陈国奋[1]2000年在《短期免疫抑制促进自体神经快速再生的研究》文中研究说明人类异体肢体移植的临床研究发现，在免疫抑制状态下，移植肢体的神经生长速度达2～3mm/天，快于同平面自体断肢再植后的神经再生（约1mm/天），这种现象提示：有必要从免疫学的角度研究神经损伤、修复与再生机制，探讨短期免疫抑制治疗对自体神经损伤修复后再生及功能恢复的作用。 本研究的目的就是通过建立免疫抑制下周围神经再生研究动物实验模型，短期应用免疫抑制剂FK506后，从神经再生、肌肉神经再支配和肢体功能恢复三个方面，评价神经再生和功能恢复；同时选择临床周围神经断裂伤修复后自愿者，短期应用免疫抑制剂FK506，观察对神经再生及功能恢复的促进作用。以期明确免疫抑制剂对周围神经修复和再生的作用，探讨短期全身免疫抑制对周围神经损伤治疗的临床意义。 本研究获得以下结果： 1.建立免疫抑制下自体神经再生的大鼠实验模型，实验组予FK506（1mg/kg/d）进行全身免疫抑制，对照组未行免疫处理。 2.定期在大鼠坐骨神经不同部位取材，两组动物的神经纤维形态差别明显。光镜和电镜观察显示：实验组神经纤维的轴突数目、面积及轴突髓鞘化程度均较对照组再生良好。 3.两组动物的比目鱼肌湿重和小腿三头肌肌力恢复率对比，实验组优于对照组。 4.两组相同生存期动物行坐骨功能指数（Sciatic functionalindex，SFI）测定，实验组较对照组恢复提前。 5.全程给药和短期给药神经功能恢复没有显著性差异。 6．观察期内两组动物的生存情况没有明显差别。 7．10例临床自愿者观察神经再生速度加快，功能恢复良好，且无明显的毒副作用。 结论： 1．免疫抑制剂FK506全身免疫抑制下，大鼠周围神经再生轴突生长延伸、成熟加快，肌肉重量及肌力恢复提前，肢体功能测定优于非免疫抑制状态下。 2．短期给药可获得与全程给药相同效果。 3．免疫抑制剂FK506短期使用不影响生存。 4．FK506可用于临床治疗周围神经损伤，初步结果显示FK506可以促进神经快速再生，加速肢体功能恢复。
王军[2]2003年在《环孢素A对同种异体移植神经再生的影响》文中认为【目的】研究环孢素A(cyclosporine A，CSA)对同种异体移植神经再生的影响，探讨抑制同种异体神经移植中免疫排斥反应、促进神经再生的方法。 【方法】采用32只成年、健康的雄性Wrister大白鼠随机分为A、B两组，每组16只，进行坐骨神经异体神经移植实验。A组为不应用CSA的异体神经移植组，左侧行新鲜的异体神经移植称为AL组，右侧行冷冻的异体神经移植称为AR组；B组为应用CSA的异体神经移植组，左侧行新鲜的异体神经移植称为BL组，右侧行冷冻的异体神经移植称为BR组。异体神经移植段来源于同侧A、B两组坐骨神经移植段相互交换。 用0.25％的硫贲妥钠1ml／100g，腹腔内注射麻醉。在大白鼠股后外侧区行纵行切口，自股二头肌与半腱肌、半膜肌之间剪开结缔组织，钝性分离股二头肌与半腱肌，缝线牵开臀大肌充分显露坐骨神经。自梨状肌下缘0.5cm处，用消毒剃刀整齐切断坐骨神经并切除坐骨神经干10mm。A、B组右侧的神经移植段置于-196℃液氮中冷冻30Sec，然后两组神经移植段交换移植于坐骨神经缺损处；两组左侧的神经移植段交换行新鲜异体神经移植。11-0丝线缝合4～6针，吻合神经，然后逐层缝合关闭切口。术后A组不给予任何药物，B组给予CSA 5mg／kg·d至实验结束，室温保持在23—25℃。 所有实验大白鼠，分别于术后4w和8w进行以下指标的观察：①坐骨神经动作中文摘要电位潜伏期(actioo po七ential latency，APL，):于神经吻合口近端刺激坐骨神经，BL一410生物信号提取系统描记同侧胖肠肌动作电位，测量动作电位潜伏期。②移植段神经轴突计数(axonal count，AC):在移植段中段，随机取视野，染色后应用电镜放大600倍拍照进行神经轴突计数。③胫前肌湿重测定(mu:cular wetve ight，WW):完整切下大白鼠胫前肌，测定胫前肌湿重，然后行神经肌肉的病理检查。 数据处理采用SAS计算机数据处理系统软件进行t检验，P<0.05有统计学差异。【结果】1、各组动作电位、轴突计数、胫前肌湿重测量结果分别为:AL组AP工P7.726士0 .445、AC47.5士12.73、WWO.2286士0.0585;AR组APIP3.124士0.713、AC 111.5士20.89、WW 0.3341士0.0680;BL组APIP3.190士0.325、·AC 251士19.54、WWO.3211士0 .0458;BR组AP工P3.138土0.324、AeZOG.5士17.16、WW 0.3117士0.0360。 分别比较Al-组与AR组、BL组与BR组、AL组与BL组、AI{组与BR组的测量结果，各组动作电位、轴突计数、胫前肌湿重测量结果的统计学分析结果表明:AL组动作电位潜伏期最长、轴突计数和胫前肌湿重最少(P<0.01)，说明新鲜的异体神经移植神经再生最差;BL组与AR组、BR组比较，动作电位潜伏期无明显差异(P>0.05)，但是BL组轴突计数明显高于AR组和BR组(P<0.01)，说明应用免疫抑制剂CSA新鲜的同种异体神经移植神经再生最好;BR组与AR组比较，动作电位潜伏期、肌肉湿重无明显差异(P>0.05)，但轴突计数高(P<0.01)，说明冷冻的异体神经移植中，应用免疫抑制剂神经再生效果优于不应用免疫抑制剂的异体神经移植;肌肉湿重测量结果的统计学分析表明，仅AL组明显低于其他各组(P<0.05)，而AR、BR、BL各组之间无明显差异(P>.05)。