焦传珍[1]2003年在《编码中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）和凡钠对虾（Litopenaeus vannamei）一种HSP70的cDNA研究》文中研究说明本文根据中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)EST序列信息设计引物，用RT-PCR方法，从经热休克处理的中国对虾的肝胰腺RNA中克隆到长2090bp的hsp70 cDNA序列，包括长1956bp的完整的编码序列(complete CDS)及部分5’端和3’端非翻译区(5’UTR和3’UTR)。PCR及测序结果分析显示hsp70 cDNA的1～547bp碱基所对应的基因组序列可能含有内含子，548～2090bp碱基所对应的基因组序列不含内含子。根据编码序列推导出相应的652个氨基酸，与其他真核生物HSP70家族成员进行同源性比较，发现中国对虾HSP70与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)HSC71、人(Homo sapiens)HSC70、家鼠(Mus musculus)HSP70、烟草天蛾(Manduca Sexta)HSC70的同源性分别是85.9％、85.9％、85.8％、85.4％，表现出较高的保守性。 同时确定了编码凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)hsp70的cDNA序列，对凡纳对虾、中国对虾hsp70进行了比较，两种对虾HSP70碱基序列相似性为97％，共有60个碱基的差别，编码区内的碱基差异大部分简并密码子内部差异，即不改变所编码氨基酸种类；氨基酸同源性为99.8％，只有一个氨基酸的差别，即第483位氨基酸中国对虾为丝氨酸，而凡纳对虾为天冬酰氨，这个氨基酸差异位于HSP70的底物肽结合结构域。上述结果表明hsp70在对虾种间具有很强的保守性。 为了研究中国对虾hsp70的转录表达，发展了半定量RT-PCR方法，对hsp70转录表达分析显示，hsp70 mRNA在中国对虾正常肝胰腺、肌肉、眼柄组织存在组成性表达；在受到整体热休克后的对虾肌肉、肝胰腺、眼柄组织hsp70转录水平增加。处于热休克温度下168小时(7天)的中国对虾，其肌肉组织hsp70 mRNA依然高于正常对照水平。因此本文所克隆的中国对虾hsp70是一种无明显组织特异性的组成性表达的基因，其转录表达能被某些应激(如热休克)进一步诱导，使转录水平在本底基础上提高。 对主要病原微生物WSSV及鳗弧菌感染下的中国对虾hsp70转录表达进行了研究。投喂感染法使对虾感染WSSV病毒，对虾发病后处于濒死状态时检测其肝胰腺组织hsp70 mRNA水平，发现明显低于正常对照组。但对经注射WSSV病毒及焦传珍编码中国对虾和凡纳对虾一种卜IsP70的cONA研究博士学位论文鳗弧菌后不同时间的对虾肌肉组织进行hsl770 mRNA水平检测，未发现两种病原感染不同时间后hsl刃0表达的明显规律。对不同发育时期的中国对虾全虾h胡70mRNA进行检测，从PH仔虾开始到再生长3个月这段发育时期，结果显示全虾hs价0 mRNA的表达趋于下降。
王芸[2]2011年在《pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究》文中研究指明中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国重要的海水养殖品种,具有适应能力强、生长速度快、耐低温、营养丰富等优点。养殖环境恶化、管理不当等因素引起的环境胁迫所诱导的应激反应,不仅对中国对虾的生理状态及抗病力有显着的影响,甚至严重影响了对虾的养殖成活率。良好的水环境是对虾养殖成败的关键,pH、氨氮是衡量养殖水质质量的重要指标,本文通过研究pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响,揭示了中国对虾应对pH、氨氮胁迫的应激机理,为对虾抗逆选育和健康养殖提供技术支撑。研究内容包括以下四个部分:第一部分,中国对虾细胞凋亡因子Caspase基因cDNA克隆和表达分析。从中国对虾肝胰腺中克隆了Caspase基因,该基因cDNA全长1329b(pGenBank注册号为GU597089),其中开放式阅读框为972bp,包含109bp的5′非编码区(5′-UTR),248bp的3′非编码区(3′-UTR)及一个多腺苷酸信号AATAAA。该基因编码323个氨基酸,预测分子量为36.0kDa,pI为6.27。Caspase编码的氨基酸包含Caspase家族保守的活性位点中心(QACRG五肽)和两个结构域(大亚基p20和小亚基p10),推导的氨基酸不存在信号肽序列。中国对虾Caspase蛋白包含特殊的氨基酸残基His150和Cys198,这两个氨基酸对于催化Caspase酶活性起到至关重要的作用。多序列分析结果表明F. chinensis Caspase与Penaeus monodon Caspase、Fenneropenaeus merguiensis Caspase、Litopenaeus vannamei Caspase-3蛋白质序列同源性分别为83%、82%、76%。应用荧光定量PCR方法分析了中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0水环境中,各组织Caspase基因表达的水平。