁完整。再灌注6h模型组神经细胞水肿,再灌注12h时加重,可见神经细胞核深染,核周及血管周空隙显着增大,间质亦有水肿;SalB组和Nim组再灌各时间点,神经细胞水肿和血管水肿均明显减轻。3.SalB对小鼠脑缺血再灌注血浆TXB_2和6-keto-PGF1_α的影响与假手术组相比,模型组6h、12h血浆TXB_2含量明显升高(P＜0.01),而6-keto-PGF1_α含量有降低的趋势,TXB_2/6-keto-PGF1_α比值显著升高(P＜0.01);与模型组相比,Nim和SalB均可降低TXB_2含量,其中SalB效果更为明显(P＜0.01);再灌注6h Nim组血浆6-keto-PGF1_α含量升高(P＜0.05),SalB组各时间点血浆6-keto-PGF1_α含量有升高的趋势,两组TXB_2/6-keto-PGF1_α降低均显著(P＜0.01)。4.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑组织TNF-α、IL-1β的影响在脑缺血再灌注不同时点,模型组小鼠脑组织TNF-α、IL-1β的含量均高于假手术组(P＜0.01或P＜0.05);SalB可不同程度的降低再灌注后TNF-α、IL-1β含量,IL-1β含量的降低则更为显著(P＜0.01);再灌注6h Nim组TNF-α含量明显降低(P＜0.01)。5.SalB对小鼠脑缺血再灌注脑皮质ICAM-1、P-选择素的表达光镜观察,假手术组小鼠脑皮质中ICAM-1、P-选择素表达较少;模型组ICAM-1、P-选择素阳性反应增加,主要表达于脑微血管内皮细胞,表现为血管壁棕黄色线样深染,图像分析显示,平均光密度值显着增加(P＜0.01);SalB组和Nim组再灌各时间点,ICAM-1、P-选择素阳性反应不明显,图像分析亦显示,ICAM-1的表达在再灌各时间点明显减少(P＜0.01),P-选择素的表达在再灌注12h下降尤为明显(P＜0.01)。结论:SalB能够减轻脑水肿,其机制可能与降低TXB_2含量、TXB_2/6-keto-PGF1_α、促炎因子IL-1β、TNF-α含量及黏附分子ICAM-1、P-选择素的表达,从而抑制炎症反应有关。
王秋华[4]2006年在《丹酚酸B对脑缺血小鼠脑组织能量代谢变化的影响》文中认为脑卒中是当前老年人致残致痴的主要原因之一,据WHO公布的资料,在57个国家中,有40个国家把卒中的死亡率列入了前叁位,其中在日本和中国卒中的死亡率已占首位。而缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的60%-70%。探讨缺血后脑组织不同程度的损伤和防治已经成为医学界研究的热门。缺血性脑卒中,属于中医缺血性“中风”的范畴,中医认为,中风主要是由“风、火、痰、湿、瘀”五大主因引起。其中,痰瘀阻滞引起脑组织缺血是一类重要原因,而现代医家更是将中风的致病因素归为“毒邪”致病。西医认为缺血性中风是由于脂质代谢障碍如高血脂和高血黏度形成脑动脉粥样硬化,导致血栓形成,从而引起脑栓塞,造成血液循环障碍形成部分脑组织缺血、水肿等病理变化,导致神经功能障碍,出现一系列中风病的表现。因此研究脑缺血早期脑组织损伤的病理生理机制对于有效防治缺血性脑中风有着重要的临床意义。缺血性脑损伤的病变机制十分复杂,而能量代谢障碍被认为是缺血性神经细胞损伤较早的使动因素。主要表现在线粒体形态结构及功能的改变,高能磷酸化合物ATP的耗竭,由此导致能量依赖的离子泵功能的改变、兴奋性氨基酸的生成增多,脑组织水肿,最终导致神经原的坏死。丹参是唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bunge的根,它的主要功效有祛瘀止痛,活血通经,清心除烦,用于月经不调,经闭痛经,症瘕积聚,胸腹刺痛,疮疡肿痛,心烦不眠,肝脾肿大,心绞痛。