2、光镜观察:术后sw放大叨倍光镜下观察肌肉情况可见，A组左侧肌纤维出现较为广泛的变性、萎缩，横纹肌模糊不清，肌束间隙增宽，部分肌纤维节段性空变，淡染;而右侧胫前肌部分肌纤维变性、萎缩，横纹肌模糊不清，核固缩，肌束间隙增宽。B组左侧肌纤维轻微变性，萎缩不明显;而右侧胫前肌肌纤维变性，有轻度中文摘要萎缩。 神经中段HE染色可见:A组左侧除有较弥漫的淋巴细胞浸润，还有灶性淋巴细胞浸润，而且神经内有多核巨细胞反应，并见吞噬现象，右侧坐骨神经有少量淋巴细胞浸润;B组左侧神经束完整，可见较多的血管，管腔较粗，内有红细胞，而右侧神经束完整，可见血管，管腔内有红细胞。 电镜观察:AL组与AR组可见少量轴突再生，但发育不完善，AR组轴突数量相对较多;BL组和BR组轴突密度明显增高，轴突趋向成熟，发育完善;BL组轴突数量较BR组多。 [结论】①新鲜的异体神经移植段具有完整的髓鞘、许旺氏细胞未被破坏，抗原性最强，免疫排斥反应最溜，因而神经再生能力最差。②深冷冻可以提高移植段的神经再生能力。因为冷冻处理破坏了神经髓鞘和许旺氏细胞，降低了移植段神经的抗原性，免疫排斥反应减弱。另外，冷冻的异体神经移植中，应用免疫抑制剂神经再生效果优于不应用免疫抑制剂的异体神经移植。③应用免疫抑制剂时，新鲜的异体神经移植其免疫排斥反应被抑制，而新鲜神经保留有完整的许旺氏细胞、血管更容易再生建立血运、完整的髓鞘可以作为神经再生的支架等，从而神经再生能力要好于冷冻的异体神经移植。所以，应用免疫抑制剂CSA新鲜的同种异体神经移植神经再生最好。 总之，环抱素A可以抑制同种异体神经移植的免疫排斥反应，提高神经再生能力。
苗存良[3]2004年在《普乐可复（FK506）结合冷藏大鼠坐骨神经同种异体移值再生效果的实验研究》文中指出目的：临床上，周围神经长段缺损行自体神经移植是首选方法，但是自体神经来源有限，并给供区造成一定的功能障碍，况且，神经生长速度为1mm/d，也是需要迫切解决的问题。目前解决神经缺损的方法集中在二个方面，一方面尝试肌桥、静脉管、硅胶管、组织工程等，但这些替代物的研究都处于实验阶段。另一方面即是用同种异体神经移植来进行修复，但存在免疫排斥反应问题，对同种异体神经预处理降低其抗原性的方法有化学法、冷冻法、干燥法、照射法等，都能降低其抗原性，还有应用免疫抑制剂、皮质激素，或同时应用都取得较好效果。周围神经损伤后其再生速度为1mm/d,是影响功能恢复的主要因素。肌肉长时间失神经支配后，肌纤维出现萎缩、变性和纤维化，彻底丧失功能恢复的可能。因此加速神经再生的速度，由现在的1mm/d提高到2-3mm/d,一直是基础和临床周围神经研究工作者的目标。因此，周围神经长段缺损需解解决二个问题：一为如何桥接神经缺损，二为如何加速神经再生。而新型免疫抑制剂FK506的问世，给加速神经再生提供了技术支持，FK506是从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素，英文名tacrolimus,常译为他克莫司或他克雷姆，商品名为普乐可复，FK506为实验室命名。它的主要作用（1）抑制器官移植排斥反应的作用,（2）促神经再生作用,（3）神经保护作用。临床上异体<WP=4>手移植发现，应用FK506可加速神经再生速度达3mm/d。故本实验设计（1）冷藏同种异体神经移植神经再生是否优于新鲜同种异体神经移植神经再生，（2）冷藏同种异体神经移植联合应用FK506神经再生是否优于单纯冷藏同种异体神经移植再生，（3）冷藏同种异体神经移植神经再生FK506的合适剂量，基于此我们设计了本实验。来探索出一种较好的进行同种异体神经移植的方法。方法：取75只雌性Winster大鼠做为受体，体重150—200g，按手术先后随机分为5组，每组15只，A组：新鲜同种异体神经移植组，B组：冷藏保存同种异体神经移植组，C组：冷藏保存同种异体神经移植组同时应用FK506剂量为2mg/kg/d，D组：冷藏保存同种异体神经移植组同时应用FK506剂量为0.5mg/kg/d，E组：新鲜自体神经移植组。另取30只SD大鼠，取其双侧坐骨神经共60根作为供体，其中15根用生理盐水浸泡30分钟直接移植于A组，其余45根依次浸泡于50%、70%、和85%甘油溶液中，每次3小时，然后分装盛有85%甘油溶液的无菌密闭瓶中，置于5°C条件下保存1周，移植前用生理盐水浸泡30分钟,分别移植于B、C、D组。各组均用11-0无创缝合线缝合神经外膜，将神经移植物与神经断端作端端吻合，术后A、B、E组不用任何药物，C组应用FK506剂量为2mg/kg/d灌胃8周，D组应用FK506剂量为0.5mg/kg/d灌胃8周，喂养条件、室温及管理条件完全一致。术后分别于8、10周对移植物行大体和光镜观察及轴突图像分析、比目鱼肌湿重比较、患肢坐骨神经电生理检查，于8周行移植神经电镜检查。对肌电图结果（传导速度、波幅、潜伏期）、比目鱼肌肌湿重、有髓神<WP=5>经纤维再生恢复率的原始数据采用SAS统计软件进行单因素方差分析，P<0.05提示有统计学意义。结果：术后8、10周时，通过对各组大体观察结果、显微解剖观察、光镜观察结果、电镜观察结果、电生理检测结果、比目鱼肌肌湿重结果的分析，3组中C、E组神经生长最好，D组神经再生好于A、B组，A、B组比较，A组较B组差。