宜兴市人民医院 214200
【摘 要】目的：探讨高危型HPV16-E6基因对P53基因甲基化状态及表达情况的分析，了解HPV16-E6基因在宫颈癌发生机制中的作用。方法：通过甲基化特异性PCR（MSP）方法检测P53基因甲基化的状态；通过RT-PCR和Western Blot检测P53基因和DNA 甲基转移酶1（DNMT1）在mRNA和蛋白水平的表达情况分析。结果：HPV16-E6感染组P53基因呈高度甲基化状态，且P53基因和DNMT1在mRNA和蛋白水平均表达下调或缺失，与对照组比较差异显著（P<0.01）。结论：HPV16-E6基因感染可致P53基因甲基化增高，抑制抑癌基因P53在转录水平和蛋白水平的表达。提示HPV16-E6可能通过影响DNMT1的表达参与调控P53基因甲基化状态。
【关键词】HPV16-E6，P53，甲基化，宫颈癌
女性妇科肿瘤中，宫颈癌占有相当重要的比例，特别是发展中国家，是女性高死亡率的主要因素之一。已有资料明确，宫颈癌的发生、发展与HPV的持续感染密切相关[1]。由于对组织的亲和力和致病力不同，人们已发现HPV基因型有上百种之多，其中HPV16基因型在宫颈癌的发生机制中发挥重要的作用，属于高危型HPV。肿瘤的发生发展是多因素综合作用的结果，研究证实，病毒的持续感染与某些抑癌基因启动子区域高度甲基化密切相关，协同作用导致肿瘤的发生。因此，本研究拟通过MSP对P53基因启动子区域甲基化的状态，同时应用RT-PCR和Western Blot检测P53基因和DNMT1在宫颈癌组织中的表达情况进行分析，明确HPV16-E6基因是否参与了P53基因甲基化的调控，为HPV16-E6在宫颈癌的发生机制中的研究提供了依据。
1 材料和方法
1.1 选取50例HPV16-E6阳性宫颈癌组织标本，50例无HPV感染的宫颈癌组织标本作为实验对照，平均年龄48岁。
1.2 MSP检测
相关序列及条件见表1，PCR检测结果通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证。
1.3 RT-PCR检测
Trizol法提取组织RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参，检测P53和DNMT1 mRNA表达水平，，25ul反应体系：预混液10ul，引物2ul，水9ul，Cdna2ul，反应条件：95℃7分钟，95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟，40个循环。
1.4 Wester Blot 检测
提取总蛋白后行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭处理，一抗（1：1000），二抗羊抗兔（1：5000），加DAB显色分析。所有抗体均购自上海生工。
1.5 统计分析
采用SPSS17.0软件分析，采用X2检验，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 通过MSP测定50例HPV16-E6阳性宫颈癌组织及对照标本P53基因甲基化状态，结果见表2。结果显示，HPV16-E6阳性宫颈癌实验组甲基化率（42/50）明显高于HPV阴性对照组（6/50），差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 HPV16-E6基因通过调节P53基因启动子甲基化状态，影响其转录和蛋白水平的表达。
HPV16-E6阳性宫颈癌组织中可检测到P53基因的表达缺失，与对照组比较差异显著。RT-PCR和Wester Blot结果分别见图1和图2。
2.3 DNMT1转录和蛋白水平表达情况，结果见图1和图2，在HPV16-E6阳性组，DNMT1表达下降的情况下，P53基因仍存在高度甲基化，提示HPV16-E6基因参与了对P53基因甲基化状态的调控。
3 讨论
众所周知，高危型HPV持续感染，在宫颈癌的发生机制中发挥重要的作用，研究资料显示，高危型HPV16-E6基因可通过多种方式参与宫颈癌的发生发展[2]，本课题组已研制出HPV16-E6阳性转基因小鼠，这对以后探讨HPV16-E6基因致癌机制的成因提供了重要的实验途径和依据。持续的病毒感染与某些抑癌基因或癌基因的甲基化密切相关[3]，为此，本实验室为探讨HPV16-E6基因在宫颈癌组织中是否参与了抑癌基因P53甲基化的调控，做了进一步的分析和研究。
本研究结果显示HPV16-E6基因阳性宫颈癌组织中，P53基因甲基化水平明显高于对照组，高甲基化水平会抑制该基因的转录表达，我们也通过RT-PCR和Wester Blot实验证实了这一点，表明高危型HPV16-E6持续感染会影响P53基因启动子的甲基化状态。
DNA甲基化在科研领域日益受到人们的关注，催化DNA甲基化过程包括三种甲基转移酶（DNMT1，DNMT2，DNMT3），其中DNMT1与某些抑癌基因甲基化的发生和维持密切相关。本研究数据显示，DNMT1在HPV16-E6基因阳性组，其mRNA和蛋白水平均低于对照组，由此进一步证实HPV16-E6基因对P53基因的甲基化及表达具有一定的调控作用。
研究证实，P53基因是一种抑癌基因，可通过加速细胞周期活动，促进细胞分化等机制在肿瘤发生中发挥作用[4]，我们通过实验初步证实HPV16-E6可通过调控抑癌基因甲基化来影响宫颈癌组织中P53基因的表达。也有人认为HPV16-E6基因是通过某些信号转导机制参与肿瘤的发生发展，因此，HPV16-E6基因是否还存在其他途径导致宫颈癌的发生，还需进一步的研究和探讨，为宫颈癌发生机制的研究提供更多的参考和依据。
参考文献：
[1] 卞继峰，于修平。人乳头状病毒致癌机制的研究进展。[J] 中国病毒学，2014，19（5）：531-534。
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[4] Gheit T，Cornet I，Clifford GM，et al． Ｒisks for persistence and progression by human papillomavirus type 16 variant lineages among a populationbased sample of Danish women［J］． Cancer Epidemiol Biomarkers Prve，2011，20（7）：1315 － 1321．
论文作者:汤俊明,王学才
论文发表刊物:《航空军医》2016年第20期
论文发表时间:2016/11/15
标签：基因论文; 宫颈癌论文; 甲基化论文; 发生论文; 阳性论文; 组织论文; 机制论文; 《航空军医》2016年第20期论文;