结果显示:pH7.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平12h显着升高,48h达最低,96h达最高值,148h显着低于对照组(P<0.05);pH9.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平3h显着升高,24h显着低于对照组(P<0.05),120h达最大值并显着高于对照组。pH7.0组中国对虾鳃Caspase基因表达水平在48h和120h低于对照组,其余各时间点表达水平均高于对照组,且在148h达最高值;pH9.0组中国对虾鳃Caspase表达水平3h显着低于对照组(P<0.05),之后逐渐增加,24h达最高值,48h后随着胁迫时间的延长Caspase基因表达水平逐渐降低。pH7.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平均低于对照组,但3h、48h和96h例外;pH9.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平3h显着增加,之后表达水平逐渐增加,120h达最高值,且在24h至148h期间均显着高于对照组(P<0.05)。高、低pH胁迫对中国对虾肌肉Caspase基因表达变化相似,3h略有升高,96h达最高值,148h均显着低于对照组(P<0.05)。高、低pH胁迫中国对虾3h后,其淋巴器官Caspase基因表达水平增加,且随着胁迫时间延长,各组Caspase基因表达水平一直处于较高水平。pH7.0组中国对虾胃Caspase基因表达3-12h显着低于对照组(P<0.05),之后呈波浪式变化,148h达最高值,与对照组相比差异显着(P<0.05);pH9.0组中国对虾胃Caspase基因表达3h显着降低,12-72h表达水平逐渐升高,120h达最高值。TUNEL分析结果表明中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0的水环境中12h,肝胰腺组织开始出现细胞凋亡现象,并且随着胁迫时间的延长肝胰腺细胞凋亡现象越明显,与TUNEL分析中的阳性对照表现相一致。相反pH8.2(对照组)中国对虾肝胰腺没有发现被深染的细胞核,与TUNEL阴性对照组的表现一致。这说明高、低pH胁迫均能够诱导中国对虾肝胰腺组织的细胞凋亡。第二部分,中国对虾Caspase基因的重组表达、分离纯化和多克隆抗体的制备。克隆中国对虾Caspase基因开放式阅读框序列,构建了该基因原核表达载体pET30a-CAS,通过E. coli稀有密码子分析,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE) pLysS,成功实现了Caspase基因在E. Coli中的表达。SDS-PAGE分析显示该重组蛋白分子大小约为50 kDa,略大于软件预测的分子量。MALDI-TOF-MS分析验证了该蛋白是中国对虾Caspase蛋白。利用固定金属亲和层析和Co-NTA技术获得的纯化Caspase重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备了特异性多克隆抗体,Western blot结果表明中国对虾血淋巴细胞、鳃、肌肉、淋巴器官、心脏、胃和肝胰腺组织中均有Caspase蛋白的表达,但在血清中未检测到特异性的谱带。第叁部分,pH胁迫对中国对虾抗氧化系统及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于pH8.2(对照组)、7.0、9.0(胁迫组)的水体中148 h,于胁迫后0、3、12、24、48、72、96、120、148h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴总抗氧化活力(T-AOC)、抗超氧阴离子活力、过氧化氢酶(CAT)活力和CAT、过氧化物还原酶(Prx)和HSP90基因表达的情况。结果显示, pH胁迫12h-24h,对虾各组织T-AOC、抗超氧阴离子、CAT酶活力及CAT基因表达均增加,pH胁迫120h-148h上述指标受到抑制。对虾肝胰腺和肌肉Prx基因表达随胁迫时间增加逐渐升高,鳃和血淋巴Prx基因表达随胁迫时间增加呈下降趋势。高pH(9.0)胁迫时,对虾鳃抗氧化系统酶活力及基因表达水平达峰时间较其他3个组织明显缩短;而低pH(7.0)胁迫时,对虾肝胰腺抗氧化系统酶活力比其他组织变化快。高pH(9.0)组中国对虾肝胰腺HSP90基因表达显着高于对照组(P<0.05),肌肉组织HSP90基因表达除72h外均显着低于对照组(P<0.05)。试验结果表明,pH胁迫3h-24h对中国对虾抗氧化系统酶活力及相关基因表达有一定的诱导效果,但胁迫120h-148h则抑制其抗氧化系统功能,可能会导致中国对虾机体的氧化损伤;中国对虾鳃和肝胰腺分别对高、低pH胁迫较敏感。