经过对肌电图、有髓神经纤维再生恢复率、肌湿重的统计学分析，有显著性差异(p<0.05)。结论：本实验结果说明，冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组2mg/kg/d神经再生效果最好，与正常相似。冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组0.5mg/kg/d神经再生效果次之，冷藏同种异体神经移植联合应用FK506组优于不用药组，而新鲜同种异体神经移植组神经再生效果最差。联合应用FK506和冷藏保存预处理同种异体神经可以加速同种异体神经移植后的神经再生及功能恢复。
张勇杰[4]2003年在《周围神经缺损的组织工程方法修复》文中认为周围神经缺损后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门问题。由于周围神经结构和功能上的特殊性，大多数情况无法直接对拉吻合，因此必须寻找一种神经替代物来修复缺损。近十年来，随着材料科学和分子生物学的发展，用于神经修复研究的材料品种越来越多。对于神经修复的研究重点也已从单纯地对神经修复技术的研究转向为对神经再生的研究。周围神经缺损修复经历了自体神经移植、同种异体神经移植、自体非神经组织移植、生物材料替代等阶段。 自体神经移植是目前临床治疗的“金标准”，然而自体神经移植会造成的供区的感觉障碍及神经纤维错向再生的缺点。因此人们研究的重点已着眼于使用人工神经替代物来促进周围神经再生，以达到神经快速生长、功能完全恢复的理想目标。周围神经组织工程的研究为解决周围神经修复难题带来新的希望。组织工程化周围神经的主要内容是将经体外培养扩增的雪旺细胞种植在具有三维支架结构、可生物吸收、半渗透性的神经导管内，桥接周围神经缺损。它涉及雪旺细胞体外培养扩增，组织工程神经内部支架构筑，神经导管的制作等关键问题。 本论文应用组织工程的方法构建组织工程周围神经，联合应用外源性神经营养因子修复周围神经缺损。对雪旺细胞的体外培养及与支架材料复合，植入体内修复大鼠坐骨神经缺损，进行了比较系统的研究，并建立了一种构建组织工程周围神经的方法，希望能为周围神经缺损的修复提供一种可行的选择。实验分为以下四个部分： 1．雪旺细胞的体外培养：目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，以获得足够数量的较纯净的雪旺细胞应用于神经修复。方法使用5-7d的SD仔鼠坐骨神经，采用混合酶多次消化法分离雪旺细胞，阿糖胞苷、G-418抑制成纤维细胞生长，氟丝扣林促进雪旺细胞分裂增殖，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞。结果发现使用上述方法可以获得大量的高纯度雪旺细胞，经抗S-100蛋白单抗通过SABC法染色鉴定，雪旺细胞纯度可达到97％以上。 第凹军医大学硕士学位论X2．TGF6、rhBMP。对体外培养的雪旺细胞生物学行为的影响：雪旺细胞培养过程中加入 50ugh汀GF－p、50nglmlrhBMP。，观察其对雪旺细胞生物学行为的影响。发现外源性TGF6、thBMPZ均能明显促进雪旺细胞的增殖和分泌NGF的功能。TGFg更优于thBMPZ。3．组织工程周围神经的构建：目的是通过对雪旺细胞三维培养，获得细胞一生物材料复合的理想方法以构建组织工程周围神经。方法是将牛去细胞基质（BAM）。BrdU标记的雪旺细胞、血清和培养基按一定的比例混合，注入PLGA神经导管，37’C、5％ CO。孵育30分钟形成凝胶。培养id后植入SD大鼠臀大肌中，观察雪旺细胞在体内的生长情况。3周后导管内充满大量雪旺细胞，经BrdU抗体染色观察，植入的雪旺细胞仍然存活。本实验中使用雪旺细胞的三维培养体系是构建组织工程周围神经较为的理想方法。4．周围神经缺损的修复：用上述方法构建的组织工程周围神经来桥接SD大鼠坐骨神经 10mm缺损。 实验组：A组为PLGA导管＋雪旺细胞＋TGF－p；B组为PLGA导管＋雪旺细胞。对照组：C组为＊L6A导管：D组为自体神经移植。四个月后通过免疫组化、电生理、透射电镜、HRP逆行示踪等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。发现各组坐骨神经均得到再生，修复效果A组最佳，B组与D组无显著性差异，C组最差。表明复合神经营养因于的组织工程周围神经对修复周围神经缺损有较好的疗效。 通过以上研究得出以下结论：1．体外培养的雪旺细胞可以通过 Ara－c、G－418及控制消化时间等步骡在较短 时间得到纯化并大量增殖。2．外源性神经营养因子TGF－p、rhBMP。均能明显促进雪旺细胞的增殖和分泌 NGF的功能，TGFO更优于ffoMPZ。3．利用组织工程原理与方法利用雪旺细胞、BAM、PLGA在体外构建组织工程 周围神经，可以解诀目前神经组织工程的难点。4．利用体外构建的组织工程周围神经修复 SD大鼠 15mm坐骨神经缺损，修复 效果较好，添加 TGF－p组的修复效果超过了自体神经移植组，表明该组织工 6 窜凹旱区大学硕士X 程神经构建合理，对神经再生有良好的促进作用，为临床应用提供的有益的 尝试。