而它的活血化瘀功效更是被用于心脑缺血疾病的预防和治疗。近几十年来,采用现代医学方法,结合化学,分子生物学和细胞生物学等多学科的技术手段,对丹参进行了较系统的研究,取得了大量新的实验结果和认识,并开发出一系列疗效好的临床应用药物。丹参水溶性有效成分,特别是丹酚酸类化合物,受到医学家的极大重视。它在丹参中含量高活性大且可以通过血脑屏障,是治疗脑缺血理想的药物。以往实验研究表明,丹酚酸B(SalB)有很强的的抗脂质过氧化和清除自由基的作用以及降低血液黏稠度的作用。本实验复制低血压小鼠脑缺血模型,观察SalB对缺血所致脑组织能量代谢障碍的影响。本论文由文献综述和实验研究两部分组成。综述1主要介绍缺血性脑损伤能量代谢障碍的研究进展,其中包括脑组织正常的能量代谢,脑缺血后线粒体功能以及能量代谢障碍导致脑组织损伤病理生理的机制,同时介绍了中医药对脑缺血后能量代谢障碍引起的脑组织损伤治疗的现代研究进展。综述2详细介绍了中药单体丹酚酸B对脑缺血治疗作用的实验研究进展,包括其抗氧化作用、对血液流变学的改变及对物质代谢等方面的作用。以上两篇综述为SalB对脑缺血小鼠脑能量代谢变化的影响的实验研究提供了理论基础和实验资料。实验研究分叁部分:实验一观察SalB对脑缺血小鼠脑组织含水量和形态的变化。将NIH小鼠随机分为:
张均田[5]2007年在《丹酚酸B防治神经退行性疾病的研究进展》文中提出实验证明,丹酚酸类化合物具有很强的抑制脂质过氧化、清除超氧阴离子和羟基自由基的作用。其中丹酚酸A和B活性最强。丹酚酸B对脑缺血-再灌注损伤所致线粒体损伤和神经细胞凋亡有明显抑制作用,可抗Caspase-3高表达PC12细胞的凋亡,还可抑制β淀粉样蛋白(Aβ1~40)纤维形成及Aβ1~40所致PC12细胞线粒体损伤和细胞凋亡。该药属强抗氧化药,且能消除细胞内钙超载,在治疗神经退行性疾病方面具有重要的理论意义和实用价值。
何婷婷[6]2015年在《丹酚酸B对局灶性脑缺血小鼠抑制自噬及凋亡机制的研究》文中认为目的:脑血管病是导致我国成人残疾和死亡的第一原因,其中以缺血性脑血管病最为常见。脑缺血后继发性脑损伤是病情加重及影响预后的重要原因,氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及线粒体功能异常、钙超载、兴奋氨基酸毒性、自噬等因素均有参与。缺血性脑血管病机制复杂不明,目前缺乏有效治疗手段,是亟待解决的医学问题。急性局灶脑缺血中,氧化应激可介导梗死区域继发性神经元死亡。自噬在缺血再灌注情况下是一把双刃剑,细胞可启动适度的自噬来清除受损细胞器及异常折迭蛋白质,对细胞起到重要的保护作用,但不完全或过度自噬现象可能导致细胞死亡。近来越来越多的实验证据表明,氧化应激能诱导自噬的发生,并且,应用抗氧化剂能抑制自噬并减少细胞死亡。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是一种提取自丹参的水溶性单体成分,具有强大的抗氧化作用及其他多种生物学活性。Sal B可以通过抑制凋亡的机制保护缺血心肌细胞,也有文献报道Sal B可通过抑制自噬来保护饥饿状态的心肌细胞。本实验旨在研究Sal B这一氧自由基清除剂对急性期局灶性脑缺血小鼠是否存在脑保护作用,且其作用机制是否为抑制凋亡及自噬水平。方法:采用雄性CD1小鼠(体重25-30g),应用改良Longa法建立小鼠右侧p MCAO模型。实验分为叁部分:实验一:探究Sal B对急性期局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用小鼠随机分为4组:Sham组(Sham+生理盐水)、p MCAO组(p MCAO+生理盐水)、丹酚酸B低剂量组(p MCAO+Sal B 10mg/kg,Sal-L)、丹酚酸B高剂量组(p MCAO+Sal B 25mg/kg,Sal-H)。