第四部分,氨氮胁迫对中国对虾抗氧化系统、血淋巴氨氮成分及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于不同氨氮浓度(0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L)的水体中96h,于胁迫后0、6、24、48、72、96h测定中国对虾血淋巴氨氮、尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴的T-AOC、抗超氧阴离子、Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及CAT、Prx、Caspase、HSP90基因表达水平,结果显示:(1)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到13.449mg/L时,中国对虾血淋巴氨氮浓度明显升高,于24h-28h达最低值,72-96h达最高值,但均显着高于对照组(P<0.05)。(2)当水体氨氮浓度从0.220mg/L到9.446mg/L时:中国对虾血淋巴尿素氮含量明显升高且显着高于对照组(P<0.05),各组尿素氮浓度6h达最高值;中国对虾鳃、肝胰腺和肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显升高,并且各指标变化基本一致。当水体氨氮浓度从9.446mg/L到13.449mg/L时,血淋巴尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉Na~+ K~+-ATPase、Ca~(2+) Mg~(2+)-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显降低,说明高氨氮浓度抑制血淋巴尿素氮的合成、ATPase活性及HSP90基因表达水平(3)当水体氨氮浓度从0.303mg/L到8.625mg/L时,中国对虾T-AOC、抗超氧阴离子活力及CAT基因表达水平升高,并在胁迫后6h或96h达最高值;Prx基因表达水平均在72-96h达最高值。当水体氨氮浓度大于8.625mg/L时中国对虾的抗氧化系统受到抑制。(4)Caspase基因表达水平均在氨氮胁迫后的72-96h达最高值(实验后期),该表达变化与pH胁迫后Caspase基因的表达变化相似。推测高浓度氨氮能够诱导中国对虾Caspase基因的表达,进而诱导中国对虾的细胞凋亡。
逄锦菲[3]2013年在《“黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及其与抗WSSV性状的关联分析》文中指出中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国重要的经济虾类，WSSV制约我国对虾养殖业的发展。传统对虾选择育种模式与分子标记辅助育种技术相结合有利于中国对虾抗病品种的选育。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNP）被认为是很有应用前景的分子标记技术。本研究在中国对虾转录组454高通量测序的基础上，依据预测的SNP位点设计引物，利用非标记探针HRM（HighResolution Melting）技术，对单核苷酸突变进行验证开发。利用开发的132个SNP标记（实验室前期开发39个+本论文开发93个），对2008-2012年中国对虾抗WSSV性状测试实验中获得的抗性群体和敏感群体进行了遗传多样性分析，并对各位点基因型与抗WSSV性状进行了关联分析，获得了与抗WSSV性状相关的9个SNP标记。使用RT-PCR结合RACE技术对抗WSSV相关SNP位点Contig1401-67TA所在基因——中国对虾醛缩酶基因（aldolase）进行了成功克隆，并获得了该基因cDNA全长序列。具体内容如下：一、中国对虾多态性SNP位点开发中国对虾转录组454高通量测序、contig的拼装和SNP位点的预测由国家人类基因组南方研究中心完成。依据预测的SNP位点，从造成错义突变（mis-sence）的SNP位点中挑选了530个位点，共设计合成引物378组，筛选得到候选SNP位点301个并设计非标记探针，通过非标记探针HRM分型方法，在96尾2012年人工选育的“黄海2号”中国对虾群体中进行检测和验证，结果共有93个SNP位点显示多态性。每个SNP位点的观测等位基因数（Na）均为2个，有效等位基因数（Ne）分布范围1.0105~2.000，观测杂合度（Ho）的分布范围为0.000~0.9792，期望杂合度（He）的范围为0.0104~0.5026，次要等位基因频率（MAF）分布范围0.0052~0.5000。多态信息含量分析显示93个位点的PIC，其平均值为0.2182，低于标准值0.5。Shannon信息指数分布范围为0.0326~0.6931，平均值为0.3330。研究结果表明，通过HRM技术对中国对虾候选SNP位点进行验证开发是一种有效的方法，开发获得中国对虾SNP位点可用于后续实验研究。二、中国对虾抗WSSV相关SNP位点的筛选及关联分析利用132个SNP位点对“黄海2号”中国对虾抗性群体和敏感群体进行HRM基因分型分析，并对基因型分布频率进行卡方检验。结果显示，有9个SNP位点的10个基因型在抗性群体和敏感群体中分布频率差异显着(P﹤0.05)，其中C1401-67TA的A/A型、C7695-204AG的A/G型、C283-145AG的G/G型、C12355-592CT的C/C型在两群体中差异极显着(P﹤0.01)，C6625-56CT的C/T型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型差异显着(P﹤0.05)。