李明新[5]2009年在《FK506及神经干细胞对异体神经移植作用的研究》文中认为第一部分大鼠胚胎脑组织神经干细胞分离、培养和鉴定目的体外无血清条件下分离、培养胚鼠神经干细胞，观察其生长及分化情况，为进行神经干细胞移植创造基础。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法，取孕14～16dSD系大鼠的胚胎海马组织，在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基中培养、传代，进行神经干细胞的单细胞克隆培养，显微镜下观察其增殖分化过程，并对原代和传代培养的细胞进行Nestin免疫荧光染色，鉴定是否为神经干细胞，神经干细胞诱导分化后应用NSE及GFAP抗体进行鉴定。结果鼠脑组织中成功培养出神经干细胞，在无血清培养基中细胞不断分裂增殖，8d左右就可以形成胞体透亮、折光性好的干细胞球，细胞免疫荧光染色证实细胞系巢蛋白阳性，并能在体外传代培养和连续形成克隆；经血清培养液诱导分化后部分呈NSE阳性，部分呈GFAP阳性。克隆的诱导及分化实验表明，克隆具有多分化能力，神经元标志物NSE、星性胶质细胞的标志物GFAP的检测结果均呈阳性。结论分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，说明新生大鼠海马存在神经干细胞，并可进一步用于神经干细胞移植治疗疾病的研究。第二部分FK506及神经干细胞对异体神经移植生长的作用目的探讨FK506及神经干细胞对异体神经移植生长的影响。方法共使用50只大鼠，其中Brown-Norway(BN)大鼠10只，作为神经移植的供体；Lewis(L)大白鼠40只，随机分成四组，每组10只，左侧坐骨神经切断后，造成1cm缺损，采用Brown-Norway大鼠坐骨神经1cm移植修复；A组未施加干预因素，B组植入神经干细胞，D组注射FK506，C组同时应用神经干细胞及注射FK506(神经干细胞预先用BrdU标记)。术后12周，行后肢运动及感觉评估，进行肌电图检查神经传导情况；取下组织后进行坐骨神经组织学检查、腓肠肌湿重测定，并采用抗体GFAP、BrdU进行免疫组织化学检查，观察在蛋白水平变化，后进行NGF及GAP-43的原位杂交检查，在mRNA水平检测干预因素对异体神经移植的作用。结果同时接受神经干细胞及注射FK506组，其短期内出现体重恢复慢、进食差及少动，但6周后腓肠肌湿重优于其他组，坐骨神经肌电图检查及组织形态恢复优于单独接受神经干细胞或FK506组及对照组；免疫组化结果显示：同时接受神经干细胞及注射FK506组GFAP及BrdU表达高于其他组，移植干细胞组显示BrdU高表达，原位杂交结果显示同时接受神经干细胞及注射FK506组NGF及GAP-43表达高于其他组。结论FK506结合神经干细胞对异体神经移植生长具有促进作用，在周围神经缺损较多时可提供一种选择，减少致残率。
李岩峰[6]2010年在《激活态雪旺细胞临床应用安全性的实验研究》文中指出引言：组织工程为周围神经缺损的修复提供了新的方法,填充了雪旺细胞的可吸收人工神经导管有望在将来替代自体神经移植应用于临床。通过“激活液”(专利申请中)外源性刺激获得的激活态雪旺细胞,在增殖能力和分泌活性都明显超过正常的雪旺细胞,而且促进神经再生的效果也明显增强。体外培养、扩增的激活态雪旺细胞应用于临床的一个必要前提是安全可靠,无致癌性、致畸性。本研究的目的是联合体内、体外多个实验,检测激活态雪旺细胞是否安全,有无应用于临床的可能。本研究共分为4个部分：目的：通过横向比较,探索适合临床应用的成年雪旺细胞培养技术。方法：成年SD大鼠,分4组,每组10只,从双侧坐骨神经取材培养雪旺细胞。A组采用体内预变性法+快速酶消化法；B组采用体内预变性法+慢速酶消化法；C组采用体外预变性法+快速酶消化法；D组采用体外预变性法+慢速酶消化法。细胞传代使用冷喷射传代法和胰酶消化传代法。比较(1)体内、体外预变性增加取材神经中雪旺细胞的数目有无差别；(2)快速、慢速酶消化法从神经中获取雪旺细胞的效率；(3)冷喷射传代法和胰酶消化传代法的效率。筛选使动物痛苦小、而雪旺细胞数量多、纯度高等最适合临床应用的方法。结果：体外预变性和体内预变性都能明显增加取材神经中的雪旺细胞数目,无统计学差异,但体外预变性减轻了患者的痛苦。快速酶消化法和慢速酶消化法在培养1周时获得的雪旺细胞数目相似,无统计学差异。冷喷射传代法兼有纯化雪旺细胞的作用,会损失一定数量的雪旺细胞,对操作者技术要求高；胰酶消化传代法没有纯化的作用,对操作者技术要求低。结论：体外预变性减轻患者痛苦,更适合临床应用；快速、慢速酶消化法效果无明显差异,均可考虑应用；冷喷射传代法可以和胰酶消化传代法有机结合使用,前者在雪旺细胞纯度较低时应用,后者在雪旺细胞纯度较高时应用。目的：体外检测激活态雪旺细胞的生物学特性,与良性、恶性细胞对比,分析其是否有恶性细胞的特点。方法：从成年大鼠坐骨神经中分离并体外培养激活态雪旺细胞,通过对细胞形态的连续观察、生长方式的变化、免疫学标志物鉴定、增殖率和纯度检测、迁移能力和侵袭能力检测、染色体核型分析,及全基因组表达谱基因芯片、细胞因子抗体芯片检测,对激活态雪旺细胞的生物学特性进行综合评估。结果：激活态雪旺细胞在体外培养形态均一、无异质性变化。增殖能力增加,受密度抑制影响减小。