（四川省成都市成都大学附属医院肿瘤科 四川 成都 610082）
【摘要】 目的：探索人结直肠癌细胞系无血清培养形成细胞球的最佳方法，以及对球体内的间质化标志物进行检测。方法：结直肠癌细胞系LOVO、HT29、SW480、SW620及HCT116悬浮培养在添加了细胞生长因子的无血清培养基（SFM）中，并传代更新及诱导分化。采用免疫荧光法检测各系细胞球中间质化标志物N-cadherin及Vimentin的表达情况。结果：特制的SFM中5种细胞系均能形成细胞球，与亲代细胞保持一致的细胞形态，并能稳定的传代增殖，加入血清诱导分化贴壁生长。细胞球中表达间质化标志物N-cadherin及Vimentin。结论：结直肠癌细胞可以通过无血清培养方法得到悬浮生成的细胞球，细胞球内可检测到间质标志物的表达。
【关键词】 结直肠癌；肿瘤细胞球；无血清培养；上皮-间质转化
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）21-0009-02
Cultivation and Mesenchymal Makers Expression of Tumor Spheres Generated from Human Colorectal Cancer Cell Lines in Serum-free Medium
Zheng Mengying,Zheng Ling,Jia Jianfeng.Department of oncology, Chengdu university affiliated hospital,ChengDu 610082,China
【Abstract】Objective To study on the best cultivation method for cell spheres from colorectal cancer cell lines and examine the mesenchymal markers expression in those cell spheres. Methods Colorectal cancer cell lines LOVO,HT29, SW480,SW620 and HCT116 cells were seeded in the serum free medium(SFM) supplemented with cell growth factors, the cancer cell spheres were subculture and induced to differentiate by serum supplemented medium, the expression of mesenchymal markers were investigated by immunofluorescence. Results Cancer cell spheres could be generated from five colorectal cancer cell lines in SFM. These spheres were stable subculture and self-renewal, and were induced to differentiate by serum supplemented medium, these differentiated cell were adherence growth and kept the same morphology with the parental cells. These cancer cell spheres were founded expressing mesenchymal markers such as N-cadherin and Vimentin. Conclusion Tumor spheres can be generated and matained from colorectal cancer cell lines in SFM, and these cancer cell spheres were expressed mesenchymal markers.
【Key words】Colorectal cancer;Cancer cell spheres; Serum-free medium;Epithelial-Mesenchymal transition
近年来，有研究[1.2]指出结直肠癌细胞肿瘤细胞球可以悬浮生长在无血清培养基中，并发现这些细胞球具有比亲代细胞更强的耐药和转移能力，其可能与结直肠癌的复发转移密切相关。为此，本研究通过无血清悬浮培养5种结直肠癌细胞系，以期探索出一种形成结直肠癌细胞球稳定良好的培养方法，从而为体外研究提供良好的模型。并通过对细胞球中间质化标志物N-cadherin及Vimentin的检测，旨在为探索恶性肿瘤易发生转移侵袭的可能机制提供一条新思路。
1.材料与方法
1.1 实验材料