进一步分析显示，位点C1401-67TA的A/A型、C6625-56CT的C/T型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型与抗病正相关，C7695-204AG的A/G型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C283-145AG的G/G型和C12355-592CT的T/T型与抗病负相关。借助NCBI网站BlastX程序对获得的与抗病性状相关的9个Contig进行分析，推测其潜在功能。除了Contig12698，其余8个Contig均匹配到了序列相似度较高的功能基因（E值<10-10），分别是果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphatealdolase），脱氧胞苷酸脱氨酶（deoxycytidylate deaMase），u5小核核糖核蛋白200解旋酶样蛋白（u5small nuclear ribonucleoprotein200kda helicase-like protein），甘氨酸脱羧酶（glycine decarboxylase），多态缩多氨酸（DEAD-box polypeptide39），半胱氨酸天冬酶（effector caspase），肽转运蛋白家族1-like（predicted：peptidetransporter family1-like），40S核糖体蛋白S2（40S ribosomal protein S2）。叁、中国对虾SNP类型特征及分布特点在中国对虾转录组454高通量测序的基础上，依据测序获得的7万余个可能的SNP位点和经过HRM验证获得的多态性SNP位点，分析中国对虾碱基突变的类型及其与周围碱基的相关性。结果表明，C/T突变类型最多，G/C突变类型最少，并且存在“转换偏差”为2.0>0.5；随着突变位点直接相邻位置上A&T碱基个数的增加，该突变位点的转换偏差逐渐降低；突变位点发生突变前后碱基组成存在(G+C)/(A+T)偏差。四、中国对虾抗病相关基因克隆及全长序列分析使用RT-PCR结合RACE技术对抗WSSV相关SNP位点Contig1401-67TA所在基因——中国对虾醛缩酶基因（aldolase）进行了成功克隆，并获得了该基因cDNA全长序列。序列分析结果表明，该cDNA全长2127bp，包含一个1098bp的开放阅读框，编码365个氨基酸。通过对中国对虾醛缩酶基因核苷酸序列和氨基酸序列分析、蛋白质结构和功能的预测与分析，进一步证实了本研究所获得中国对虾醛缩酶基因序列的正确性。经同源比对和进化树分析，中国对虾醛缩酶基因编码的氨基酸与节肢动物的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列相似性达85%以上，确定其是果糖-1,6-二磷酸醛缩酶。基因时空表达分析，感染WSSV后，肝胰腺中醛缩酶的表达量先上升后下降，结果显示中国对虾醛缩酶基因在抗WSSV感染过程中可能具有一定应激功能。
李昕[4]2011年在《KK-42对凡纳滨对虾热激蛋白基因表达的影响》文中研究指明热激蛋白(Heat Stress Protein, HSP)是一种在细胞中普遍存在并具有高度保守性的蛋白,在动物适应环境、提高其耐受性、实现自我保护和损伤修复的过程中都发挥重要作用。KK-42是一种咪唑类保幼激素拮抗物。我们的前期研究已经证明,使用KK-42处理凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)虾苗,可以显着提高其成活率,但是对于KK-42提高凡纳滨对虾成活率的机理仍不了解。鉴于HSP70和HSP90在生物环境适应性和自我保护方面的重要作用,我们以凡纳滨对虾为材料,研究了KK-42对上述两种基因表达的影响。实验采用浸润法,用1.95×10-4 M的KK-42对凡纳滨对虾幼虾(体长3.5-5.0 cm)进行处理,浸润时间为1 min,然后按正常方法饲养。实验过程中定期采样,解剖取其眼柄、肝胰腺、大颚器官、肌肉等组织,提取各组织器官中总RNA并进行反转录,研究了HSP90和HSP70的组织分布,采用RACE技术从其肝胰腺中克隆出凡纳滨对虾HSP90的cDNA全长序列,并对其进行序列分析,后进行荧光实时定量PCR,对肝胰腺中HSP90和HSP70的时空表达进行检测并研究了KK-42对其基因转录的影响。凡纳滨对虾HSP90基因的cDNA全长2543个碱基,该基因5' -端非翻译区(5'-UTR)长105 bp,3' -端非翻译区(3 '-UTR)长278 bp,开放阅读框(ORF)2160 bp,编码720个氨基酸,预测其蛋白质分子量为82.8 kD,理论等电点分别为6.65。其C端具有保守的EEVD结构,证明其为一种细胞质HSP,多序列比对结果显示凡纳滨对虾HSP90的氨基酸推导序列与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的同源性高达97.80%和97.22%。组织半定量结果显示,hsp 90和hsp 70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺中都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。荧光实时定量结果显示,实验期间,肝胰腺中两种HSP mRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显着诱导肝胰腺hsp的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分别比相应的对照组升高了243.4%、141.3%、410.5%和121.6%、505.5%、481.7%。结果表明,KK-42处理可显着刺激凡纳滨对虾肝胰腺HSP90和HSP70基因的转录,这可能是其提高成活率的原因之一。