各组小鼠按照统一标准进行麻醉与造模,造模成功后,药物干预组即刻腹腔注射Sal B,Sham组和p MCAO组用则给予等量生理盐水。术后24 h采用Longa法及Clark法对小鼠进行神经功能缺损评分。评分完毕后将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用TTC染色法测定脑梗死体积,用伊文斯兰染色法测定血脑屏障通透性,用western blot测定紧密连接蛋白Claudin-5的含量,用尼氏染色法测定梗死交界区神经细胞损伤情况,用电镜观察超微结构改变(梗死皮层超微结构如自噬体的形成、细胞凋亡情况和微血管损伤情况等)。实验二:局灶性脑缺血小鼠各因子分区表达对Sham及p MCAO组小鼠于术后24h行免疫组织化学染色测定LC3、beclin1、p62、bcl2、bax、Caspase-3的阳性细胞分布情况及计数情况。行免疫荧光染色观察beclin1及Caspase-3是否存在共标。观察western blot测定PGC-1α及Sirt1的分区表达。实验叁:Sal B脑保护作用机制的探究首先,根据因子分区表达情况选定测定的分区:LC3、beclin1、p62于梗死周边区观察;bcl2、bax、cleaved Caspase-3于梗死中心区观察。应用western blot及RT-q PCR进行测定Sham组、p MCAO组、Sal-L组、Sal-H组相应分区各因子的蛋白、m RNA含量的变化。对不同分区凋亡相关信号通路重要因子MAPKs及能量代谢通路重要因子PGC-1α及Sirt1行western blot及RT-q PCR测定其蛋白、m RNA含量的变化。用DHE染色测定梗死侧皮层ROS的生成量,分别应用MDA含量及SOD活力试剂盒测定梗死皮层脂质过氧化程度及机体清除氧自由基的能力。总之,分别从凋亡、自噬、氧化应激叁方面探讨丹酚酸B脑保护作用机制。结果:1丹酚酸B对急性期局灶性脑缺血小鼠具有保护作用1.1丹酚酸B改善行为学评分p MCAO术后24 h,分别采用Longa法及Clark法对各组小鼠进行行为学评分,对此采用Mann-Whitney U检验统计并分析结果。采用Longa评分法及Clark评分法时,与p MCAO组相比,Sal-L组和Sal-H组的神经功能评分明显改善,且差异具有统计学意义(P<0.01)。1.2丹酚酸B降低脑梗死体积p MCAO术后24 h,Sal-L组和Sal-H组因药物干预梗死体积明显减小,且差异具统计学意义(Sal-L组和Sal-H组vs.p MCAO组:51.09%±12.65%和34.31%±7.93%vs.65.94%±2.96%,P<0.05)。1.3丹酚酸B保护血脑屏障1.3.1丹酚酸B减轻脑水肿:p MCAO术后24 h,Sal-L组和Sal-H组梗死侧脑组织含水量较p MCAO组明显减少(P<0.05)。1.3.2丹酚酸B降低血脑屏障通透性:局灶性脑缺血后24h,Sal-L组和Sal-H组右侧大脑半球脑组织伊文斯兰含量均明显低于p MCAO组(P<0.05)。1.3.3丹酚酸B上调Claudin5表达:局灶性脑缺血后24h p MCAO组右侧大脑半球Claudin5蛋白表达量降低,与Sham组比较有差异(P<0.05)。p MCAO组左侧半球与Sham组的Claudin5蛋白含量无统计学差异。应用Sal B干预后,Claudin5含量增加,紧密连接崩解减少,血脑屏障受到保护。1.3.4丹酚酸B保护血脑屏障超微结构取右侧大脑半球皮层行电镜检测,结果显示:除Sham组外均有不同程度内皮细胞受损,细胞核增大,紧密连接开放,基底膜模糊,可见红细胞阻塞微血管,管周有液体渗出,周围脑组织细胞水肿。p MCAO组最为严重,周围组织高度水肿;Sal-H组较p MCAO组管周液体渗出减少,紧密连接较完好且基底膜更为完整。