余清[1]1997年在《BMP家族一个新基因的部分cDNA克隆》文中指出BMP是TGF-β超家族的成员之一，具有广泛的生物学活性。自1988年Wozney首次克隆出BMP cDNA以来，不断有BMP家族新成员的基因被克隆，但无一出自国人之手。至今已获得17种人BMP cDNA的克隆，除BMP1外，其余均为TGF-β超家族的成员。 本文以编码人BMP3成熟肽段的cDNA为探针，用核酸杂交、PCR及Southern blot等方法，从人胚肾cDNA文库中筛得4个阳性噬斑，对其中两个含有较长插段的噬斑直接进行序列测定，测得其部分cDNA序列，并命名为P41c和P41d。利用计算机分析技术，将所测序列与基因数据库比较、分析。结果表明：P41d与BMP3 C端序列完全一致；而P41c为一新基因，其序列与人BMP3 C端编码区同源性高达85％，且所编码的氨基酸序列具有BMP家族成员的结构特征：C端含有位置高度保守的7个半胱氨酸；含有内切酶作用的典
柳淑芳[2]2004年在《小尾寒羊多胎性状相关基因的鉴定和遗传研究》文中提出小尾寒羊是世界上具有非季节性发情和多胎特性的高繁殖力绵羊品种之一,揭示小尾寒羊多胎的分子生物学调控机制,无论对于小尾寒羊的选育及有效利用,还是弄清绵羊排卵率多样性产生的分子基础,并选择准确、直观的标记以用于MAS(Marker assisted selection)均具有重要的理论意义和应用价值。本文分别以BMPR-IB和BMP15作为小尾寒羊产羔数性状的候选基因,利用PCR-RFLP方法检测这两个基因的突变情况,对含突变位点的序列进行克隆和测序,并对突变可能造成的调控机制的变化进行预测,研究突变位点与小尾寒羊产羔数性状的相关性,寻找与小尾寒羊多胎性能有关的主效基因,结果发现该品种在BMPR-IB基因的相应位置上发生了与Booroola Merino羊相同的突变(A746G),且针对该突变点进行大规模群体检测时,发现在小尾寒羊群体中该点的突变率较高,达到73.5%,而在单胎品种滩羊群体中未发现突变个体。BMPR-IB位点B等位基因在多胎品种小尾寒羊群体内的频率优势和在单羔品种滩羊群体中的零频率反映出其对繁殖性能具有显著影响作用。通过遗传效应分析,小尾寒羊初产和经产母羊的BB基因型比++基因型分别多产0.97羔(p<0.05),和1.5羔(p<0.01)。这表明,BMPR-IB这个影响Booroola Merino羊排卵数的基因在小尾寒羊中亦存在相同的作用。故可以推测BMPR-IB基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的主效基因或是与之存在紧密连锁的标记。本研究在小尾寒羊群体中未检测到BMP15的V31D和Q23Ter突变,这说明小尾寒羊的多胎遗传机制与Romney羊不同,因此排除了BMP15基因突变影响小尾寒羊排卵数的可能性。本文对另一个与排卵有关的FSHR基因5’端转录启动调控区进行了克隆和分析。通过对小尾寒羊、滩羊和澳洲绵羊FSHR基因的15个转录调控元件序列进行比较,结果不同品系羊之间没有任何差异。说明绵羊元件序列的保守性较强,排除了因转录调控元件突变而影响FSHR基因转录调节能力的可能性。本文采用SMART技术在国内外首次成功构建了高质量的小尾寒羊卵巢组织cDNA文库。该文库的原始容量为5×106,重组率达到96%以上,扩增后库的滴度达1(109 pfu/ml,文库中插入片段大小分布在0.5～5.0kb之间,平均长度为1.5kb左右。随机挑选了380个样品进行测序,共测序968次。通过拼接得到338个ESTs,这些ESTs均具有3’端Poly (A)结构,测序的成功率为88.9%。通过聚类分析将所有ESTs归为191个<WP=11>contig,其中大于2kb的contig有7个,介于2kb和1kb中间的有69个,它们共占contig总数的39.8%。Cluster归类,191条EST中表达频率=1的基因148条,占独立基因总数的77.49%,视为低丰度表达基因;2≤表达频率≤5的基因33条,占独立基因总数的17.28%,视为中丰度表达基因;表达频率>5的基因12条,占独立基因总数的6.28%,视为高丰度表达基因。通过同源性分析发现了许多绵羊发情期卵巢组织特异表达的基因和没有同源匹配序列的新基因。191个ESTs序列中在GenBank和EMBL中未找到匹配同源序列的ESTs为89个;88个EST在人类、牛及鼠等物种中可以找到同源序列,且功能明确,其中只有9个在GenBank的绵羊数据库中可以找到同源序列;另外14个EST虽然找到同源序列,但功能尚不清楚。本文首次探索性地引入DDRT-PCR技术,对多胎品系的小尾寒羊和单胎品系的滩羊卵巢组织影响排卵率的mRNA差异表达的展示进行研究。利用正交法优化反应条件,一次PCR反应即可确定无同位素的银染差异显示最佳反应条件。通过应用三条锚定引物和八条随机引物,共计24个引物组合,并经过反向Northern杂交印证排除假阳性,最终获得24条小尾寒羊卵巢组织差异表达条带。通过BLAST对这些EST进行同源序列搜索,结果有5个EST以多拷贝形式存在,13个EST为单拷贝。18个EST中检索到有编码区且功能已知同源序列的EST有6条,检索到同源序列但无编码区或功能未知的EST有3条,没有匹配序列的新EST有9条。进一步分析表明这些EST分别代表NOS2、tensin、TCRA 、CDKN1A 、ESR1、ACTB 等基因,显然这些基因在小尾寒羊中是特异表达的,至于是否与排卵率相关尚待研究。本文还首次利用DD-PCR技术研究卵泡的发育分化过程中不同阶段之间基因的差异表达。从剥离的有腔卵泡中筛选直径>5mm的大卵泡归为一组,将直径<3mm的有腔小卵泡归为另一组,然后对两组卵泡进行mRNA差异显示。通过初步的差异显示和反向Northern杂交验证,我们获得35条与卵泡发育密切相关的表达基因片断,其中12条在直径>5mm大卵泡中特异表达,23条在直径<3mm的有腔小卵泡特异表达。通过测序和BLAST搜索,有腔小卵泡特异表达的基因有:ESR1、TPTC1、XIST、MTIc、 phosphatidylinositol-3-phosphate associated protein、ODC、RBBP4和C6orf69等;大卵泡特异表达的基因有:SLC25A5、SCRN1、FLJ14775和COL11A1等以及部分未知基因。这表明不同的卵泡发育阶段存在着不同基因表达的差异。这些结果既丰富了GenBank中有限的绵羊EST资源数据库。又为寻找影响小尾寒羊高排卵率的新的候选基因提供了依据。<WP=12>本研究在前期成功构建小尾寒羊卵巢组织cDNA文库的基础上,利用最新的生物信息数据资料,采用同源克隆的策略,以已知其他物种与排卵率相关基因片段标记的探针对小尾寒羊发情期卵巢组织cDNA文库进行筛选、克隆,获得小尾寒羊卵?
