延边大学附属医院 吉林延吉 133000
摘要：目的：探讨HM7和HT29两种细胞间存在放射敏感性差别的机制。方法：应用RT-PCR方法获得HM7、HT29中毛细血管扩张性共济失调症突变基因（Ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM gene）编码序列主要功能区PI3K区（8577nt-9122nt）546bp片段，经荧光标记ddNTPs循环测序法进行突变检测。结果：在HM7和HT29的细胞株中，均未发现ATM/PI3K区域的序列突变。结论：在HM7和HT29两种大肠癌细胞株间的放射敏感性的差别是由我们所测的ATM/PI3K区域序列突变之外的因素引起。
关键词：HM7；HT29；ATM基因；辐射敏感性
ABSTRACT Objective：To investigate the mechanism of the difference between the two cell types of HM7 and HT29.Methods：Reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to obtain the gene fragment of the main functional region of PI3K region（8577nt-9122nt）546bp，which was encoded by Ataxia telangiectasia-mutated（ATM）gene in the cells of HM7 and HT29.The ddNTPs cycle sequencing with fluorescence labeling was used to detect the mutation of gene.Results：In HM7 and HT29 cell lines，the sequence mutation of ATM/PI3K region was not found.Conclusion：The differences in the radiation sensitivity between the HM7 and HT29 cell lines may be caused by some other reasons except the mutations in the ATM/PI3K region.
KEY WORDS HM7 HT29 Ataxia telangiectasia-mutated gene Radiosensitivity
结肠癌细胞中，HM7和HT29两种细胞分别来自低分化的结肠癌组织和高分化的结肠癌鳞状上皮组织。我们在此前的实验中，应用集落形成法求得辐射生物学参数D0，Dq，MID，SF2值，实验结果表明HT29比HM7对放射线更为敏感[1]。这两种细胞间存在的放射敏感性差别，其机制如何？这是我们要探讨的问题。已经知道磷酸肌醇激酶-3（phosphafidylinositol-3k Lnase，PI3K）基因家族成员ATM基因在识别DNA损伤、信号转导通路以及调控细胞周期中起着非常重要的作用[2]。在ATM基因中PI3K功能区的突变将会导致细胞对放射的敏感性的变化[3]。大肠癌细胞中HM7和HT29细胞株放射敏感性的差异是否与ATM基因PI3K功能区有关，尚未见报道。我们采用荧光标记的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）循环测序法对HM7和HT29细胞株的ATM/PI3K区域序列进行突变检测，研究他们之间的相关性。
材料与方法
1 细胞株 人大肠癌细胞株HM7、HT29由韩国忠南大学校医科大学分子生物学教研室提供。用含10%小牛血清（国产）DMEM培养基（Gibco公司）在37℃、5%CO2培养箱常规培养。
2 研究方法
2.1 引物的合成和设计：我们使用的引物的基因序列是：上游5-cagtgcctttcagtgcc-3，下游5-gtttcatettccggcctctg-3，由上海生物工程技术服务有限公司合成。而引物的设计方面，是使用了Primer 5.0软件，进而设计了针对ATM基因在PI3K功能区546bp（8578nt～9123nt）的引物，我们的依据是GenBankDatabase提供的ATM基因的mRNA序列。
