金飞
（上海市徐汇区中心医院消化科 上海 200031）
【中图分类号】R730 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）20-0368-04
1.研究背景
原发性肝癌是严重威胁人民生命健康的恶性肿瘤，在世界范围肝癌发病率占恶性肿瘤发病率第5位，肝癌致死亡数占恶性肿瘤死亡数第3位，其中约一半肝癌病例发生在中国[1]。肝癌发生的风险因素包括肝炎病毒（如乙肝、丙肝）的慢性感染、肝硬化、食物中黄曲霉素污染、性别、年龄、遗传背景等。在全球范围内，50%肝癌患者有慢性乙肝感染[2]。由于中国是乙肝感染大国，中国肝癌患者70%以上为乙肝病毒慢性感染者。中国肝癌的另一个特点患者性别的显著不平衡性，男女性别比约3-4：1[3]。
肝癌的易感基因研究仍然有待深入[4]。研究提示雄性激素及其信号转导通路与肝癌的发生有关。有来自中国上海的研究显示，乙肝携带者的血清雄激素水平与肝癌发生相关[5]。雄激素代谢途径涉及许多基因编码的代谢酶，其中，类固醇5a-还原酶Ⅱ基因(SRD5A2)编码的类固醇5a-还原酶Ⅱ是雄激素代谢途径最重要的酶，该酶在前列腺等组织中催化睾丸酮转变为活性更高的双氢睾丸酮[6]。双氢睾丸酮与细胞膜上雄激素受体（AR）结合形成复合物，复合物进入细胞核内，激活一系列基因的表达，产生多种生理或病理效应[7]。
SRD5A2基因位于染色体2p23,全长56.48Kb，在负链上，从碱基31806136 至31749652 (NCBI 37,August 2010)，有5个外显子和4个内含子[8]。类固醇5a-还原酶Ⅱ在细胞内分布广泛，包括胞浆、微粒体、内质网、细胞膜等。有报道，高水平的雄激素与前列腺癌有关[9]，亚洲人前列腺癌低发病率与低雄激素水平有关[10]。非那雄胺用于前列腺癌的治疗和化学预防取得很好的疗效[11]。该酶还有其他重要功能，如细胞间信号通讯、细胞分化等[12]。SRD5A2基因先天性缺失导致假两性畸形[13]。
在SRD5A2基因中有数个错义SNP，其中常见等位基因（次等位基因频率大于5%）V89L突变 (C>G导致亮氨酸转变成缬氨酸, rs523349) 导致酶活力的升高，VV纯合突变的酶活力是LL野生型酶活力的1.4倍左右[14]。由于雄激素与前列腺癌的关系，有多篇研究探索V89L突变和前列腺癌的关系，结果不一致，最近一篇Meta分析显示该突变与前列腺癌无明确关联性[15]。
有数篇研究探索了肝癌与SRD5A2的V89L突变的相关性并且得到阳性关联结果。2001年台湾学者Ming-Whei Yu等报道[16]，在乙肝感染的男性人群队列中，检测119个乙肝相关肝癌和238个乙肝阳性对照，发现雄激素睾丸酮水平、SRD5A2多态性V89L影响肝癌的发生。纯合突变VV较野生纯合LL明显增加肝癌风险(VV versus LL：OR=2.47;95% CI=1.21-5.03)。2003年另外一篇来自香港YING-MAN SUNG等的研究报道[17]，在乙肝感染的男性人群中，检测了117个乙肝相关肝癌和102个乙肝携带者对照人群，发现含有V等位基因（显性模型）较野生纯合LL明显增加肝癌风险（OR=1.86,95%CI:1.02-3.39）。一篇来自意大利的肝癌与V89L关联性研究，纳入人群均是丙肝感染者，未得到阳性结果[18]。最近我们利用飞行时间质谱技术检测了290例乙肝相关肝癌和255例乙肝感染对照者SRD5A2基因的V89L多态性，发现等位基因V较L增加肝癌风险（等位基因OR=1.27, 95%CI:1.00-1.62）（文章待发表）。因为研究的背景人群不同（亚洲人与欧洲人）、背景疾病不同（乙肝感染与丙肝感染），因此我们在Meta分析时剔除意大利的研究。Meta分析纳入包含我们研究的共三个研究（526例肝癌，595例对照），均是亚洲男性人群，均有乙肝感染背景，同质性好。Meta分析显示，研究间无明显异质性，在固定效应模型下，该等位基因以显性模型影响肝癌的发生：含有V等位基因（显性模型）较野生纯合LL明显增加肝癌风险（OR=1.51, 95%CI: 1.15-1.99）（见图2）。
敏感性分析显示荟萃分析结果稳健，表明结果可信度较高。由于在对照组人群中带有显性基因V的比例较高，经过计算，显示约27.7%的乙肝相关性肝癌发生归因于V等位基因的作用（人群归因风险，population-attributable risk, PAR），可以理解为如果在人群中消除了V等位基因的作用，肝癌的发病率将减少27.7%。
雄激素信号通路与肝癌有关还得到分子机制研究的支持：雄激素可以增加HBV的转录[19]；同时，HBVX蛋白增加雄激素受体（AR）信号通路的活性[20]，因此形成正反馈机制。乙肝感染的男性较女性更易发生肝癌，即肝癌的性别不平衡性的原因，一方面与雄激素信号通路异常有关，另一方面与HBV-AR信号通路的协同作用有关[21]。