邵国超[3]2009年在《肥度性状—耳状QTL重叠区候选基因GDF11和BMP5分离鉴定及遗传效应分析》文中研究表明根据基因生理生化功能、猪肥度形状和耳状QTL定位结果,选取GDF11基因和BMP5基因作为影响猪肥度性状的候选基因。应用比较基因组学和生物信息学等方法进行候选基因的分离鉴定;采用RT-PCR进行部分基因的组织表达研究;利用PCR-RFLP方法检测两个候选基因共7个单核苷酸多态性;以大梅F_2资源家系(322头)为试验材料,进行基因多态性与猪肥度性状关联分析。主要研究结果如下:1.GDF11基因:(1)获得猪GDF11基因2562bp的cDNA序列,其中包括1209bp的编码区序列,286bp的5'UTR序列和1065bp的3'UTR序列。(2)利用罗斯林研究所Prof.Archibald提供的SNP信息,建立了第1内含子的PCR-HhaⅠ-RFLP分型技术。(3)遗传标记与肥度性状的关联分析结果表明:HhaⅠ多态位点与大梅F2资源家系猪的体长显著相关(P＜0.05),基因加性效应显著(P＜0.05);与肋骨数显著相关(P＜0.05),基因加性效应显著(P＜0.05);与臀部背膘厚显著相关(P＜0.05),基因加性效应显著(P＜0.05);与瘦肉率极显著相关(P＜0.01),基因加性效应极显著(P＜0.01)。(4)组织表达谱分析表明,GDF11在11个组织中都有表达,其中在肌肉和脂肪组织中高表达,心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中中量表达,在肺、子宫、卵巢、胃和小肠中微量表达。2.BMP5基因:(1)获得猪BMP5基因2633bp的cDNA序列,其中包括1456bp的编码区序列,658bp的5'UTR序列和519bp的3'UTR序列。(2)利用罗斯林研究所Prof.Archibald提供和自己获得的SNP信息,建立了BMP5基因第1外显子的PCR-SacⅠ-RFLP分型技术、第1内含子的PCR-HpaⅡ-RFLP分型技术、第3内含子的PCR-RsaⅠ-RFLP分型技术、第5内含子的PCR-PstⅠ-RFLP分型技术、第5内含子的PCR-EcoRⅠ-RFLP分型技术和3'UTR的PCR-RsaⅠ-RFLP分型技术。(3)遗传标记与肥度性状的关联分析结果表明:第3内含子RsaⅠ多态位点与背膘厚显著相关(P＜0.05);与内脂和内脂率显著相关(P＜0.05);与肥肉率极显著相关(P＜0.01);与体长显著相关(P＜0.05)。(4)组织表达谱分析表明BMP5在肌肉组织中中量表达,在心脏、肺和肾脏中微量表达,其他组织中不表达。(5)构建了2个miRNA重组载体plet-7c和pmir-184,并在成纤维细胞中进行了超表达,实时定量RT-PCR结果显示miRNA在细胞中高表达,半定量RT-PCR结果显示BMP5 mRNA表达减弱,说明let7c和mir-184可能参与了BMP5的表达调控。上述研究结果显示:GDF11基因第1内含子的HhaⅠ位点和BMP5基因第3内含子的RsaⅠ多态位点可作为猪肥度性状分子遗传标记。对上述基因的分离、鉴定、多态性及表达调控研究有助于我们更深地了解基因的生物学功能,为揭示猪肥度性状分子机理和标记辅助选择的实施提供理论依据。
戴博[4]2002年在《人骨形成蛋白3部分基因的克隆与序列测定》文中研究说明人骨形成蛋白(hBMP)家族中目前已发现的共有13种hBMP分子，除hBMP-1外，都属于TGF-p超家族成员。最初由于它们具有诱骨活性而被发现和重视，新的研究表明，人骨形成蛋白不仅在治疗骨缺损和骨不连方面显示出极大的应用价值和潜力，而且在胚胎发生、神经细胞分化、造血组织发育、精子发生、胎盘形成，以及诱导细胞凋亡等诸多方面都有着重要的作用，故一度成为国内外学者研究的热点。人们先后利用基因工程的方法在大肠杆菌以及COS、CHO、昆虫等真核细胞中表达该基因，但截止目前国内外尚未见到有用乳腺细胞表达hBMP的报道。对于功能基因hBMP-3的获取，国内外学者大多采用从人cDNA文库中筛选的方法。利用筛库的方法获得基因有一定的优点，但这种方法也存在着工作量大，前期投入高等缺点。鉴于此，本研究拟通过RT-PCR的方法克隆该基因，为利用转基因动物乳腺生产人骨形成蛋白创造条件。 本实验以人骨纤维肉瘤为实验材料，采用RT-PCR技术对人骨形成蛋白3基因的部分cDNA进行了扩增、克隆、序列测定和分析。实验首先用TRIZOL试剂成功地从液氮中保存的人骨纤维肉瘤组织中分离得到总RNA。将总RNA反转录成为CDNA。以CDNA为模板，根据人骨形成蛋白3基因的cDNA序列设计引物(正链引物：5′-acatcgctaaccaagtctga-3′，20-nt；负链引物：5′-gagcaataataggcatcaaag-3′21-nt)，扩增出一条长度约为850bp的特异片段。PCR扩增条件为：94°C变性2min，然后以94℃变性30sec，52.5℃退火30sec，72℃延伸1.5min为1个循环，循环35次，最后于72℃再延伸lOmin。使用DNA胶回收试剂盒回收和纯化该片段。将回收片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5Q，经过蓝白斑筛选，HindⅢ酶切和PCR鉴定后测序。结果显示所得到的片段大小为845bp，与Genebank中公布的hBMP-3基因相应片段的序列同源性为100％，完全吻合。根据845个核苷酸序列推导出相应的280个氨基酸的序列。 以上实验结果证明：我们已经成功地扩增、克隆了人骨形成蛋白3(hBMP-3)基因cDNA的大部分序列，为开展利用转基因动物乳腺生产人骨形成蛋白创造了条件。