连续传代不丢失S100、P75LNGFR、GFAP等免疫学标识物,迁移能力、侵袭能力略有增加,但明显弱于恶性细胞。染色体仍为2倍体。基因和蛋白表达存在动态平衡,第2、3代总体表达最高。结论：从成年大鼠周围神经分离并体外培养获得的激活态雪旺细胞,基本不具备恶性细胞的生物学特性。目的：模拟临床应用,探索激活态雪旺细胞的体内变化过程,是否会形成肿瘤。方法：从成年大鼠双侧坐骨神经培养足量的激活态雪旺细胞,移植到自体腋窝下,与良性、恶性细胞移植对比。50只成年大鼠分三组：A组：激活态雪旺细胞,自体移植细胞数目1×107个,大鼠20只；B：正常雪旺细胞,自体移植细胞数目1×107个,大鼠20只；C组,恶性大鼠胶质瘤C6细胞,移植细胞数目2×106个,大鼠10只。分别在移植细胞后0.5个月、1个月、2个月、4个月、6个月对大鼠腋窝注射细胞处取材,观察大体标本上是否有细胞团或肿瘤形成,解剖局部及内脏观察有无肿瘤转移灶的形成。将局部的细胞团块或肿瘤做免疫组织化学鉴定,并查找病理性核分裂相。结果：注射恶性细胞的大鼠(C组),均在0.5-1个月长出肿瘤。而激活态雪旺细胞组(A组)和正常雪旺细胞组(B组)在体内不形成肿瘤,体内的过程相似,至少可以在腋窝下存活2个月,并表达免疫学标志物。结论：激活态雪旺细胞在体内非正常微环境下至少可以存活2个月,并表达免疫学标志物,不形成肿瘤。目的：探索激活态雪旺细胞自体移植是否对后代产生影响。方法：从成年雌性动物坐骨神经培养出足量的激活态雪旺细胞后自体移植,然后与雄性大鼠同笼喂养3个月。与单纯坐骨神经切除的动物对比后代的生物学性状,如怀孕率,新生鼠的活胎数、死胎数、体重、体长、尾长的比较,染色体数目的检测。新生鼠4周时的发育、基本行为能力、对伤害的认知等。结果：无论是否移植激活态雪旺细胞,单侧坐骨神经切除后的成年雌性大鼠,3个月内怀孕率均为40%。实验组和对照组的新生鼠的活胎数、死胎数、体重、体长、尾长无统计学差异,新生鼠发育状况、基本行为能力、对伤害的认知等均未见明显异常。新生鼠的染色体仍为21对。结论：激活态雪旺细胞的自体移植对成年雌性动物的后代的生物学性状不产生明显的影响。
邹永根[7]2007年在《不同冷冻温度下保存大鼠坐骨神经的实验研究》文中研究说明目的:观察不同冷冻温度下保存的异体神经对周围神经缺损修复的效果。方法:取96只同种属雄性wistar大鼠,月龄2月以上,体重300±20克,生理状况正常。随机分为对照组与实验组。对照组A:12只,为新鲜自体神经移植组;对照组B:12只,为新鲜异体神经移植组。另24只为取材组,取双侧坐股神经共48根,随机分为4组,每组12根神经,甘油浸泡分别保存在4℃,-50℃,-80℃,-196℃条件下,保存时间均为三周,三周后在随机原则下将各组12条神经分别移植给12只大鼠,根据不同冷冻温度分为4℃组,-50℃组,-80℃组,-196℃组,记为实验组:C,D,E,F组。术后2周,每组随机抽取2根移植神经进行免疫组织化学观察,以了解移植神经的淋巴细胞侵润,SC细胞及纤维增生情况。术后9,16周,剩余移植体进行大体观察,光镜检察,电生理测定,电镜检察来评价神经再生的效果。结果:术后2周,所有移植段近端,移植远端神经均有不同程度Wallerian变性,B组移植段见明显T淋巴细胞浸润,C,D,E组次之,A组及F组未见T淋巴细胞。B组以大量成纤维细胞增生为主,A,F组以SC增生为主,C,D,E组介于两者之间。术后9周及16周,B组与周围组织粘连重,A,F组最轻,C,D,E组介于两者之间;从神经再生效果评价看:A组神经再生效果最好, F组次之,C,D,E组再次,B组最差。结论:1冷冻保存异体神经有降低其免疫原性的作用。2在各冷冻组中,以-196℃组神经再生效果最好,接近新鲜自体神经移植组。
胡楠[8]2011年在《自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复猕猴正中神经50mm缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨猕猴骨髓基质细胞(rhesus monkey bone marrow stromal cells, RhBMCSs)的生物学特性以及其与支架材料聚乳酸乙醇酸(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)在体外的生物相容性,并观察自体RhBMCSs作为种子细胞与壳聚糖导管和PLGA纤维支架构建的组织工程化神经移植修复猕猴周围神经长距离缺损的能力及其安全性,为该组织工程化神经的临床应用提供实验依据。方法:1、应用贴壁培养法从成年猕猴骨髓中分离RhBMCSs,检测细胞表面抗原、细胞周期、生长增殖能力及分化能力。2、将第二代RhBMCSs与PLGA支架材料联合培养,通过共焦显微镜和扫描电镜观察细胞形态,应用MTT法检测RhBMCSs活性,应用流式细胞术检测细胞周期,应用实时荧光PCR和Western Blot检测RhBMCSs神经营养因子的分泌情况。3、建立猕猴正中神经50mm缺损模型并随机分为4组(每组3只):细胞组用由壳聚糖导管及置入其中的PLGA支架组成的神经移植物桥接缺损神经并注入自体RhBMCSs;材料组仅以神经移植物桥接而不加细胞;自体组用自体神经原位移植;缺损组不予任何桥接。术后3、6、9、12个月分别对各组动物术肢大鱼际肌及对指功能等情况进行拍照、摄像记录。