李旭鹏[5]2014年在《中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析》文中指出中国对虾是我国主要的经济水产养殖品种，二十世纪九十年代白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）暴发以来其产业受到严重影响。近年来随着种苗和养殖水平整体的提高，我国对虾养殖业逐年发展。但时至今日，WSSV依旧是影响对虾养殖业的主要病原之一。从根本上解决对虾养殖业中WSSV等问题的关键是选育出抗病能力强和生长速度快等优良性状兼顾的中国对虾新品种。对于阈性状和低遗传力性状，将传统选育手段和先进的分子生物学技术相结合，能提高选择准确性，加快育种进程。本研究以中国对虾“黄海2号”454转录组测序数据为基础，以RACE、基因克隆、常规测序、HRM、ELISA、real-timePCR等常规生物学技术为平台，进行中国对虾抗WSSV性状候选基因和SNP分析，为中国对虾抗WSSV育种提供理论依据和实践材料。主要研究包括首次获得中国对虾MEK、ERK、Ras和组织蛋白酶B基因序列；开发、分析各基因内SNP位点；进行正常中国对虾和感染WSSV的中国对虾不同组织内各基因表达水平分析；感染中国对虾WSSV复制特点以及抑制中国对虾MEK/ERK信号转导通路对WSSV复制水平影响；挑选454转录组测序中的候选SNP位点；利用HRM技术在抗病组和敏感组内进行基因分型，统计遗传多态性信息和进行抗病关联分析等。具体内容包括：1、报道了中国对虾MEK（FcMEK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KJ135020）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcMEK mRNA在肝胰腺中6h和48h呈现上调表达，12h和24h转录水平下降。FcMEK mRNA在鳃中12h、24h和48h转录水平上升，6h转录水平下降。FcMEK mRNA在肌肉中6h、12h、24h和48h转录水平上升。结果提示FcMEK表达受WSSV感染影响。通过常规测序技术在FcMEK mRNAORF内发现叁个SNP位点，分别位于ORF的第762bp、765bp和972bp处。叁个SNP突变位点都是C/T转换，分别命名为C-762T、C-765T和C-972T。结果表明C-762T和C-765T位点位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对中国对虾抗病组和敏感组内上述叁个SNP位点进行基因分型，C-762T和C-765T突变位点得到可读峰图，提示附近没有内含子存在。抗病组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.604，He为0.424，MAF为0.302。敏感组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.583，He为0.424，MAF为0.302。C-762T和C-765T突变位点在两组内都偏离HWE，但进一步的抗病组和敏感组卡方检验结果表明，两个组间的基因型分布没有显着差异。偏离HWE提示在整个中国对虾“黄海2号”选育群体中该位点有可能受到了选择。2、报道了中国对虾ERK（FcERK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537791）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcERK mRNA在肝胰腺中6h、12h、24h和48h转录水平下降。FcERKmRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcERK mRNA在肌肉中48h转录水平上升，6至24h呈现小幅波动变化趋势。肝胰腺中FcERK蛋白从3h到24h呈现缓慢升高趋势，至48h下降。3h、12h和48h鳃中FcERK蛋白水平上升，在6h和24h下降。12h和48h肌肉中FcERK蛋白水平上升，3h、6h和24h下降。感染WSSV后FcERK表达水平的变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcERK mRNAORF内发现一个SNP位点，在3’UTR内发现一个SNP位点，都是C/T转换，分别命名为C-544T、C-1133。利用HRM技术对中国对虾抗病组和敏感组内上述两个SNP位点进行基因分型，抗病组内C-544T突变位点Ho为0.146，He为0.154，MAF为0.083。敏感组内C-544T突变位点Ho为0.208，He为0.204，MAF为0.115。抗病组内C-1133T突变位点Ho为0.177，He为0.162，MAF为0.089。敏感组内C-1133T突变位点Ho为0.156，He为0.145，MAF为0.078。