何小龙[5]2010年在《蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究》文中认为绵羊的繁殖性状一般分为受胎率、多胎率及羔羊存活率三类性状,繁殖性能的高低直接关系到养羊业生产成本和生产效率,具有重大的经济意义。蒙古羊是我国最古老的地方绵羊品种之一,乌珠穆沁系蒙古羊是在当地生态环境条件下,经长期选育形成的一个优良类群,具有许多优良特性,主要以抗病力强、产肉率高和繁殖性能高而闻名。为了揭示蒙古羊高繁殖性能,使蒙古羊这一宝贵资源能得到有效利用,本研究以乌珠穆沁系蒙古羊为实验材料,首先以BMPR-IB和FSHβ基因作为蒙古羊高繁殖力候选基因,对其进行了克隆及序列分析,并采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的相对定量方法对BMPR-IB和FSHβ基因在单羔蒙古羊非发情期、发情期及产双羔蒙古羊怀孕后期的卵巢、子宫、输卵管、下丘脑和垂体组织进行了差异表达研究;其次采用抑制性消减杂交技术(SSH)对经产单、双羔蒙古羊的卵巢组织差异表达基因进行了筛选并采用电子克隆加RT-PCR方法对部分差异表达基因进行了克隆和验证。通过以上研究,为提高我国肉用绵羊繁殖力及加快肉羊新品种选育提供了重要的理论依据,并获得以下主要研究结果:(1)采用RT-PCR方法分别从蒙古羊卵巢组织中扩增出BMPR-IB、FSHβ基因的cDNA序列。蒙古羊BMPR-IB基因全长1567bp,包括完整的1509bp开放读码框(ORF),共编码502个氨基酸。通过对单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因测序结果分析发现,在单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因编码区第746位和第1113位碱基相一致,分别为“A”和“C”,并没有发生同多胎Booroola羊相同的A→G突变和C→A突变。蒙古羊FSHβ基因全长1021bp,包括完整的390bp ORF,共编码129个氨基酸。(2)采用相对定量的双标准曲线法建立了蒙古羊β-Actin、BMPR-IB和FSHβ基因的RQ-PCR反应体系。以非发情期单羔蒙古羊的卵巢组织定量结果为对照,计算得到FSHβ基因在单羔蒙古羊发情期下丘脑组织中表达量最高,在发情期的输卵管组织中表达量最低;BMPR-IB基因在单羔蒙古羊发情期卵巢组织中表达量最高,在发情期的子宫组织中表达量最低。在卵巢组织中,FSHβ基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的1.31倍,双羔羊是单羔羊的0.70倍;BMPR-IB基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的2.65倍,双羔羊是单羔羊的2.16倍。证明BMPR-IB基因是蒙古羊多胎主要候选基因,FSHβ基因虽然在绵羊繁殖过程中具有重要的作用,但并非蒙古羊多胎主效基因,可能与多胎性状的主基因或QTL相连锁。(3)采用SSH技术成功构建了单、双羔蒙古羊卵巢组织的正、反向消减cDNA文库,并从两个消减cDNA质粒文库中筛选得到768个有效阳性克隆,插入片段长度主要分布于150~1000bp之间。结合斑点杂交技术获得到差异克隆373个,通过测序和同源性检索获得已知基因序列185条,10条已知的差异表达EST和4条未知的EST序列。(4)对差异表达基因功能分析表明,本实验所获得的基因主要由以下几大类组成:机体和细胞防御、免疫类14个,代谢类53个,物质运输类20个,核酸修饰类12个,细胞发育类18个,信号传导类12个,细胞结构类9个,未分类47个,其中代谢类基因占据了最大部分占28.65%。将这些差异表达基因和已报道的与繁殖性状相关的基因比较发现,经过初步筛选得到12个差异表达基因与已报道的繁殖性状相关基因相一致,这些基因分别为ITGB1、BMP6、MHC-I、ACVRL1、IGFBP5、SPON1、FABP5、ADAMTS1、FAM46A、THY1、ARP3和Id3基因。(5)分别以SSH获得的差异表达ADAMTS1和Id3基因序列片段为种子序列在绵羊的EST数据库中进行blastn同源性检索,得到相应的UniGene编号分别为Oar.7453和Oar.5068,经过序列拼接分别得到2418bp和1099bp的蒙古羊ADAMTS1、Id3基因电子克隆cDNA序列。采用RT-PCR方法实验克隆得到2420bp的蒙古羊ADAMTS1基因序列和1045bp的蒙古羊Id3基因序列,经同源性比对发现,实验所得序列与电子延伸序列的同源性分别为99.4%和99.3%,并将序列提交至GenBank获得注册号分别为:GU437212和GU437213。
黄萌[6]2008年在《肉牛RXRG和MyoD1基因的克隆、SNPs筛查及其与肉质和双胎性状的关联分析》文中研究表明本研究分别以秦川牛、鲁西牛、西门塔尔牛和安格斯牛4个品种牛的514份血样和西门塔尔牛的组织样为材料,分别提取基因组DNA和RNA。运用生物信息学方法和同源序列克隆技术结合电子PCR (ePCR)、反转录PCR (RT-PCR)和限制性片段长度多态性PCR (PCR-RFLP),对牛的视黄素受体γ(RXRG)基因的cDNA序列和基因组DNA序列进行了克隆、鉴定与序列分析。运用测序和PCR-RFLP结合的方法对视黄素受体γ(RXRG)基因和生肌决定因子1 (MyoD1)基因的部分基因组DNA片段进行了单核苷酸多态检测,运用一般线性模型研究了MyoD1基因与上述6个品种牛部分生长与肉质性状的相关性,运用Logistic概率型非线性回归分析和卡方独立性检验研究了RXRG基因与上述6个品种牛双胎性状的相关性,得到了如下结果:(1)利用RT-PCR技术,对牛RXRG基因进行克隆,将得到的片段重组到PMD19-T载体进行序列测定。获得了一个长为1811 bp的cDNA片断。通过氨基酸序列分析发现,牛RXRG基因的该片段由10个外显子组成,编码463个氨基酸。与其他动物同源性比较表明,该基因与人、猪、猕猴、小鼠、大鼠在氨基酸序列上分别有89.5%、93.4%、87.2%、83.9%、85.2%的同源性。获得了牛RXRG基因的cDNA序列。组织表达谱分析表明,牛RXRG基因在肌肉中高度表达,在其他组织中不表达。(2)运用测序法寻找牛RXRG基因SNPs,筛查到一个新的多态位点A1941G,该位点位于3′非编码区。