术后12个月,进行神经电生理和荧光金逆行示踪检测;运用光镜和电镜组织学方法对再生神经和靶肌肉进行形态学观察及免疫荧光化学检测,利用图像分析系统进行形态计量分析。术前及术后3、6、9、12个月对所有动物抽取外周血液进行血液常规、生化和凝血功能检查,并且于术后12个月时行免疫功能指标、肿瘤标志物检测及重要脏器组织病理学检查。结果:1、RhBMCSs呈梭形、成纤维细胞样,表达CD73、CD105、CD29和CD90,而不表达CD34、CD45和CD11b,第二代RhBMSCs G0/G1期、S期和G2期所占的百分比分别为83.36%、12.71%和3.93%,符合基质干细胞的特性。2、RhBMCSs与PLGA共培养24h后,可见部分细胞呈球形或短梭形贴附与纤维支架表面,此后细胞沿PLGA纤维延伸,逐渐转为长梭形,激光共焦显微镜下可见CD29阳性的BMSCs黏附包绕在PLGA纤维表面,形成长长的细胞链。扫描电镜下可见BMSCs与PLGA贴附良好,且有较多细长的突起从BMSCs伸出,沿着材料伸展。RhBMCSs在PLGA浸出液中培养至7天,其形态和细胞活力与普通培养基组相比无明显差异(P>0.05)。两组间细胞增殖指数(G2M + S)/G0G1 + G2M+S)亦无差异(P>0.05)。在PLGA浸出液中培养72h后,猕猴BMSCs神经营养因子(NGF、BDNF,CNTF及bFGF) mRNA表达量及蛋白表达量与普通培养基中生长的BMSCs相比没有显著差异(P>0.05)。3、神经移植术后动态地观察猕猴术侧手臂使用频率、拇指力量及手指运动功能,细胞组、材料组和自体神经组呈渐进性恢复,12个月时,细胞组及自体神经组动物手指灵活,拇指与食指对指功能优于材料组,缺损组动物拇指外展困难,对指功能丧失,大鱼际肌逐渐萎缩。术后12个月神经电生理学检测示材料组、细胞组、自体神经组再生正中神经远侧端复合肌动作电位(CMAP)平均波幅分别为:4.63±0.13mV,4.45±0.49 mV,8.89±2.85 mV,材料组及细胞组与自体组比较有统计学差异(P<0.05);近侧端CMAP平均波幅分别为:3.63±1.14mV,3.82±0.41 mV,6.50±2.51 mV,三组间无统计学差异(P>0.05);平均运动神经传导速度分别为:12.87±2.14 m/s、18.59±4.87 m/s、30.21±2.90 m/s,三组间无统计学差异(P>0.05)。荧光金(FG)逆行示踪检查示材料组、细胞组、自体神经组术侧相应节段脊髓灰质前角运动神经元中FG阳性细胞数分别为15292±1005、15814±600和16000±841,三组间无统计学差异(P>0.05);相应背根神经节感觉神经元中FG标记率分别为76.14%±7.62%、79.61%±6.60%和82.79%±5.11%,细胞组与自体神经组无统计学差异,但导管组FG标记率低于细胞组和自体神经组(P<0.05)。术后12个月,材料组和细胞组移植部位壳聚糖导管和PLGA纤维支架已完全降解,再生组织连接了正中神经50mm缺损。神经三色染色和抗NF200、S-100免疫荧光化学染色结果显示,材料组、细胞组、自体神经组再生神经纤维从近侧端穿越桥接段,长入了远侧神经干,细胞组桥接物段再生神经纤维密集,好于材料组,缺损组未见再生神经结构。透射电镜下,材料组、细胞组、自体神经组再生神经远段神经横切面神经髓鞘厚度分别为:0.63±0.27μm、0.82±0.39μm、1.11±0.58μm,各组之间均有统计学差异(P < 0.05);有髓神经直径分别为:4.09±1.12μm、4.59±1.39μm、5.57±2.13μm,各组之间比较均有统计学差异(P < 0.05),缺损组神经变性萎缩明显,几乎看不到正常神经结构。大鱼际肌Masson三色染色后可见细胞组和自体神经组肌纤维比较饱满,肌束之间可见少量胶原纤维增生,材料组肌束之间见较多胶原纤维增生;缺损组大鱼际肌表现为明显的失神经萎缩,胶原纤维、结缔组织和脂肪组织大量增生。材料组、细胞组、自体神经组大鱼际肌肌纤维平均横截面积分别为: 658.84±420.84μm~2、696.80±357.60μm~2、1232.54±335.79μm2,材料组和细胞组与自体神经组比较差异均有统计学意义( P < 0.05 )。材料组、细胞组、自体神经组大鱼际肌胶原纤维面积平均百分比分别为: 29.62±10.01%、23.04±8.77%、22.65±6.41%,材料组与自体神经组比较差异有统计学差异( P < 0.05 ),细胞组与自体神经组比较差异无统计学意义( P > 0.05 )。术后各组猕猴血常规、血电解质、肝功能、肾功能、心酶谱、血糖、血脂及凝血功能检查,结果均在正常范围,与术前相比及各组间相比均无统计学差异。术后12个月检测免疫功能指标,各组间结果无统计学差异,术后12个月行肿瘤标志物检测,所有动物均未见异常。术后12个月行心、肝、肺、肾、脾及淋巴结组织病理学检查,各脏器未见病理学改变。结论:1、应用贴壁培养法所得RhBMSCs在第2-3代时形态均一,增殖旺盛,其生物学特性符合干细胞特征,可以用于构建组织工程化神经移植物。2、RhBMSCs能在PLGA支架上贴附生长,未见PLGA对细胞活力、分裂增殖能力及神经营养因子分泌的不良影响,表明RhBMSCs与PLGA支架材料有良好的生物相容性。3、由自体骨髓基质细胞、壳聚糖导管和聚乳酸乙醇酸纤维支架构建的组织工程化神经桥接猕猴50mm正中神经缺损,术后12个月再生神经修复了缺损,恢复了神经干的连续性,再生神经在形态结构和生理功能上都得到了恢复,并实现了靶肌的神经再支配,猕猴术肢的运动功能得到了改善。4、血液检查及重要脏器组织病理学检查表明该组织工程化神经应用于灵长类动物猕猴体内是安全的。本研究结果为临床应用自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复周围神经损伤提供了实验依据,具有指导意义。
