代红霞 田艳红
(保定市传染病医院 河北保定 071000)
【摘要】 肠道病毒EV71（EV71）是引起手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)主要病原体，可引起严重的神经系统并发症，是手足口病婴幼儿死亡的主要原因。由于临床上尚无有效的治疗手段，目前疫苗的研发迅速，已有疫苗用于临床实验阶段。本文主要对全病毒灭活疫苗, 病毒样颗粒疫苗,减毒活疫苗的研发进展和存在的优缺点作一综述。
【关键词】肠道病毒EV71；手足口病；疫苗
【中图分类号】R726 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）23-0083-03
肠道病毒71（EV71）1963年在荷兰被首次发现，1969年美国第一次对其描述[1]。EV71引起手足口病，主要通过粪口传播，可引起严重的神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑干脑炎，脊髓灰质炎，脑脊髓炎和死亡。幸运的是，一些后备的EV71疫苗已经被报道，由于动物模型得到很好的效果，自2010年开始用于临床试验阶段。但是我国研制的一株EV71灭活疫苗在Ⅲ期临床试验中的结果显示，并不能有效地预防手足口病的发生，与研究者之前普遍认为的EV71疫苗乐观的前景相矛盾，提醒我们应该重新思考EV71疫苗研究中存在的问题。
1.EV71疫苗研究的进展
到目前为，没有任何的临床治疗手段和疫苗能有效的阻止EV71感染儿童。但是疫苗确实最后的的控制和阻止EV71流行的有效手段。接下来我们总结了各种后备疫苗的研究进展，并进行了比较分析。
2.疫苗的研发进展和存在的优缺点比较
2.1全病毒灭活疫苗（inactivated whole-virion vaccine）
全病毒灭活疫苗是最安全的生产疫苗的方法，生产工艺成熟，有良好的免疫原性，例如流感病毒，脊髓灰质炎病毒或者狂犬病毒。灭活的EV71是作为疫苗最主要的备选方案。福尔马林灭活EV71疫苗在小鼠和恒河猴的体内实验中，表现出令人满意的免疫保护性水平和中和抗体的交叉反应。一般而言，制备灭活疫苗的毒株应该具有较强的毒力。研究发现通过观察病毒的增殖曲线及空斑试验和乳鼠攻击试验，选择滴度高、形成空斑较大且乳鼠致死时间短、毒力较高的病毒株作为疫苗的候选株。目前五个研究机构（中国大陆三个，台湾一个，新加坡一个）采用不同的技术生产EV71疫苗，并在不同的临床试验阶段进行EV71疫苗的试验。EV71的C4亚型是目前中国大陆主要流行的菌株，所生产的疫苗军委C4亚型，到2013年在中国大陆三家公司，分别为：北京Vigoo生物公司(Vigoo),北京兴科生物公司(Sinovac) 和中学医学科学院(CAMS)生产的疫苗均进入III期临床试验，结果表明这些疫苗均有较好的免疫原性及安全性。Vigoo和Sinovac使用的是非洲绿猴肾细胞无血清培养，但是CAMS使用的人双倍体细胞KMB-17有血清培养。虽然都为EV71C4亚型，但三家公司是同型不同株。基于中国的EV71抗原参考标准1600U/ml，利用定量ELISA是感染剂量明确活跃的EV71抗原量为421.1U/ug。Vigoo在2011年1月份开始的I期临床试验，100名志愿者，成人40（16～22岁）位，儿童（6～15岁）60位。分组后在第1天和第28天分别接种160U，320U，和640U。接种EV71疫苗后使用中和抗体试剂，检测和计算其免疫原性，包括几何平均滴度和血清阳性率，100名参与者没有出现严重的副反应。Ⅱ期临床试验，Vigoo公司随即选取1200志愿者（12～36月龄和6～11月龄婴儿）。接种福尔马林灭活的加入明矾佐剂的EV71疫苗，剂量为160U，320U和640U。其中一组儿童和婴儿接种剂量为640U没有添加佐剂的疫苗。