两个SNP位点在两组内都符合HWE，且两组间基因型分布没有显着差异，虽然本研究结果提示FcERK可能参与中国对虾抗WSSV过程，但基因内两个突变位点并没有影响FcERK在抗WSSV过程中的作用。上述两个SNP位点的MAF都远大于0.05，适合进行关联分析，作为信号转导通路中的重要激酶，FcERK内SNP位点值得深入研究。3、本研究发现感染WSSV后死亡的中国对虾，后期死亡个体病毒含量高于早期死亡个体，提示对虾抗WSSV性能从一方面体现在耐受病毒数量上，因此以育种目的来讲，除了能耐受更多病毒的感染，抑制病毒复制速度，甚至是杀灭病毒的能力，是对虾能最终存活下来的关键，另外研发新药物来抑制宿主体内病毒复制能力也能提高染病对虾存活率。利用MEK的特异抑制剂U0126抑制中国对虾MEK/ERK通路活性后，检测感染宿主的WSSV复制水平。与对照组相比，添加U0126的实验组中WSSV复制水平受到抑制，24h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之二；48h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之叁。综合本研究中对于FcMEK和FcERK基因在感染WSSV的中国对虾不同组织内表达变化的研究结果，提示WSSV在感染中国对虾时需挟持宿主MEK/ERK通路用于其自身复制。4、报道了中国对虾Ras基因（FcRas）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号KC522602）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcRas mRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcRas mRNA在鳃和肌肉组织中6h、12h、24h和48h都呈上调表达。感染WSSV后转录水平的明显变化提示FcRas受到WSSV感染的影响。对26只中国对虾FcRas mRNA测序结果中未发现SNP位点，是本文所研究的五个基因中唯一一个没有发现SNP位点的基因，从一个方面也提示Ras基因高度保守性的特点。5、报道了中国对虾组织蛋白酶B（FcCathepsin B）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537790）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcCathepsin B mRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcCathepsin B mRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcCathepsin B mRNA在肌肉中6h、12h和48h转录水平上升，24h略微下降。感染WSSV后转录水平的明显变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcCathepsin B ORF内发现叁个SNP，分别位于ORF第42bp、756bp和984bp，叁个SNP位点都是C/T转换，并命名为C-42T、C-756T和C-984T。结果表明该叁个SNP位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对抗病组和敏感组进行SNP基因分型，C-984T突变位点处有可读峰图，提示其周围没有内含子存在。抗病组中C-984T突变位点的Ho为0.375，He为0.344，MAF为0.219。敏感组中C-984T突变位点的Ho为0.417，He为0.355，MAF为0.229。该SNP位点在两组内都符合HWE，且基因型分布没有显着差异，说明该SNP位点并没有影响基因在抗WSSV过程中的作用。上述SNP的MAF远大于0.05，适合进行关联分析。6、利用HRM技术对中国对虾“黄海2号”454转录组测序中的候选SNP位点进行验证和分析，81个SNP位点得以确认，且发现1个抗病相关位点。本研究挑选480个候选SNP位点，设计相应HRM引物480对，经验证其中合格引物243对。设计相应非标计探针，通过HRM实验对中国对虾抗病组和敏感组进行基因分型，共有81个位点确认为SNP，并统计Ho、He、Ne、MAF、I、HWE信息。81个SNP位点在抗病组中有55个位点MAF大于0.05，在敏感组中有56个位点MAF大于0.05，这些SNP位点的多态性较高，适合进行关联分析。81个SNP位点在抗病组中有65个符合HWE，敏感组中有60个符合HWE。在81个SNP位点中，A/C突变4个，A/G突变27个，A/T突变11个，C/G突变9个，C/T突变28个，T/G突变2个，转换/颠换=2.115，符合“transition bias”原理。通过关联分析发现312C1298-154C/T突变位点的C/C基因型在2011年和2012年抗病组和敏感组中都差异分布，提示该位点与抗WSSV性状相关。通过基因克隆技术获得该抗病相关SNP位点所在基因，为磷酸丙酮酸水合酶，命名为FcPH（序列上传至GenBank，登录号KJ649284）。FcPH mRNA ORF长1305bp，编码434氨基酸。利用real-time PCR检测该基因表达水平在感染WSSV的中国对虾鳃和肌肉中都有明显升高。结果提示磷酸丙酮酸水合酶受到WSSV感染过程影响，该基因内所发现的SNP位点与抗WSSV性状相关。