结直肠细胞系LOVO、SW480、SW620、HT29和HCT116细胞系购自中国科学院细胞库。完全培养基（SSM）为含10%小牛血清的DMEM培养液（Gibco，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1结直肠癌细胞的无血清培养 无血清的DMEM/F12培养基中分别加入细胞生长因子：10ng/ml Noggin（peprotech，美国）、50ng/ml R-Spondin 1(R&D,美国)及50ng/ml EGF（peprotech，美国）。制备结直肠癌细胞于10g/L琼脂糖（Agarose）低粘度附着面培养，台盼蓝染色计数单细胞悬液后，以103/mL密度接种至盛有SFM的6孔板中进行常规培养。每天置于显微镜下观察细胞球的形成情况，隔天换液。
1.2.2结直肠癌细胞球的诱导分化 细胞球形成待2周后加入含10%小牛血清的DMEM培养液诱导分化，置于显微镜下分别在不同时间点24h、48h及72h观察细胞形态及生长状态的变化。
1.2.3各结直肠癌细胞球的免疫荧光检测 将SFM中形成的细胞球0.01%PBS洗涤离心，涂于防脱玻片上晾干，4%多聚甲醛固定室温下固定，0.01%PBS洗涤，0.3%过氧化氢灭酶，0.01%PBS洗涤，0.2%TritonX-100破膜0.01%PBS洗涤，0.01%PBS洗涤，5%BSA封闭，加入鼠抗人Vimentin单克隆抗体（1：50，Santa Cruz,美国）、兔抗人N-cadherin单克隆抗体（1：50，Santa Cruz,美国）,4℃过夜，洗涤并加入TRITC、FITC标记的二抗，室温暗处孵育后加4,6二脒基-2一苯吲哚盐酸(4, 6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride,DAP I,Sigma,美国)复染5min，洗涤后倒置显微镜观察。
2.结果
2.1 结直肠癌肿瘤细胞球的形成过程。
5种结肠癌细胞以103/mL的密度接种于SFM中，起初各细胞都单个悬浮生长，后不断长大到第7天形成规则大小几乎固定的圆球体。（见图1）
3.讨论
为了最大程度上的减少细胞生长和表达的不利因素，并从根本上消除血清源性污染。1976年，Sato[3]等发现GH3细胞株能在添加了少量生长因子的无血清培养基中维持生长，自此以后，无血清培养技术得到了逐步完善。 肿瘤干细胞学说[4]认为部分肿瘤细胞株能通过无血清悬浮培养得到肿瘤细胞球，这些细胞球中可能存在表达干细胞标志物[5]如CD133+、EpCAMHIGHCD44+及ALDHbr的肿瘤干细胞样细胞存在。目前这种方法已经广泛地应用于脑肿瘤、乳腺癌及结直肠癌等肿瘤干细胞方面的研究，但目前的无血清培养方法和条件不尽相同。因此，本研究旨在通过对结直肠癌细胞株无血清培养方案的优化，以稳定的培养出结直肠癌肿瘤细胞球，并使其不断自我更新和传代，以在数量上大量扩增。
无血清悬浮培养的根本目的是使肿瘤细胞球稳定的增殖传代，并使其保持干性，阻止其分化。本研究特制的无血清培养基包括基础培养基DMEM/F12，及细胞生长因子R-Spondin 1、Noggin和EGF。R-Spondin 1也被称作Cristin 3是一种27kDa的分泌蛋白，通过激活Wnt/β-catenin调控细胞增殖，通过注射R-Spondin 1入小鼠体内可以作用于β-catenin而导致肠上皮细胞的增殖。Noggin是一种46kDa二硫化物同型二聚体，其主要通过结合于TGF-β家族而抑制它们与信号分子的结合，发挥与EGF相似作用而抑制细胞的分化。
肿瘤细胞球是由一群干细胞和祖细胞“异质性细胞团块”，大量研究[4]致力于其上如Nanog和Oct4等控制自我更新和分化的干性基因的表达情况，以及是否有表达干细胞标志物如CD133+和CD44+细胞的存在[5]。本研究变换思路，从肿瘤细胞球的转移生物学特性方面着手相关检测。由于肿瘤细胞球细胞的干细胞特性，其应该不表达或低表达分化细胞的标志物[6]，我们通过对结直肠肿瘤细胞球中N-cadherin及Vimentin的表达情况研究发现[15]，5种结直肠肿瘤细胞球中均表达这两个间质化标志物，这为从其它生物学特性方面研究肿瘤细胞球具有启发作用。
综上所述，本研究通过添加细胞生长因子R-Spondin 1、Noggin和EGF的改良无血清培养基和1%Agarose铺盖的培养底面，成功的得到可以稳定传代培养的5种结直肠癌肿瘤细胞球。上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要机制[7]，而本研究检测到结直肠肿瘤细胞球中间质化标记物阳性表达，这将为探索肿瘤易发生侵袭转移的可能机制提供一条新思路。
【参考文献】
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论文作者:郑梦颖,郑玲,贾健锋
论文发表刊物:《医药前沿》2017年7月第21期
论文发表时间:2017/8/2
标签：细胞论文; 血清论文; 肿瘤论文; 培养基论文; 结直肠癌论文; 细胞系论文; 干细胞论文; 《医药前沿》2017年7月第21期论文;