结果显示，添加佐剂的志愿者组表现出更强的免疫反应。剂量为320U和640U添加佐剂的志愿者组其几何平均滴度和血清阳性率没有表现出明显的不同。给予中国市场的要求，剂量为320U添加明矾佐剂的EV71的疫苗被用于Ⅲ期临床试验。大约10000名6～35月龄的儿童随即接种320U添加明矾佐剂的疫苗或者安慰剂。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆一些志愿者表现出EV71相关的手足口病或者与EV71相关的疾病，但是接种疫苗的志愿者表现出了高的疫苗效力（大于90%的抗手足口病和80%抗EV71相关的疾病，包括疱疹性咽峡炎或者神经性症状）保护儿童抵抗EV71的感染。2010年12月Sinovac公司开始了EV71临床试验，虽然使用的剂量与Vigoo公司不同，但志愿者在I期临床试验中，产生了免疫反应。在Ⅱ期临床试验中，福尔马林灭活的EV71疫苗添加氢氧化铝佐剂和安慰剂组对照，结果显示，在剂量为400U时，疫苗表现出更好的几何平均滴度和免疫原性。在Ⅲ期临床试验中，使用明矾佐剂的疫苗和安慰剂。结果显示88%可以抵抗与EV71有关的疾病。CAMS生产的疫苗从2011年6月份开始在临床I期试验，到现在的Ⅱ期和Ⅲ期都表现出安全和产生满意的免疫原性。台湾生产疫苗针对的是B4亚型，新加坡针对B3亚型。EV71菌株均使用非洲绿猴肾细胞无血清培养。台湾国家卫生研究院（NHRI）研制的疫苗I期临床试验结果显示诱导了强的免疫反应。而且展示出了交叉免疫抗体抵抗B1，B5和C4A，但对其C4B和柯萨奇病毒（Coxsackievirus）A型16（CVA16）的交叉免疫抗体反应很弱。新加坡疫苗研究也已完成I期临床试验，但结果尚未公布。虽然EV71灭活疫苗展示了较好的临床试验结果，但仍有一些问题存在。由于不同地区手足口病发病率和病原谱存在很大差异，致使疫苗评价差异较大。
2.2 病毒样颗粒疫苗（virus like particles VLP）
病毒样颗粒由病毒衣壳蛋白组成空壳粒子，组织结果类似真实的病毒，由于缺乏病毒的核酸，故没有感染性。研究显示病毒样颗粒可以启动小鼠和猴体内强大的免疫反应，对抗病毒，起到保护机体的作用。最新报道显示病毒样颗粒引起的一系列反应是树突细胞通过toll样受体4信号的活化实现的[2]。以病毒样颗粒为基础的预防性疫苗已经成功的应用于肝炎乙型病毒和人的人类乳头瘤病毒。VP1蛋白是EV71主要的结构蛋白，存在EV71主要的抗原表位，在中和EV71中发挥着重要的作用。很多方法可以促进VP1的表达，其中在埃希氏大肠杆菌中生产出的重组VP1蛋白通过腹膜注射老鼠，可诱导免疫发应。例如VP1的210-220是EV71重要的中和表位，位于病毒衣壳的表面，在VP2EF环的旁边（136-150）形成单一的表面抗原表位。破坏颗粒上的211-217可能降低免疫原性。病毒样颗粒中的VP1常被假设成为空的EV71病毒颗粒中的VP1来进行研究，轻微的空颗粒中VP1构象改变可能影响它的中和能力。研究显示，病毒样颗粒疫苗不仅可以阻止病毒对机体严重的损害，更可以促进EV71感染导致机体的损伤快速的恢复。用杆状病毒表达的VP1作用小鼠后没显示可以抵抗EV71亚型C4中的Fuyang菌株，而且还可以交叉免疫EV71的其他11种亚型[15]。在兔子和非人类灵长类动物的免疫原性研究中，使用VLP-EV71同时添加明矾佐剂，可以诱导病毒中和抗体反应。研究显示母鼠口服沙门氏菌表达的VP1蛋白或者重组长双歧杆菌表达的VP1蛋白可以保护新生小鼠抵抗EV71。转基因西红柿表达的VP1可作为口服疫苗喂养Balb/c小鼠起到对抗EV71的作用。陈等人利用转基因小鼠中评价VP1蛋白，显示在老鼠分泌的奶汁中存在VP1蛋白，可以保护哺乳期的小鼠抵抗EV71。使口服疫苗成为可能。但之后在猕猴感染动物模型中的评价结果显示VLP疫苗效果不如甲醛灭活的EV71疫苗，其原因可能为EV71的VLP与天然的EV71病毒颗粒存在构象差异，从而影响期抗原性。