SRD5A2除了参与雄激素代谢途径外，还有其他重要功能，信号转导、细胞分化等。因此，SRD5A2在肝癌的作用还有待深入研究。
本研究欲解答的问题：（1）我国主要的乙肝相关肝癌中SRD5A2基因的表达情况，SRD5A2蛋白表达情况，SRD5A2酶活性高低；（2）基因沉默或基因导入SRD5A2是否改变肝癌细胞的表型；（3）SRD5A2是否与肝癌的预后、病理分级等临床特征相关。
2.研究方法
2.1 肝癌细胞株和正常杆细胞株雄激素代谢基因的mRNA表达：3个细胞样品HepG2、Huh7和L-02，抽提RNA，反转录到cDNA后，用sybr染料法相对定量目的基因SRD5A1、SRD5A2、SRD5A3和AR的表达量，内参为人Beta-actin基因；研究使用的肝癌细胞株有不表达乙肝病毒（HBV）的HepG2和表达HBV的PLC5, Hep3b肝癌细胞株。
2.2 免疫组织化学染色石蜡切片，分析肝癌组织和癌旁组织SRD5A2蛋白表达差异；
2.3 利用基因转染、shRNA干扰技术，研究SRD5A2基因过表达和基因干扰状态下，在雄激素预处理情况下，对肝癌细胞株和正常肝细胞株凋亡、增殖的影响；
2.4 根据人SRD5A2（NM_000348）基因的序列信息进行突变引物设计，将第336位的CTA突变为GTA，同时在野生型SRD5A2（L）后面加入FLAG标签序列，在突变后的SRD5A2（V）后面加入Myc标签序列。进行等位基因特异性转染，在雄激素（睾酮）预处理情况下，对肝癌细胞株和正常肝细胞株凋亡、增殖的影响。
3.研究结果
3.1 雄激素代谢基因的mRNA表达：QPCR数据结果显示，目的基因SRD5A1的相对表达量为：HepG2>Huh7>L-02；目的基因SRD5A2的相对表达量为：HepG2>Huh7>L-02；目的基因SRD5A3的相对表达量为：HepG2>L-02>Huh7；目的基因AR的相对表达量为： L-02> Huh7≈HepG2；
3.2 SRD5A2蛋白在肝癌和癌旁的表达，免疫组织化学法显示无统计学差异。
3.3 目的基因表达和干扰载体的建立、筛选
全基因合成委托方指定的基因SRD5A1和SRD5A2，分别构建至pcDNA3.1载体中构建表达载体。同时根据委托方提供两个目的基因SRD5A1和SRD5A2设计干扰序列，合成oligo后退火至线性化的pENTR/U6/GFP载体中，验证正确质粒提取。分别将干扰质粒与表达质粒共转染HepG2细胞，设阴性对照组和空白细胞组。QPCR筛选得到干扰效果最好的两个质粒进行提取。
结论：QPCR数据结果显示，目的基因SRD5A1的干扰效率为：SRD5A1-536> SRD5A1-573> SRD5A1-476。目的基因SRD5A2的干扰效率为：SRD5A2-505> SRD5A2-382> SRD5A2-769。
3.4 目的基因SRD5A1,SRD5A2的干扰下调和转染上调对肝癌细胞HepG2的影响。结论：MTT数据结果显示，目的基因SRD5A1及SRD5A2的下调和上调质粒均对HepG2细胞增殖无明显影响。
流式检测细胞凋亡结果显示，目的基因SRD5A1及SRD5A2的下调和上调质粒均对HepG2细胞凋亡无明显影响：
3.8 实验结果总结：
野生型SRD5A2-L及突变型SRD5A2-V的1:1混合组对不表达HBV的HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用；
但是，在表达HBV的Hep3b肝癌细胞，野生型SRD5A2-L对肝癌细胞有一定程度的促增殖作用。
4.讨论
SRD5A2是雄激素代谢通路中重要的转化酶，可以增强性激素活性，增加雄激素受体信号通路活性。有研究显示，雄激素受体信号通路与乙肝相关性肝癌的发生有关。我们的研究显示，在雄激素处理情况下，SRD5A2-L对Hep3b有一定程度的促增殖作用。实验结果与预期有不吻合之处，可能的原因有肝癌细胞株本身的基因型有关，需要进一步研究在敲除本身SRD5A2基因后再转染不同基因型对癌细胞的表型影响。
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“致谢：该课题接受上海市科委2012自然基金资助（编号：12ZR1429200）。”
论文作者:金飞
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第20期供稿
论文发表时间:2015/10/9
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