王亚玲[9]2016年在《复合丝素蛋白神经导管的制备及周围神经缺损的修复研究》文中研究指明周围神经损伤是临床上常见的病症,其修复与再生是神经科学领域的研究热点。当损伤距离较短时,周围神经能自我修复,但是长距离缺损,必须借助神经移植物才能完成修复。作为“金标准”的自体神经移植存在来源匮乏、供体与损伤神经尺寸不匹配等不足,因此寻求合适的人工神经移植物,引导、促进神经再生,加快功能重建是科研人员努力的目标。理想的人工神经移植物必须具备良好的生物相容性和与植入组织匹配的力学性能。大量研究表明蚕丝的丝素蛋白具有良好的生物相容性,但蚕丝在脱胶过程中力学性能大幅度下降。为构建符合要求的人工神经移植物,本课题以天然蚕丝为基本原料,将传统的编织法与静电纺丝法相结合,制备兼具良好生物相容性和力学性能的具有复合结构的丝素蛋白神经导管(CSF-NGCs),对导管进行生物安全性评价,并将其用于修复大鼠10 mm坐骨神经缺损,通过一系列方法评价其修复效果。主要研究内容和结论如下:利用静电纺丝法制备CSF-NGCs的内层和外层,借助扫描电子显微镜(SEM)研究了溶液浓度、电压、推进速度对静电纺纳米纤维形貌和尺寸的影响,筛选出最优工艺参数为:溶液浓度:18%,电压:21 kV,推进速度:0.2 mL/h。用自改装的编织机编织丝素纤维网,通过改变携纱器的运转速度和编织物向上提拉速度,获得具有不同编织角和编织密度的丝素网。测试所制备导管的拉伸性能、抗手术缝合线强度以及抗压性能,分析了编织角、编织密度对三种力学性能的影响。通过比较最终用于后续实验的CSF-NGCs拉伸时最大荷重为16.3 N,将导管拉破时拉力与2倍管壁厚度的比值Fpull-out/2t值是3.5N/mm,抗压试验中形变50%时对应的荷重达2.1 N,各项指标都与文献报道结果相当,同时明显优于单纯静电纺丝素导管。后续缝合术和体内试验证实了这一点。根据实验操作要求与力学性能测试结果,确定编织最佳工艺参数为:携纱器运行速度:3.6 rpm,编织物上提速度:4.5 cm/min。测定CSF-NGCs的壁厚、表面形貌、孔隙率、吸水性、通透性,结果表明CSF-NGCs具有三维多孔纳米结构,吸水性、渗透性良好。对CSF-NGCs进行体外模拟降解,分析了降解过程中丝素力学性能、蛋白结构、质量等的变化,结果表明CSF-NGCs在体外蛋白酶XIV溶液中可降解。通过静电纺丝法制备了静电纺丝素纳米纤维膜,将膜与雪旺氏细胞及背根神经节共培养,培养3天和5天时拍照,并进行扫描电镜和免疫荧光染色观察,MTT法检测细胞活力,同时用实时PCR检测雪旺氏细胞BDNF和NGF mRNA的表达及释放情况。结果表明静电纺丝素纳米纤维膜与周围神经组织、细胞具有良好的生物相容性,为神经导管的构建及体内研究奠定了基础。按照GB/T 16886规定的方法,通过遗传实验(包括Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验、小鼠精子畸变实验)、体外细胞毒性实验、皮内实验、迟发型超敏反应试验、皮下植入局部反应试验、急性全身毒性实验对所制备的CSF-NGCs进行了生物安全性评价,结果表明CSF-NGCs无遗传毒性和细胞毒性、对皮肤无刺激性和潜在致敏性、无急性全身毒性作用,生物相容性好,可生物降解,符合GB/T 16886关于医疗器械生物学评价的相关标准。将制备的CSF-NGCs用于桥接SD大鼠坐骨神经10 mm缺损(导管组),另设自体组和缺损组。术后1、3、6个月,以Catwalk步态仪检测、分析其运动功能的恢复情况;术后3、6个月行热痛觉测定、运用光镜观察靶肌形态并利用图像分析系统进行计量分析;术后6个月进行电生理检测,对再生神经进行免疫组化染色,运用光镜和电镜技术观察再生神经形貌并进行统计分析。结果:移植术后,随着时间推移,导管组和自体组各方面功能都在逐步恢复,自体组恢复较快,导管组恢复较慢,3个月时两组间存在较大差异,但术后6个月,所有检测项目结果与自体组的差异都不具统计学意义,而与缺损组间差异显著。术后6个月具体数据:(1)自体组、导管组、缺损组步态规律指数RI分别为:85%、79%、29%(95%以上为正常),坐骨神经功能指数SFI分别为-55、-58、-85(0为完全恢复,-100为完全损伤);(2)用爪痛测试仪记录大鼠热痛阈潜伏期,非术侧、自体组、导管组平均潜伏期分别为7.78 s、9.15 s、10.23 s,缺损组大鼠脚基本不动,所以时间都超过设定值20.1 s;(3)电生理检测:自体组、导管组的腓肠肌复合肌动作电位(CMAP)波幅分别相当于非术侧的72.7%和65.3%,导管组、自体组和非术侧的神经传导速度分别为28.10±4.03 m/s、35.57±3.49 m/s和50.00±3.18 m/s,缺损组未记录到CMAP;(4)自体组、导管组、缺损组腓肠肌湿重比分别为0.64、0.57、0.18,肌纤维平均横截面积分别相当于非术侧的82.9%、74.8%、9.8%;(5)免疫组化结果显示导管组和自体组的轴突排布都比较乱,直径也较非术侧小,缺损组只有极少量神经纤维;(6)电镜观察结果:导管组和自体组的有髓神经纤维都比较紧密,虽然髓鞘厚度不及非术侧,但有完整的基底膜。