2.3 减毒活疫苗(live-attenuated virus vaccine)
鉴于口服脊髓灰质炎减毒疫苗的成功，使得EV71减毒活疫苗成为可能。但由于传统的减毒方式时间长且具有不确定性，使得EV71减毒活疫苗的发展非常缓慢。在2014年之前仅有日本学者Arita等人参照灭活脊髓灰质炎病毒的方法对EV71亚型A的BrCr菌株基因组5′NTR、3D基因和3′NTR进行突变，所构建的一株温度敏感的EV71减毒株[EV71(S1-3′)]。利用猕猴感染的动物模型对EV71减毒株的毒力和免疫效果进行评价。虽然结果显示EV71减毒株有较好的免疫原性，但免疫动物出现了一些神经症状的副反应，并在脊髓中检测到该病毒。说明其毒力未完全消失，存在诱发EV71相关疾病的危险。2014年新加坡陶等人利用病毒唑耐药性筛选出EV71的一种新型的高度保真的突变株，在单链核苷酸中改变了RNA依赖RNA聚合酶的L123F位点（RdRp－L123F），基于EV71RdRp的晶体结构，L123位于RNA模版结合通道的入口，它有可能是形成EV71高度保真度的检查点。细胞培养的结果显示EV71RdRp－L123F突变株的产生使得子代可以抵抗胍的实验，并且表现出低的突变频率和高的复制保真度，并且没有出现生长缺陷。以EV71亚型B4为基础的双突变株RG/B4-G64R/L123F进行AG129小鼠试验，在细胞水平表现出更高的复制保真度和在动物体内更低的毒力作用，给予EV71减毒活疫苗更光明的希望。
3.EV71疫苗存在的问题与展望
EV71感染是一个长期的全世界公共卫生问题，尤其是在东南亚地区。由于对其EV71引起的严重病例，目前没有有效的临床治疗手段，发展预防EV71感染的疫苗迫在眉睫。虽然其灭活疫苗在中国大陆已进入III期临床试验阶段，具有良好的免疫原性，但其多次免疫仍存在潜在的安全风险；病毒样颗粒疫苗与天然的病毒结构存在差异，影响了其免疫原性；合成肽疫苗存在多肽疫苗免疫原性低的通病；减毒活疫苗其病毒的安全性无法保证；合成肽疫苗和基因疫苗的中和病毒能力有限，其免疫效果不甚理想。但是随着动物模型的不断完善，对EV71病毒结构和致病性的的更加了解，其疫苗的发展会更加的完善。
【参考文献】
[1]Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from 2 patients with disease of the central nervous system[J].Infect Dis 1974;129(3):304-9.
[2]WONG S S, YIP C C, LAU S K, et al.Humanenterovirus 71 and hand, foot and mouth disease[J].Epidemiol Infect, 2010, 138 (8): 1071-1089.
[3]Bek EJ, Hussain KM, Phuektes P, et al. Formalin-inactivated vaccine provokes cross-protective immunity in a mouse model of human enterovirus 71 infection[J]. Vaccine 2011;29(29-30):4829-38.
论文作者:代红霞,田艳红
论文发表刊物:《心理医生》2015年23期
论文发表时间:2016/6/20
标签：疫苗论文; 病毒论文; 免疫论文; 佐剂论文; 颗粒论文; 小鼠论文; 灭活论文; 《心理医生》2015年23期论文;