1.4丹酚酸B减少神经细胞损伤1.4.1丹酚酸B增加尼氏染色中存活细胞数目,Sal-L组和Sal-H组较p MCAO组存活细胞数目增多(P<0.05)。1.4.2丹酚酸B改善组织超微结构,同时还可观察到局灶性脑缺血后的自噬现象,p MCAO组小鼠梗死灶周围皮层可见直径平均500nm的双层膜的自噬小体。2局灶性脑缺血后不同区域因子表达变化不同2.1 p MCAO及Sham术后24小时,Caspase-3、bax、bcl2的免疫组织化学结果显示Sham组bax及Caspase-3表达量很少,bcl2作为抗凋亡因子在正常组织中有一定程度的表达。梗死对侧皮层组各因子阳性细胞数计数与Sham组无明显差异;梗死中心皮层组Caspase-3及bax表达明显上升,阳性细胞数目显着增多(Core vs.Sham,P<0.05),bcl2表达明显下调,阳性细胞数目减少(Core vs.Sham,P<0.05);梗死周边皮层组Caspase-3及bax表达有所上调且有统计学意义(P<0.05)但幅度远小于梗死中心皮层,bcl2表达上调且阳性细胞数增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。pMCAO组中,梗死中心皮层组各自噬相关指标几乎未见阳性细胞,与Sham组有显着差别,梗死对侧皮层组自噬相关指标阳性细胞数目与Sham组相比无统计学差异。梗死周边皮层自噬水平显着提高,LC3、beclin1及p62表达均显着上升(P<0.05)。2.2免疫荧光显示beclin1+与Caspase-3+细胞有明显分界,未观察到存在了beclin1+/Caspase-3+细胞。2.3脑缺血组织分区:将脑皮层分为梗死对侧皮层(Contralateral),梗死周边皮层(Pericore)及梗死中心皮层(Core)。Core组PGC-1α及Sirt1蛋白表达水平较sham组明显下调,pericore组及contralateral组则较sham组上升。3丹酚酸B脑保护作用机制的探究3.1丹酚酸B的抗氧化作用:Sal B通过清除ROS、降低梗死半球脑组织MDA含量并恢复SOD活性来抗氧化。3.2丹酚酸B的抗凋亡作用:术后24小时,western blot结果显示Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值较Sham组明显升高。Sal-L组和Sal-H组较p MCAO组的Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值明显降低。RT-q PCR结果符合组织化学染色结果。用药后,Sal-L和Sal-H的Caspase-3及bax基因表达降低且有统计学差异。3.3丹酚酸B抑制自噬的作用自噬相关指标在蛋白表达层面包括LC3II/GADPH、beclin1/GADPH及p62/GADPH;其相对应基因表达层面包括MAP1LC3b/ACTB、BECN1/ACTB及SQSTM1/ACTB。低剂量的Sal B干预可明显降低各个指标的表达量,高剂量效果较之稍逊色。与western blotting结果一致,p MCAO组各指标m RNA的表达较Sham组明显增加。与p MCAO组相比,Sal-L组各指标的表达量明显减少,高剂量较之效果逊色,与Western blot结果一致。3.4丹酚酸B下调梗死中心皮层p-p38及p-erk1/2表达3.5丹酚酸B上调梗死周围皮层Sirt1-PGC-1α通路的蛋白及基因表达结论:Sal B对急性期局灶性脑缺血小鼠的具有脑保护作用,可以改善神经功能缺损评分(Longa法及Clark法),降低梗死体积,保护血脑屏障,增加增加尼氏染色中存活细胞数目以及改善组织超微结构。局灶性脑缺血中可观察到细胞自噬现象,可见典型自噬体形成及自噬溶酶体的形成,也可观察到典型的细胞凋亡。