运用PCR-RFLP法验证并分析该位点在鲁西牛双胎群体和单胎群体及西门塔尔牛、安格斯牛和西蒙杂交牛单胎群体间的多态性,结果表明,在鲁西牛双胎和单胎群体中分布A、B两个等位基因,处于中度多态。经卡方适合性检验,鲁西双胎牛群体在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。将鲁西牛群体的A1941G位点的基因型效应与双胎性状进行关联分析,卡方独立性检测结果显示,基因型分布在鲁西单、双胎牛群体上差异达到极显著水平(P<0.01)。(3)运用测序法寻找牛MyoD1基因SNPs,筛查到一个新的多态位点C1867T,该位点C-T突变引起甘氨酸/丝氨酸的转变。运用PCR-RFLP法验证并分析该位点在不同群体间的多态性,并与相应牛群体的胴体性状进行关联分析。结果显示,西门塔尔牛、鲁西牛群体的C1867T位点的突变达到了Hardy-Weinberg平衡状态,而秦川牛未达到平衡状态。不同基因型对肉牛的背膘厚影响差异极显著(P<0.01),对大腿肉厚的影响显著(P<0.05),对日增重、屠宰率、肌间脂肪、大理石花纹、嫩度的影响差异不显著。
阳奇[7]2015年在《一个遗传性牙本质发育不良Ⅰ型家系的致病基因研究》文中研究指明背景与目的遗传性牙本质疾病(Hereditary Dentin Defects)是一种常见的人类牙本质遗传性疾病,主要局限于牙乳头跟牙齿中胚层发育异常的一类疾病,其发病率为1/10000-1/6000。早在1973年,Shields将牙本质发育不全分为两大类：遗传性牙本质发育不良(Dentin Dysplasia, DD)与牙本质发育不全(Dentinogenesis Imperfect, DGI);5小类(2类牙本质发育不良与3类牙本质发育不全)。本实验主要研究牙本质发育不良Ⅰ型(DD-Ⅰ)。DD-I (OMIM:125400)是一种罕见的染色体显性遗传疾病,外显率不足100%,发病率为1/100000[2]。临床检查显示为牙冠形态、色泽表现正常,牙本质形成缺陷和髓腔闭塞,经常伴有根尖X线透射。Ballschmiede在1920年对这种疾病进行了相应的描述,他将来自于同一个家庭的7个小孩牙齿牙根短钝、牙齿自然脱落现象称之为条件性“无牙根性牙齿”[3]。斑马鱼的牙齿和人类以及其它哺乳动物在结构上类似,拥有牙髓腔、牙本质和类牙釉质。在牙齿附着期间存在釉器,发育期和人类牙齿发育期相似,有蕾状期、帽状期、钟状期,但斑马鱼牙齿发育周期短、过程简单。在基因调控方面,斑马鱼中调控牙齿发育的基因大部分在人类中都有相应的同源基因,如BMPs、FGF, Alk8、Pitx2a、Dlx, Pax9等多个基因。另,能谱分析、扫描电镜比较成年斑马鱼牙齿与人类16周龄胎儿牙胚的矿化程度和Ca、P比例,发现两者相似度极高。在组织和超微结构上,斑马鱼的牙齿也和人类牙齿相似性很高。因此,选择斑马鱼作为牙齿发育研究的模式生物。目前对于DD-Ⅰ型的相关致病基因的研究仍然是个迷,为解决这一难题,本课题组对一个河南郑州的中国人家系进行了相关基础研究。利用连锁分析、全基因组测序和sanger测序等方法证实VPS4B基因突变导致DD-Ⅰ型疾病,为DD-Ⅰ型疾病诊断提供分子学依据。通过对VPS4B基因的分析,阐述了VPS4B基因突变的致病机理。在细胞水平,利用VPS4B过表达与si-RAN敲降实验对牙齿发育相关经典通路-WNT5A经典通路中的相关基因的调控作用进行分析,为以后阐明牙齿发育机理提供重要的信息。利用斑马鱼这一模式生物,以斑马鱼的牙齿发育系统作为模型,采用“敲低表达”和“过量表达”的方法结合"rescue"实验,初步研究了vps4b基因在斑马鱼牙齿发育过程中的功能作用。材料与方法：1.对一个中国河南郑州的中国人DD-Ⅰ家系采用连锁分析,全基因组外显子测序、sanger测序以及限制性内切酶酶切验证等技术方法,确定致病基因与突变位点。家系样本DNA采用酚／氯仿方法提取,RNA使用TRIZOL与试剂盒提取(RNeasy Mini Kit. Qiagen),然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA。2.使用高分辨率熔炼曲线(High Resolution Melting, HRM)技术筛查当地人群300份随机样本,确定VPS4B基因IVS7+46C>G的突变频率。3.VPS4B基因的时空表达谱：利用RT-PCR确定VPS4B基因在人不同组织、细胞系以及不同时期的小鼠脑组织表达谱。组织与细胞系总RNA使用TRIZOL提取,然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA。扩增产物直接测序确定。4.剪切突变验证：设计特异的转录本扩增引物,利用家系病人与正常人逆转录好的cDNA,使用RT-PCR胶图结合Sanger测序确定剪切突变。5.利用Olig7设计相应的特异性引物,采用荧光定量PCR技术,检测家系中正常人与病人牙龈组织细胞中VPS4B基因总转录水平的差异以及病人外牙龈组织细胞中发生剪切突变后形成的异常转录本与正常转录本转录水平的差异。6.蛋白空间结构预测,用Swiss-Model.软件对野生型与突变型的VPS4B蛋白的三维空间结构进行预测,SOPMA对野生型与突变型的VPS4B蛋白的二级结构进行预测。7.将人类VPS4B基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pcDNA3.1+-FLAG上,然后利用lipo2000转染试剂按说明转染到已培养好的HEK-293T细胞中,转染后24小时收集细胞,提取总蛋白,利用WestemBlot技术检测野生型蛋白与突变型蛋白之间以及共转后蛋白表达之间的差异。8.亚细胞定位：将人类VPS4B基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pEGFP-C1上利用lipo2000转染试剂按说明转染到已培养好的COS7细胞中,转染后24小时用DAPI染核技术染核,于荧光显微镜下观察拍照,比较野生型蛋白与突变型蛋白在细胞中表达部位的差异。