非术侧、自体组、导管组髓鞘厚度分别为:1.38?m、0.78?m、0.65?m,神经纤维直径分别为2.31?m、1.62?m、1.51?m,缺损组几乎无有髓神经。综上所述,各实验结果表明术后6个月,导管组大鼠运动功能、感觉功能都恢复良好,修复效果和自体组相当。本课题的研究工作为制备人工神经导管提供了新思路,新方法,相关结果为新制备导管在组织工程领域的进一步研究与应用提供了理论基础和依据。
崔成喜[10]2015年在《长期联合应用小剂量FK506和氯化锂对大鼠坐骨神经端侧吻合后神经再生作用的观察》文中研究指明目的:1.探讨FK506和氯化锂促进大鼠坐骨神经损伤后再生的效果及机制;2.比较使用FK506和氯化锂在修复大鼠坐骨神经损伤的可行性及优越性;3.探讨不同剂量FK506和氯化锂对坐骨神经损伤后修复和再生的影响及功能恢复的评价,为临床治疗周围神经损伤奠定基础。方法:成年SD大鼠49只,在接受端侧吻合术后被随机分配到7个不同的组中:A组,7只大鼠均接受腹腔注射0.9%生理盐水1mg/kg/d;B组,7只大鼠均接受腹腔注射FK506 1mg/kg/d;C组,7只大鼠均接受腹腔注射FK506 0.5mg/kg/d;D组,7只大鼠均接受腹腔注射氯化锂85mg/kg/d;E组,7只大鼠均接受腹腔注射氯化锂40mg/kg/d;F组,7只大鼠均接受腹腔注射氯化锂40mg/kg/d和FK506 0.5mg/kg/d;G组,7只大鼠均接受腹腔注射氯化锂85mg/kg/d和FK506 1mg/kg/d;手术后,每天对大鼠进行腹腔内注射,共12周。术后大体观察实验大鼠手术切口、肢体肿胀、肢端溃疡形成及肢体恢复自主运动情况;分别2周、4周、6周、8周和12周进行功能学检查和分析。术后12周测量趾长伸肌湿重比值、检测神经电生理、免疫组织化学指标以观察评价神经再生和功能恢复的情况。结果:1.实验动物数量及大体观察实验选用大鼠49只,高剂量联合应用FK506和氯化锂组有2只因免疫抑制剂影响导致死亡,有47只模型进入到最终分析。所有大鼠术后切口均顺利愈合,无死亡和感染。少量大鼠见足底溃疡,均在两周内愈合。术后早期所有大鼠后肢运动笨拙,膝关节屈曲障碍。术后第l2周处死前观察,各使用药物治疗组大鼠的术侧膝关节手术后屈曲障碍得到了改善明显,针刺反应灵敏。而对照组改善较差,针刺反应较迟钝。术前的实验动物的体重之间无统计学的差异,然而应用药物治疗后实验组b组、c组、f组、g组动物体重明显低于对照组有统计学差异(p<0.05),其中d组licl85mg/kg/d和e组licl40mg/kg/d与对照组0.9%生理盐水1mg/kg/d之间无统计学差异(p>0.05)。(见图5)2.足印分析结果术后第2,4,6,8,10,12周时进行大鼠坐骨神经指数测量并比较:在各组中,正常步态的足印(左侧显示为后爪各趾充分伸展),而术侧(右侧则显示为后爪“足下垂”且屈曲挛缩,各趾内收)。术后12周时,6个药物治疗组sfi与对照组间比较差异有显著性意义(p<0.05),但是各实验组之间sfi无明显统计学差异(p>0.05)。(见表1)3.趾长伸肌肌湿重质量术后12周处死大鼠后切取趾长伸肌,在分析天平上称出肌肉的湿重并观察小腿肌肉萎缩情况,并按照如下公式计算:实验侧肌肉湿重与正常侧的百分比=实验侧肌肉重量/对侧肌肉重量。a组与各实验组间的差异在统计学上有意义(p<0.05),实验组中b组和f组间差异无显著统计学意义(p>0.05),但均优于其他实验组(p<0.05)。(见表2)4.免疫组织化学检测术后12周,药物治疗组可见大量再生有髓神经纤维和无髓纤维混合,雪旺细胞形态正常,包绕再生轴突形成有髓纤维,大多数髓鞘结构发育良好,呈同心圆板层样结构,少数为未完全闭合的不成熟髓鞘。对照组,可以观察到再生的神经纤维稀疏,髓鞘发育不良。s100及nf染色,药物治疗组要优于对照组(p<0.05),但是各个药物之间无统计学差异(p>0.05)。(见表3,图3,图4)5.神经电生理检测药物治疗组大鼠的神经传导速度上均优于空白对照组,对照组的神经传导速度第6周和第12周的数据上并无好转倾向(p>0.05),药物治疗组间两两比较后12周的数据上均明显优于第6周的数据(p<0.05)。(见表4)结论:1.fk506和氯化锂对坐骨神经损伤的再生都具有明显的促进作用。2.长期小剂量联合应用fk506和氯化锂处理后可在短时间内降低周围神经损伤后发生的免疫排斥反应,从而迅速改善坐骨神经损伤后再生的微环境,以利于神经再生速度和质量的提高,取得了与高剂量联合用药组同样的治疗效果,却并没有发生致命的不良反应,对于临床应用免疫抑制剂有潜在的意义。
参考文献：
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[10]. 长期联合应用小剂量FK506和氯化锂对大鼠坐骨神经端侧吻合后神经再生作用的观察[D]. 崔成喜. 承德医学院. 2015