免疫组织化学检测自噬相关因子及凋亡相关因子的表达及分布,发现两者分布不同。自噬相关指标于梗死周边皮层表达上调(如LC3及beclin1),凋亡相关指标主要于梗死中心皮层明显变化(如cleaved Caspase-3及bax上调,bcl2下调),且Beclin1及Caspase-3进行双标免疫荧光染色时未见共标。说明应分区讨论于是取不同部位皮层进行蛋白及基因水平检测。Sal B可于pericore区抑LC3II及beclin1表达,但p62表达也减少并未堆积,说明自噬水平虽然降低,但自噬溶酶体仍能降解底物,说明Sal B抑制了过度激活的自噬水平。Sirt1-PGC-1α也在此区域明显激活,有利于能量代谢顺利进行,减少损伤的线粒体,从而减低自噬的刺激物。自噬水平的降低可能是由于Sirt1-PGC-1α激活致使ROS生成减少所致。Sal B可于core区抑制凋亡,bax/bcl2及cleaved Caspase-3下调。此抗凋亡作用可能是通过p-erk1/2及p-p38的蛋白表达下调所致。
赵旭, 范英昌, 郭茂娟, 徐秀梅[7]2008年在《丹酚酸B抗神经细胞凋亡的实验研究》文中提出目的观察丹酚酸B对大鼠局灶性脑缺血再灌注时神经细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法健康雄性Wistar大鼠39只,随机分为3组,即假手术组、模型组和丹酚酸B组;线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型;分别采用原位细胞凋亡检测技术和免疫组化方法,利用病理图像分析系统测定脑组织细胞凋亡指数(AI)以及bcl-2和bax蛋白表达量,应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠脑组织bcl-2和bax mRNA相对表达量。结果丹酚酸B组AI较模型组降低,bcl-2表达增加,bax表达减少。结论丹酚酸B能上调bcl-2表达同时下调bax表达,这可能是其抗神经细胞凋亡的作用机制之一。
荀翀[8]2014年在《丹酚酸B在脊髓损伤中的作用及其相关机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：目前，脊髓损伤是医学研究比较重要的领域之一，其发病率居高不下，由此而引发的高致残率以及死亡率逐渐受到国内外医学专家的热议。急性脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤两个病理过程，脊髓的继发性损伤可以很明显的加重原发性损伤，引起更为严重的神经功能障碍。脊髓原发性损伤发生时是没有任何征兆的，因此如何抑制脊髓继发性损伤已经成为脊髓损伤领域研究的主要焦点。脊髓继发性损伤的病理过程包括一系列的分子和细胞反应通路，这些分子事件导致了继发性损伤的发生和发展。自由基的过量产生是脊髓继发性损伤的原因之一。脊髓微循环障碍的发生和局部血流减少导致了自由基的过量产生，并由此引起细胞膜的脂质过氧化反应。研究表明细胞膜对于维持细胞的结构和正常新陈代谢具有非常重要的作用。在细胞膜中存在的大量不饱和脂肪酸发生氧化会导致细胞结构发生变化，过量的自由基攻击与脂质过氧化反应是造成这种现象的主要原因，甚至会导致细胞退化和坏死。急性脊髓损伤发生时神经元细胞和髓鞘亚细胞的细胞膜会发生一系列的病理改变，从而影响到细胞的正常代谢功能。炎症反应是脊髓继发性损伤中的主要因素之一，在病理学中也将其作为核心内容来进行研究。炎症反应与基因表达密切相关。NF-κB是转录因子蛋白家族成员之一，被认为是炎症基因表达的关键调节因子。其在中枢神经系统损伤过程中，可以调节多种细胞因子的表达，对炎症反应具有调节作用。通常情况下， NF-κB和IκB以复合体的形式存在于细胞的胞浆中。