9.将人类VPS4B基因正常转录本的cDNA克隆到载体pcDNA3.1+上,委托广州锐博生物科技有限公司ribobio合成siRNA-VPS4B序列,分别利用lipo2000转染试剂按说明转染到培养好的Human Gingival fibroblasts(HGF)细胞中,使其过表达或表达降低,转染后24小时使用TRIZOL提取RNA,然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA,过表达试验中pcDNA3.1+空载转染作实验对照,敲降试验中使用广州锐博生物科技有限公司提供的VPS4B-Control转染作实验对照。采用荧光定量PCR技术检测VPS4B过表达与低表达对牙齿发育相关基因WNT5A、WNT5A受体CHMP4B与WNT5A经典信号通路中β-catenin的转录水平的影响。10.使用茜素红染色观察斑马鱼牙齿的发育,用于实验研究。11.利用NCBI的BLAST在线比对软件,搜寻人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因vps4b,并对它们的相似性进行比较分析。12.使用RT-PCR确定斑马鱼中vps4b基因的表达,设计并构建合成斑马鱼vps4b基因反义RNA探针,使用整体原位杂交技术分析vps4b基因的时空表达谱。13.委托美国GeneTools公司设计并合成两段针对该斑马鱼基因的morpholino oligonucleotides;其中MO-1的作用在于抑制基因的表达、翻译,MO-2则能够干扰转录本的正常剪切并可能最终得到长度异常的靶基因转录本,指导翻译出长度及序列异常的蛋白质分子。14.将人类VPS4B基因克隆到载体pCS2上,然后用SP6体外转录试剂盒合成该基因的mRNA。15.通过显微注射将morpholino和人VPS4B的mRNA分别单独以及共同导入斑马鱼的受精卵；通过RT-PCR检测人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因在morpholino作用下其mRNA水平的改变。16.显微注射后观察鱼卵的生长发育情况,并计数其中牙齿产生缺陷的胚胎以及正常的胚胎,并计算缺陷率和牙齿正常的率。17.设计并构建合成斑马鱼早期牙齿发育相关基因反义RNA探针,使用整体原位杂交技术分析斑马鱼vps4b基因敲降后对斑马鱼早期发育相关基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a、pitx2表达的影响。结果：确定突变位点：通过对DD-Ⅰ家系遗传图谱分析,该家系DD-Ⅰ遗传方式为显性遗传,进一步对家系成员连锁分析、全基因组外显子测序、直接DNA序列测定和限制性内切酶酶切验证确定,结果显示：位于病人的Chr18q21.2-Chr18q21.33区域VPS4B基因第7号内含子区的第46位发生C>G的杂合突变即ⅣS7+46C>G, flag:CACT C TGTCG→CACT G TGTCG。突变频率筛查,选取当地人群300份随机外周血样本,DNA提取后采用HRM技术与测序分析,结果显示：该人群中未发现该位点突变。VPS4B时空表达谱：提取人不同组织以及细胞系的总RNA,小鼠E7、E11、E15、E17、P1、P3、P7、P10、P15、P16、Adult脑组织不同时期的总RNA, RT-PCR,结果显示：VPS4B基因在人不同组织中以及细胞系中都有表达,小鼠脑组织的不同时期均表达。致病机理与蛋白功能分析：提取家系正常人与病人牙龈组织细胞总RNA,设计特异的转录本引物,RT-PCR后胶图结合sanger测序确定,结果显示：突变后在VPS4B基因IVS7+46位置形成一个新的剪切位点,从而形成一个新的转录本(VPS4B-MUT)。在VPS4B基因转录形成的两个转录本的公共区域设计荧光定量PCR (RTFQ-PCR)引物,取正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8,病人Ⅱ-2、Ⅳ-6 cDNA,采用RTFQ-PCR,结果显示：正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8比病人Ⅱ-2、Ⅳ-6牙龈组织细胞中总转录本转录水平高(p<0.001)。设计两对特异的RTFQ-PCR引物,使其只能单一扩增出正常转录本(VPS4B-WT)或异常转录本(VPS4B-MUT),选取病人Ⅱ-2、Ⅳ-4、Ⅲ-7、Ⅳ-5 cDNA,采用RTFQ-PCR,结果显示：病人牙龈组织细胞中正常转录本的转录水平比异常转录本高(p<0.001),异常转录本的转录水平随年龄呈增多趋势。Wiss-PdbViewer 4.1.0软件对野生型与突变型VPS4B蛋白的三维空间结构预测结果显示：突变型与野生型相比较,突变型VPS4B蛋白在无规转角区域插入15aa(264-278位),第132-134位由无规转角转变成β折叠,237-239位无规转角转变成α螺旋。SOPMA对野生型与突变型的VPS4B蛋白的二级结构预测结果显示：两者除了在氨基酸序列长度上改变,还使250AA之后的二级结构发生了改变；突变型与野生型相比,二级结构中α螺旋和β折叠区域均比例降低了,无规卷曲区域则增加了约3%。构建好的pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-WT与pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-MUT表达载体分别转染,以及共转染HEK-293T细胞后,WesternBlot结果显示：VPS4B野生型蛋白表达水平比突变型蛋白水平高,共转的两种蛋白总表达水平比突变型蛋白高。构建好的pEGFP-C1-VPS4B-WT载体与pEGFP-C1-VPS4B-MUT载体分别转染COS7细胞,转染后24小时DAPI染色,结果显示：VPS4B-WT蛋白在细胞质与细胞核均有表达,VPS4B-MUT细胞核内不表达,只在细胞质中表达。