李微[6]2014年在《中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析》文中指出病毒感染会激发宿主的免疫应答反应，宿主细胞内的一些因子在这一过程中起着重要的作用，其表达量通常会发生上调或下调的表达变化。白斑症病毒（WSSV）病是危害对虾养殖业健康发展的最重要疾病之一，中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)对其极其易感，为寻找在中国对虾应答WSSV感染反应中起关键作用的蛋白，本文利用蛋白质组学技术鉴定了中国对虾感染WSSV后血细胞中发生差异表达的蛋白质，并对其中的2种蛋白—小泛素相关修饰物（SUMO）和蛋白磷酸酶进行了深入分析，为揭示对虾抗WSSV反应的分子机制提供了重要数据，具体研究内容和结果如下：（1）中国对虾感染WSSV后血细胞差异表达蛋白质的鉴定。双向（2D）电泳分离感染组和对照组对虾血细胞样品，并用PDQuest软件分析2D凝胶。结果成功获得了中国对虾血细胞总蛋白2D图谱，每张凝胶上有约580个蛋白质点被检测出；WSSV感染24后，共有26个蛋白质点呈显着性上调表达（P﹤0.05），19个蛋白质点呈显着性下调表达。随后，对差异表达蛋白质进行质谱分析，共有33种蛋白质得到了成功的鉴定，包括SUMO1、细胞质MnSOD、微管蛋白α1链、微管-肌动蛋白交联因子1、磷酸丙糖异构酶、核受体E75蛋白、空泡ATP合酶亚基BL、肌醇1,4,5-叁磷酸受体和精氨酸激酶等；利用生物信息学方法将鉴定的蛋白进行GO功能分类，结果将其分为9个类群，分别为：免疫相关蛋白、刺激应答蛋白、细胞骨架蛋白、DNA或蛋白质结合蛋白、葡萄糖代谢相关蛋白、甾类激素介导的信号转导蛋白、ATP合酶、跨膜转运蛋白和未分组蛋白。此外，利用实时荧光定量PCR检测WSSV感染后对虾血细胞中3种上调表达蛋白（细胞质MnSOD、热休克蛋白70和精氨酸激酶）和1种下调表达蛋白（酚氧化酶原）对应基因的表达变化情况，结果显示，这些因子在mRNA水平的变化与蛋白质组学结果较为一致。（2）中国对虾SUMO及其E2结合酶UBC9的基因克隆与表达分析。从鉴定出的差异表达蛋白质中选取SUMO进行深入分析，首先，采用RACE技术对中国对虾SUMO和UBC9进行基因克隆，结果显示，中国对虾SUMO cDNA全长1128bp，包含一个282bp的开放阅读框（ORF），编码93个氨基酸，其理论分子量为10.6kDa；UBC9cDNA全长1170bp，包含一个483bp的ORF，编码160个氨基酸，其理论分子量为18.4kDa;同源性比对发现，中国对虾的SUMO和UBC9均高度保守。随后，利用实时荧光定量PCR分别检测了SUMO和UBC9mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，SUMO和UBC9基因在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，二者均在血细胞和性腺中呈高丰度表达；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中这2种基因均呈显着性上调表达，且血细胞中的上调表达更为显着。（3）中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的原核表达及多克隆抗体制备及应用。利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的重组表达质粒，pET-28a-SUMO和pET-28a-UBC9，诱导表达后得到分子量分别为19.7kDa和25.6kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化；用纯化蛋白免疫小鼠，分别获得了抗SUMO和UBC9的多克隆抗体（PAb）。应用PAb分析中国对虾血细胞中SUMO和UBC9的特性，western blotting结果显示，SUMO的PAb可以特异性识别血细胞中13.5kDa的蛋白，而UBC9的Pab可以识别18.7kDa的蛋白；间接免疫荧光实验结果表明，SUMO分布于血细胞的细胞核和细胞质中，而UBC9主要分布于细胞核中。（4）RNA干扰实验分析SUMO和UBC9在病毒感染中的作用。利用体外转录法，分别合成了SUMO和UBC9的双链RNA（dsRNA），dsSUMO和dsUBC9。随后，将dsRNA注射到对虾体内以研究SUMO或UBC9基因沉默对WSSV感染的影响。结果显示，病毒感染后，RNA干扰组对虾血细胞中的WSSV拷贝数和病毒基因的表达量均较阳性对照组低；累计死亡率曲线显示，SUMO或UBC9的沉默均在一定程度上降低了WSSV感染引起的对虾的死亡。（5）中国对虾蛋白磷酸酶1催化亚基β（PP1β）的基因克隆及原核表达。首先，采用RACE技术对中国对虾PP1β进行基因克隆和生物信息学分析，结果显示，PP1β cDNA全长1214bp，包含一个987bp的ORF，编码328个氨基酸，其理论分子量为37.6kDa；同源性比对发现，中国对虾的PP1β氨基酸序列表现出高度保守性。随后，利用实时荧光定量PCR检测了PP1β mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，PP1β在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，其中在性腺中表达最高，血细胞次之；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中PP1β基因均呈上调表达，并在12h达到峰值，且血细胞中的上调表达更为显着。此外，利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾PP1β ORF的重组质粒pET-28a-PP1β，诱导表达后得到分子量为41kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化。