IKKs是NF-κB激活的主要蛋白激酶，IKKβ亚基是IKKs的主要催化亚基。它会促使细胞胞浆内的NF-κB和IκB复合体发生反应，使其具有活性，这种活化作用是通过IκB的磷酸化来完成的。当NF-κB被激活后，NF-κB的核定位位点就显露出来。在这种情况下，胞浆中的NF-κB就能够很快的进入细胞核，与特异性κB序列发生作用，这对细胞的基因转录会造成很大影响，导致基因转录发生变异，进而形成巨量的促炎因子和自由基，从而使细胞发生病变。目前SCI临床抗炎症反应药物仅有甲强龙。但甲强龙大剂量和较长时间使用常引起抵抗力下降、肝功能损害、免疫抑制、骨坏死等副作用。随着科学技术的发展，近年来多种传统中药的有效药物成分被提取出来，并广泛应用于脊髓损伤的体内体外实验，取得了良好的效果。丹参是我国传统中草药，目前其两种水溶性有效成分也已经被提取出来。这两种成分分别是丹酚酸B和丹参酮IIA。其中丹酚酸B已经在心脏缺血再灌注、脑缺血再灌注和肝脏纤维化等研究中被证实有具有抗氧化消除自由基、抗炎、抗肿瘤等药理作用。但在脊髓损伤中的作用尚不明确。本次实验我们拟通过行为学观察，来分析丹酚酸B对大鼠急性脊髓损伤后后肢运动功能障碍恢复的促进作用，并研究其在脊髓损伤中对IKK/NF-κB信号通路所具有的调节作用。分析丹酚酸B对脊髓损伤后NF-κB表达、IκB磷酸化、IKKβ激酶活性的影响。并通过对超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的含量分析来研究丹酚酸B在脊髓损伤中的抗氧化作用。此外，还对丹酚酸B对抗凋亡基因Bc1-2和促凋亡基因Bax表达的影响进行了分析。希望通过实验证明丹酚酸B在脊髓损伤中具有消除自由基和抗炎作用，以及其在抑制神经细胞凋亡方面所发挥出的积极作用，为将来实现丹酚酸B的临床应用提供理论与实践基础。方法：1、取生长期为7周的健康雌性SD大鼠，体重范围220g-250g。利用改良Allen法制备SD大鼠急性脊髓损伤模型，以胸12椎体为目标打击位置，打击能量设置为25g*cm。2、实验中大鼠随机分为如下叁组：假手术组(仅切除椎板，不损伤脊髓)、丹酚酸B治疗组（术后半小时腹腔注射丹酚酸B10mg/kg）、脊髓损伤组（腹腔注射等量PBS液）。3、观察丹酚酸B对急性脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的促进作用：实验期间术后第1日及每周进行一次BBB评分、斜坡实验和印迹实验，连续4周；术后4周进行游泳实验。4、观测丹酚酸B消除自由基以及减轻过氧化反应作用：在脊髓损伤后24小时处死动物，拟行脊髓损伤区匀浆检测的取1cm脊髓组织，拟行血浆检测的心脏取血。对血浆和损伤区组织中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和一氧化氮的含量进行检测。5、观测丹酚酸B对神经细胞凋亡的影响：在脊髓损伤后24小时将动物处死，然后取其长度为1cm的脊髓样本，运用免疫印迹分析和免疫组织化学来对脊髓损伤后的抗凋亡基因Bc1-2和促凋亡基因Bax进行分析和检测，分别得到两种凋亡基因的表达。6、观测丹酚酸B对IKKβ亚基激酶活性的影响：在脊髓损伤后12小时，将动物处死并将1cm的脊髓组织取出，通过IKKβ亚基激酶光谱法来对丹酚酸B对IKKβ亚基激酶所造成的影响进行测定。7、观测丹酚酸B对NF-κB p65和磷酸化I-κBα的表达所产生的影响，观察MPO活力的变化情况：脊髓损伤后24小时时间点将大鼠处死，以损伤区为中心取长度为1cm的脊髓样本，通过免疫组织化学和western blot法来分析和检测损伤后脊髓组织中磷酸化I-κBα和NF-κB p65的表达，应用MPO活性检测试剂盒检测脊髓标本中MPO活性。8、观察丹酚酸B对脊髓空洞率的影响：实验4周后，处死动物取1cm脊髓组织应用HE染色分析各组脊髓空洞率。