pcDNA3.1+-VPS4B-WT表达载体转染HGF细胞过表达与siRNA-VPS4B转染HGF细胞敲降实验,结果显示：VPS4B过表达使CHMP4B、WNT5A与B-catenin表达量升高,VPS4B敲降后使CHMP4B、WNT5A与β-catenin表达量降低。人类vps4b基因与斑马鱼中vps4b基因蛋白具有88%同源性,cDNA序列75%同源。提取斑马鱼1-5dpf的总RNA, RT-PCR,结果显示：vps4b在斑马鱼胚胎发育早期有表达,进一步确定它们在胚胎中的表达部位,不同发育时期的胚胎整体原位杂交实验,结果显示：vps4b在斑马鱼腮弓处表达。设计并合成vps4b morpholino,显微注射后结果显示：注射vps4b的morpholino后可引起斑马鱼牙齿发育异常vps4b-MO与人VPS4B mRNA共注射结果显示异常可被人野生型的vps4b mRNA显微注射挽救。单独注射vps4b mRNA后斑马鱼牙齿的发育没有明显影响。注射vps4b的morpholino后,结果显示：斑马鱼早期牙齿发育相关基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a表达降低,pitx2表达部位发生改变,由两侧向中间聚集。结论：通过对DD-Ⅰ家系人员基因组的外显子测序、STR连锁分析等几种不同方法分析,发现一种世界首报的VPS4B突变IVS7+46C>G,成功阐明该突变为一种深度内含子区的剪切突变。利用RT-PCR展现了VPS4B在人的不同组织细胞系以及老鼠不同时期的脑组织的稳定表达,确定了VPS4B的时空表达谱—广泛表达；在牙龈与下颌组织中的表达,表明VPS4B基因与人的牙齿发育密切相关。在DD-Ⅰ家系中,RTFQ-PCR检测,正常人牙龈组织中VPS4B总转录水平较病人高,病人牙龈组织细胞中VPS4B正常转录本转录水平较异常转录本高,且随年龄的增长呈增多的趋势,该病病情可能与年龄存在一定关系。通过软件对野生型蛋白与突变型蛋白三维空间结构与二级结构进行预测,发现突变型蛋白三维空间结构与二级结构较野生型蛋白发生较大的改变。通过亚细胞定位技术,确定野生型蛋白在细胞胞质、胞核都表达,突变型蛋白只在细胞质内表达。另外突变型蛋白在体外细胞中表达水平较野生型蛋白、共转蛋白低,分子量比野生型蛋白大1.7KDa,说明该蛋白在患者体内能稳定存在。整个转录、表达水平的变化提示导致牙齿缺陷的机制可能为单倍型剂量不足。通过在Human Gingival fibroblasts(HGF)细胞中的过表达与敲降实验,VPS4B基因与CHMP4B结合,促进WNT5A表达,抑制GSK3β促进β-catenin磷酸化,进而通过β-catenin调节牙齿相关基因的表达,调节牙齿的发育。提示VPS4B基因通过牙齿发育相关通路WNT5A经典信号通路影响牙齿发育。利用RT-PCR证实人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因vps4b在斑马鱼胚胎发育早期即有表达；通过原位杂交确定了vps4b在斑马鱼的鳃弓处有表达,而斑马鱼作为硬骨鱼的一种,口腔中没有牙齿,而是在第5鳃弓上长有咽齿。原位杂交的结果表明vps4b可能在斑马鱼的牙齿发育过程中发挥一定的作用。vps4b的反义morpholino寡聚核苷酸注射后引起斑马鱼牙齿发育缺陷,其中vps4b-MO2在斑马鱼胚胎中可降低与人类vps4b同源的基因Vps4b的正常mRNA水平,产生了部分大小异常的mRNA。Rescue实验结果显示：人类野生VPS4B mRNA可达到拯救vps4b-MO1和vps4b-MO2导致的牙齿缺陷的效果。这进一步证明了,人类VPS4B基因在斑马鱼中的同源基因vps4b在斑马鱼的牙齿发育过程中可能起到关键作用。进一步实验发现：vps4b的反义morpholino寡聚核苷酸注射后使斑马鱼牙齿早期发育相关基因dlx2b、bmp2a、wnt5a、hoxb5a表达降低,pitx2表达部位发生改变,提示vps4b基因参与牙齿发育调控途径。过量表达人野生VPS4B mRNA和突变VPS4B mRNA对斑马鱼牙齿的发育没有明显影响,表明,该基因导致牙齿缺陷的机制可能为单倍型剂量不足。
成璐[8]2006年在《斑马鱼心脏发育相关基因δ-SG和Foxp1的克隆、表达和功能研究》文中研究说明(一)δ-SG是肌聚糖复合物的成员,它在各种脊椎动物的骨骼肌和心肌中特异表达。肌聚糖复合物基因的突变在人类中与肢带型肌营养不良症(LGMD)和扩张型心肌病(DCM)相关。在本文中,我们克隆了斑马鱼δ-SG基因,并研究了其在胚胎发育时期的表达谱,并通过吗啉修饰的反义寡核苷酸介导的基因抑制深入研究了该基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能。斑马鱼δ-SG基因全长cDNA的长度为1938bp,其中的开放阅读框编码了一条含有290个氨基酸残基的多肽。该基因表达产物在氨基酸水平上与人、小鼠、仓鼠、鸡的δ-SG基因产物分别有72%、73%、73%和69%的相似性。δ-SG的基因组序列分析显示该基因由8个外显子和7个内含子组成,覆盖了长将近200kb的基因组区域。原位杂交结果显示δ-SG的表达最初开始于分节期早期。高水平的δ-SG表达出现在骨骼肌和心肌。其它如眼部和下颚肌肉、胸鳍、鳃弓、和鳔也有显著的表达。此外受精三天后,在中脑和视网膜也能观测到δ-SG表达。我们采用吗啉修饰的反义RNA进行基因抑制,结果显示绝大多数注射δ-SG-MO的斑马鱼胚胎都显示出严重的异常表型;发育不全的头部,线性心脏,微弱的心跳和短小的躯干,并且大多在5天内死亡。而注射同样剂量的对照MO的胚胎发育与正常胚胎没有明显区别。MO-GFP和拯救实验证据也有效的证实使用的MO能抑制内源δ-SG蛋白的翻译。原位杂交分析显示在受累胚胎中,近轴细胞和肌肉前体细胞减少。δ-SG基因表达的缺失严重阻碍了心脏早期发育过程,并影响了心肌细胞的分化。