2.2 RNA提取操作和RT-PCR：采用Trizol一步法提取总RNA。应用紫外分光光度计测得样品的A260和A280值，用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，其余在-80℃条件下保存。按逆转录试剂盒说明书操作反转录合成cDNA，产物在-20℃条件下保存。取反转录产物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括10X Bufer5L，10mmol/L dNTP1L，上下游引物各2μL，cDNA模板5μL，Taq酶lL，ddH2O 3μL。VEGF-C的反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性lmin，55℃退火1min，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；GAPDH作为内参照基因，与目的基因逐一对应并同时进行PCR反应，以达到定量的目的。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳EB染色观察结果。以平均吸光度X条带面积来显示总的吸光度，并且以此代表mRNA的量。凝胶图像分析系统以VEGF-C与内参照基因（GAPDH）电泳带的吸光度比值作为VEGF-C mRNA的表达量指标。
2.3 序列分析和PCR产物提纯操作：我们采用的测序模板是经过乙醇沉淀法进行提纯之后的PCR产物，使用377测试设备经过荧光标记的ddNTPs循环测试法，来收集荧光信号，进行电泳操作，并分析结果。
结 果
1 检测RNA的品质 通过光密度的方法，检测结果表明RNA样本具有较好的纯度情况，检测的数据值为1.8～2.0，在1.2%琼脂糖凝胶电泳的条件下，经过紫外线检测仪可以清晰的看到5S、18S以及28S三条色带，其中28S的色带是最亮的，约是18S的1.5～2.5倍，结果显示RNA样本具有良好的品质。（如图1所示）
2 RT-PCR 从HT29、HM7中提取的mRNA经RTPCR后均出现特异性的DNA条带（见图2）。
3 DNA序列检测 经过对两种细胞株HM7和HT29的RT-PCR分析了他们反向和正向的序列之后，显示与ATM基因在GenBank Database中的情况一样。
讨 论
随着分子生物学的发展，已经有非常多的证据表明细胞的放射敏感性与其基因有关[4，5]。其中ATM基因逐渐成为研究细胞放射敏感度很好的切入点。ATM基因定位于人类染色体11q22-23，其表达基因（mRNA）为13kb。由于ATM基因3´端序列与PI3K序列的同源性，故在DNA损伤修复以及细胞周期信号传导中处于关键位置[6，7]。我们选择了作为ATM基因mRNA编码ATM蛋白PI3K区关键区域序列（8578nt~9123nt，546bp）[8]为靶点，对大肠癌细胞株HM7和HT29的放射敏感性进行了研究。应用RT-PCR方法获得HM7、HT29中ATM基因编码序列主要功能区PI3K区（8577nt~9122nt）546bp片断，然后进行突变检测。结果表明，在HM7和HT29的细胞株中，均未发现ATM/PI3K区域的序列突变，提示这两株大肠癌细胞株间的放射敏感性的差别由我们所测的ATM/PI3K区域序列突变之外的因素引起。我们的这一实验结果与王宏梅对CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的检测的研究结果一致[9]。因ATM基因编码序列有12kb，其中PI3K区全长为1.2kb，本次实验只检测ATM基因中mRNA编码ATM蛋白PI3K区的关键区域546bp，所以我们不能排除HM7和HT29中ATM基因的其它区域发生突变而影响其放射敏感性的可能；另外，细胞的放射敏感性涉及多种分子生物学过程，所以ATM基因突变以外的因素也可参与并导致了大肠癌细胞株HM7和HT29之间放射敏感性的差异。
参考文献：
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[7]Cao LL，Wei F，Du Y，et al.ATM-mediated KDM2A phosphorylation is required for the DNA damage repair[J].Oncogene，2015 Mar 30.[Epub ahead of print]
[8]Ambrose M，Gatti RA.Pathogenesis of ataxia-telangiectasia：the next generation of ATM functions[J].Blood，2013，121（20）：4036-4045.
[9]王宏梅，伍新尧，夏云飞，等.CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的检测[J].遗传，2003，25（3）：276-278.
作者简介：于洋（1988），男，硕士在读，主要从事大肠肿瘤基础与临床研究。作者单位：延边大学附属医院 吉林省延吉市 133000
通讯作者：延边大学附属医院胃肠外科
基金项目：国家自然基金资助项目（30960368）
论文作者:于洋,许臻,李革（通讯作者）
论文发表刊物:《健康世界》2015年30期供稿
论文发表时间:2016/4/12
标签：细胞株论文; 基因论文; 序列论文; 敏感性论文; 突变论文; 引物论文; 细胞论文; 《健康世界》2015年30期供稿论文;