结果：1、经过连续4周的实验，BBB评分、斜坡实验、印迹实验和游泳实验结果证实：除术后第1日，在其他各时间点丹酚酸B组大鼠的后肢运动功能障碍相对于脊髓损伤组有很明显的减轻（P<0.05）。但在游泳实验中我们发现丹酚酸B对于大鼠尾部运动功能的提升是非常有限的（P>0.05）。2、术后24小时，脊髓损伤组大鼠血浆及损伤区组织中SOD和GSH-PX活性明显降低；相对于脊髓损伤组，丹酚酸B可以明显提高大鼠脊髓损伤后血浆和损伤区脊髓组织中的SOD和GSH-PX活力（P<0.05），从而通过提高抗氧化作用减轻继发性损伤。在大鼠脊髓损伤后24小时，对损伤区脊髓组织和血浆进行观察发现：相对于假手术组，损伤区脊髓组织和血浆中的NO和MDA的含量显着提升（P<0.01），丹酚酸B在大鼠脊髓损伤后能够有效降低NO和MDA的含量（P<0.05），减轻脂质过氧化反应，能够对血脑屏障形成保护，有效降低组织水肿，进而形成对神经细胞的保护。3、在脊髓损伤后12小时，脊髓损伤组中IKKβ激酶活性明显增强（P<0.05），丹酚酸B可以明显降低伤后12小时IKKβ激酶活性（P<0.05）。脊髓损伤后24小时，相较于假手术组，损伤组中MPO活性明显升高（P<0.01），丹酚酸B可以明显抑制它的升高（P<0.05）。在术后24小时，免疫组织化学检测证实：假手术组中几乎没有磷酸化I-κBα和NF-κB p65阳性细胞表达，脊髓损伤组中大鼠磷酸化I-κBα和NF-κB p65阳性细胞数明显增加（P<0.01），丹酚酸B可以明显减少脊髓组织中磷酸化I-κBα和NF-κB p65的阳性细胞表达（P<0.05）。蛋白质免疫印迹方法结果进一步验证了免疫组织化学检测的结论。同时经过连续4周实验，丹酚酸B治疗组大鼠脊髓空洞率较脊髓损伤组有了明显的降低（P<0.05）。4、在脊髓损伤后24小时，Western blot和免疫组化两种方法都显示：相较于假手术组，Bax表达在脊髓损伤后有明显的增加（P<0.01），而丹酚酸B能够明显使Bax表达减少（P<0.05）；术后24小时，假手术组几乎没有Bc1-2表达，丹酚酸B治疗组和脊髓损伤组中Bc1-2表达量明显增加（P<0.01），丹酚酸B治疗对Bc1-2表达没有影响（P>0.05）。结论：1、经过BBB评分、斜坡实验、印迹实验和游泳实验证实丹酚酸B对急性脊髓损伤大鼠后肢运动功能障碍的恢复具有明显的促进作用。2、丹酚酸B能抑制脊髓急性损伤带来的过氧化反应，清除自由基和过氧化反应产物，从而减少神经元细胞的凋亡，保护神经功能。3、丹酚酸B在大鼠急性脊髓损伤模型中可能是通过抑制IKK/NF-kB信号通路来起到保护神经功能的作用。
张均田[9]2006年在《丹酚酸B防治神经退行性疾病的研究进展》文中指出目前世界人口老龄化的增长速度在加快。老龄化人口的增长速度是总人口增长速度的2倍,80岁以上高龄老人增长的速度是总人口增长速度的6倍。老年痴呆与老化有密切关系,由于人口的老龄化,老年痴呆的发病率也随之增加。65岁以后每隔5 a的发病率呈指数增长。根据Rotterdarm的研究结果,65～69
于金玲[10]2012年在《丹酚酸B药理作用研究进展》文中指出丹酚酸B已广泛用于心脑血管疾病的治疗,其药理作用机制研究比较充分。近年研究发现,丹酚酸B除具有抗氧化清除自由基、保护心脑血管缺血-再灌注损伤及抗动脉粥样硬化作用外,还具有抑制神经细胞凋亡、抗纤维化、抗衰老及促进神经干细胞增殖分化等作用。
参考文献：
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[9]. 丹酚酸B防治神经退行性疾病的研究进展[C]. 张均田. 全国医药学术交流会暨临床药理学研究进展培训班资料汇编. 2006
[10]. 丹酚酸B药理作用研究进展[J]. 于金玲. 天津药学. 2012