更有趣的是心脏的左右非对称模式发生了改变。同时免疫印记分析显示SG复合物相关蛋白的表达量在MO注射胚胎中明显下调,甚至基本消失。这些结果显示δ-SG在早期心脏和肌肉的发育中具有很重要的作用,我们推测SG复合物可能作为膜受体参与早期发育的信号传递。(二)Forkhead转录因子家族一类由许多调控分子组成的大家族,它们共同拥有一个保守的110个氨基酸残基的DNA结合域——forkhead结构域。该家族在包括脑、心血管系统、肺、肠和肾等组织的发育过程中都发挥重要作用。其功能包括参与细胞增殖,分化,染色体重塑,有丝分裂过程和转化过程等。本文中我们克隆了斑马鱼Foxp1基因(Genebank序列号为DQ333303),进行了生物信息学分析,并研究了其表达谱。斑马鱼Foxp1全长cDNA的长度为2440bp,其中的开放阅读框编码了一条含有659个氨基酸残基的多肽。该基因表达产物在氨基酸水平上与人、小鼠、仓鼠、鸡、云雀和爪蟾的Foxp1基因产物分别有72%、68%、68%、70%、65%和62%的相似性。其中包含一个锌指结构域,一个亮氨酸拉链和一个Forkhead DNA结合域。通过5'RACE和RT-PCR分析发现了4个Foxp1可变剪接体A型—D型。整胚原位杂交和RT—PCR结果显示在胚胎发育阶段Foxp1的时空表达谱是非常复杂而动态的,尤其是在神经系统的发育过程中。各可变剪接体的时空表达谱有很大区别,其中高量的母源表达主要为D型,B型也主要在胚胎发育中期表达,A型和C型可能为幼鱼及成体后的主要表达类型。该基因在中枢神经系统的许多区域都有表达,特别是中后脑分界线,后脑和脊索。同时Foxp1在视网膜、耳、鳃弓、孵化腺、心脏、原肾管、肠道、原肛、胸鳍和鳔等部位都有广泛的高表达。通过对斑马鱼基因功能的研究可以揭示其在斑马鱼发育过程中所起的作用。在本文中我们采用morpholino进行Foxp1基因抑制,结果显示大多数注射Foxp1-MO的斑马鱼胚胎出现一致的表型,主要集中在脑部发育和心脏发育障碍,此外还有躯干弯曲,孵化腺细胞异常等。而注射同样剂量的对照MO的胚胎发育与正常胚胎没有明显区别。这些结果表明斑马鱼Foxp1基因在启动胚胎发育和其后的组织器官发生如神经系统、心脏和其它多个组织中都有重要的作用。
华松[9]2004年在《山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养》文中认为骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell ,BMSC）是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有多向分化潜能的干细胞。具有贴壁生长的特性，在体外易分离和扩增，在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为多种造血以外组织,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，还易于外源基因的转入和表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。人骨形成蛋白2（ human bone morphogenetic protein 2，hBMP-2 ）属于转化生长因子β超家族中的一员，是最理想的诱骨因子，可以诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞,进而形成新骨的能力，当植入非骨组织时，能异位诱导成骨，在骨折和骨损伤修复过程中发挥着重要作用。BMP基因在生物进化过程中高度保守，种属间差异小，不同脊椎动物的BMP具有高度的同源性。 本研究基于细胞工程与转基因技术相结合，把诱骨因子hBMP-2基因整合到靶细胞BMSC中，再将BMSC植入骨损伤处，让hBMP-2基因在体内稳定地表达，从而达到hBMP-2基因基因治疗的目。所作的工作如下：1．采用密度梯度离心（Percoll分离液）法将BMSC从山羊骨髓血液中分离出来，置于低糖DMEM中进行传代培养。利用换液的方法对其纯化，接种两小时后开始贴壁，贴壁生长的细胞呈典型的成纤维细胞样外观。原代与传代培养细胞的生长曲线都为S型，但是传代培养的细胞生长速度比原代快。传代培养的结果显示，在经历了9代培养以后，山羊BMSC才出现衰老征象。与原代培养细胞的生长曲线相比，传代培养的细胞生长潜伏期短，每代只要9天就可铺满培养皿底壁。2．参考上皮细胞的冷冻方法，用含不同浓度的血清和DMSO的冷冻液进行冷冻，以解冻后的细胞贴壁率为标准，筛选理想的冷冻液。发现冻存液DMEM＋10％FBS+10%DMSO与DMEM+15%FBS+10%DMSO对山羊BMSC的冷冻有着相同的效果，因此选择DMEM+10%FBS+10%DMSO为山羊BMSC的冷冻液。3．取P1、P5和P9代细胞制备细胞爬片，用β-巯基乙醇/当归注射液分别对其进行定向诱导，每隔30min在光学显微镜下观察细胞形态变化，用免疫组织化学鉴定。结果表明β-巯基乙醇和当归注射液对山羊BMSC有同样的诱导效果，两种方法诱导后的细胞70%以上表达神经丝蛋白（NF）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）。说明山羊BMSC同样可以被诱导成为神经样细胞，同时也说明了采用Percoll分离液进行梯度密度离心后分离的细胞为BMSC。4．采用TRIZOL法从人胎盘组织中提取总RNA，通过RT-PCR方法获得编码hBMP-2的基因，重组到pMD-18T载体上后在大肠杆菌中克隆，经检测，所获得的基因序列与基因文库中hBMP-2基因同源性为99.9%，即成功的克隆出了hBMP-2基因，为进一步研究hBMP-2基因在BMSC中的高效表达奠定了基础。<WP=7>5．把目的基因从重组质粒上切下来，插入到荧光表达载体（pEGFP-C1）的多克隆位点，构建了hBMP-2基因融合GFP真核表达载体，并探讨了用脂质体转染的方法。为hBMP-2在BMSC内直接诱导作了准备，同时也为人类治疗许多骨科疾病提供了理想的动物模型。
沈以红[10]2003年在《家蚕几种组织的EST及基因表达特征分析》文中研究表明本实验室选择家蚕12种不同组织器官和细胞，构建5′端非偏性cDNA文库，对每个文库大规模EST测序。本文在获得的大规模EST数据基础上进行数据分析、挖掘，以期发现家蚕的重要功能相关基因，并获取基因表达的组织差异和特异信息。这些基因的功能和表达信息获得，对家蚕有用基因资源的深度开发及鳞翅目害虫的有效控制有重要价值。 1 基于EST数据的基因表达谱聚类方法 本文采用基于大规模EST数据的基因表达谱聚类法，探讨在测序数据大量获得时从中提取有价值信息的数据分析方法。利用两两基因(contig)或样本(文库)的相关系数定义基因或样本间的距离，构建中高丰度表达基因和所有测序文库的进化树。从contig的进化树中获得具有一致表达特征的成组基因。文库进化树反映了构建文库的组织间的亲疏关系。 利用Audic和Cleaverie取得的一个新的适用于分析标签抽样数据显著性检验的成对状况比较法分析组织间差异表达基因，获得在两种组织间和同一组织不同时期基因表达显著不同的基因。 2 大规模EST特征 2．1 文库构建及初步分析 本实验室以家蚕品种“大造”为材料，选取五龄幼虫重要组织丝腺、中肠、脂肪体、体液、生殖腺和发育期胚胎共构建12个非偏性cDNA文库，5′端方向大规模测序，获得81625个合格的EST序列，Phrap软件拼接获得24678个非冗余序列(UniGene)，其中包括11627个重叠群(contig)，13051个独立EST(Singleton)。 同源分析共检索到7944个UniGene与GeneBank等数据库的数据同源，同源且有功能注释的已知基因有3899个UniGene(32605个EST)；同源但没有功能注释的已知序列有4045个UniGene(16087个EST)；新序列有16734个UniGene，(32933个EST)。本次测序共有60％的EST为未知功能序列。 2．2 基因表达谱聚类 对3064个contig(EST≥5)和12个文库分别聚类，构建树形图。Contig聚类结果，各文库中表达趋势一致的contig在树形图中构成相邻的一群，从中获取在本测序范围内文库(或组织)特异表达的contig以及组织间协同表达的contig，并作进一步研究。文库聚类结果，培养细胞、中肠和非受精卵与其它组织基因表达谱差异很大。脂肪体雌与雄、血液雌与雄、丝腺与卵巢表达谱很相似。丝腺与卵巢表达谱相似是一个有趣又值得探讨的现象。 2．3 所有文库中普遍表达基因分析 对所有测序组织中都有表达的UniGene分析，这部分有12个已知基因和7个已知序列。已知基因包括膜蛋白tetraspanin D107、翻译调控肿瘤蛋白同源物(TCTP)、热激相关蛋白、泛素融合蛋 西南农业大学博士学位论文生.目里典.里奥.月.目里巨口口目目典目目里县口白、鸟氨酸脱梭酶抗酶;、Y盒蛋白c卜妙。、核糖体蛋白、蛋白合成起始因子和翻译延长因子、丝素轻链、丝·J·蛋白P25和30kD蛋白等蛋白基因，在维持家蚕正常生命活动中它们有重要作用。特别是丝素轻链、丝…蛋白P25和30kD蛋白，该结果表明它们参与了家蚕重要的基础代谢过程。2.4所有文库中极高表达基因分析 对所有侧序组织中极高表达基因分析，有64个UniGene(EST)100)，代表巧个已知基因和7个已知序列。已知基因按表达量高到低依次是贮藏蛋白30kD，核糖体蛋白，丝心蛋白丝素轻链前体，丝氨酸蛋白酶，翻译控制肿瘤蛋白同源物(T叮P)，跨膜蛋白(tetrasP8nin D107)、P25、贮藏蛋白SPZ和SPI、热激蛋白、溶菌酶、成虫翅盘生长因子、泛素等基因。除丝氨酸蛋白酶基因是中肠特异表达，贮藏蛋白和成虫翅盘生长因子基因主要在脂肪体表达外，其余基因在各个组织中均表达。这些家蚕生理功能重要蛋白基因的高表达，显示五龄盛时期蛋白质旺盛合成的生产特性和为发育变态作物质准备这一生理特点3.家蚕脂肪体组织基因表达谱3.1脂肪体特异表达基因 幼虫脂肪体特异表达基因包括已知基因23个，未知功能序列52个。其中贮藏蛋白、抗菌蛋白和类IDGF基因居表达量前三位，显示脂肪体合成贮藏蛋白、抗菌蛋白及参与发育的盆要生理功能。此外，保幼激素结合蛋白基因少量表达。检索silkBase数据库进一步确定其中三个未知功能序列coatig是脂肪体特异表达. 蛹脂肪体特异表达基因包括7个己知基因(共5.52%)，未知功能序列108个(94.5%).已知基因有抗菌物hemofin、微管蛋白、表皮蛋白、转座酶、载脂蛋白基因低表达量表达。此外，特异表达的未知功能序列有早期卵壳基因的非编码区及相关的重复序列以较高水平表达。3.2雌雄差异表达基因 贮藏蛋白SPI和SPZ基因、与发育调控有关的蛋白基因、与能量代谢和卵形成有关的磷酸甘油酸脱氢酶基因在雌表达均比雄高;而贮藏蛋白3OkD蛋白、蛋白代谢有关的酶基因和胰蛋白酶抑制剂基因在雄表达高于雌，显示在mRNA合成阶段，就决定了性差别的特性，家蚕利用蛋白质方面雌雄可能有差别。3.3幼虫蛹差异表达基因 幼虫脂肪体内活跃进行多种物质代谢相关蛋白基因的表达，特别是贮藏蛋白和组织发育有关的调控蛋白、蛋白酶抑制剂和抗菌肤等基因;蛹脂肪体主要表达热激蛋白、表皮蛋白、微管和微
参考文献：
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[7]. 一个遗传性牙本质发育不良Ⅰ型家系的致病基因研究[D]. 阳奇. 南方医科大学. 2015
[8]. 斑马鱼心脏发育相关基因δ-SG和Foxp1的克隆、表达和功能研究[D]. 成璐. 复旦大学. 2006
[9]. 山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养[D]. 华松. 西北农林科技大学. 2004
[10]. 家蚕几种组织的EST及基因表达特征分析[D]. 沈以红. 西南农业大学. 2003
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