李少飞[7]2014年在《中国对虾氨氮代谢酶基因的cDNA克隆及其在氨氮解毒代谢过程中的作用》文中研究表明中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是黄渤海海域十分重要的养殖虾类，具有生长速度快、对低温耐性强、品质好等特点。中国对虾“黄海3号”是本实验室经过长期选育而培育出的中国对虾新品种，具有抗逆性强的新特性，能够在较高的氨氮及pH环境下生存。氨氮是衡量水质质量好坏的重要标准，已有研究表明养殖水环境中氨氮含量过高会对对虾的生理机能及对细菌和病毒的的抵抗力有显着的影响，甚至导致对虾非病原感染性死亡。天门冬氨酸氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是生物体氨基酸分解代谢及氨氮转化和排泄过程中的关键酶，本实验对以上酶基因（天门冬氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶）进行了cDNA全长克隆并对其在氨氮代谢中的作用进行了研究，以期为中国对虾氨氮代谢途径的研究提供依据以及对“黄海3号”抗逆性机制的研究提供实验基础。研究内容包括以下叁个部分：第一部分：中国对虾天门冬氨酸转氨酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对4mg/L和16mg/L氨氮胁迫下的中国对虾肝胰腺和鳃组织中的天门冬氨酸转氨酶活力进行了测定。结果显示，两胁迫组实验过程中大部分时间酶活力均被抑制。利用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)天门冬氨酸转氨酶GOT基因(FcGOT)。FcGOT基因cDNA全长为1910bp,其中，开放阅读框1284bp,编码427个氨基酸。同源性分析表明，中国对虾天门冬氨酸转氨酶GOT氨基酸序列与其他节肢动物高度保守，与克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和桔粉蚧壳虫(Planococcus citri)的同源性分别为78%和73%。系统进化分析表明，FcGOT基因氨基酸序列与克氏原螯虾GOT聚为一支。组织表达分析发现FcGOT基因在肝胰腺、鳃、血细胞、肌肉、心脏、淋巴中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，荧光定量PCR分析结果表明，FcGOT基因在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比具有显着差异(P<0.05)，表明FcGOT基因在氨氮代谢方面具有重要的作用，参与了中国对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。第二部分：中国对虾谷氨酸脱氢酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对不同浓度氨氮胁迫后肌肉组织中GDH活性变化进行了测定，结果表明，氨氮能够刺激GDH酶活力增强。实验过程中，两胁迫组的GDH活力均上调，16mg/L组上调的幅度比4mg/L组大。采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶GDH基因(FcGDH)。FcGDH基因全长1779bp,包括一个1659bp的开放阅读框(ORF)，编码552个氨基酸；同源性分析表明，中国对虾谷氨酸脱氢酶GDH氨基酸序列与其他动物高度保守，其中与南美白对虾最为相似，高达98%；系统进化树分析表明，中国对虾FcGDH氨基酸序列与南美白对虾GDH聚为一支，之后的聚类次序依次为：中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现FcGDH基因在肝胰腺、鳃、血淋巴、肌肉、淋巴、胃、肠中均有表达,其中肌肉中表达量最高。这可能跟肌肉组织是蛋白质沉积的主要组织，也可能是氨基酸储存的主要组织有关。氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明，FcGDH基因在肌肉和鳃组织中变化显着，在胁迫后期两胁迫组FcGDH基因表达量均上调，且与对照组相比差异显着（P<0.05），说明FcGDH基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。第叁部分：氨氮胁迫对谷氨酰胺合成酶活力及基因表达的影响。氨氮胁迫后，肝胰腺和肌肉中的GS活力均明显上调；高浓度（16mg/L）氨氮胁迫下肌肉和肝胰腺中GS含量高于低浓度（4mg/L）氨氮胁迫，并随胁迫时间的延长酶活有所上升，说明了GS在合成谷氨酰胺降低体内氨氮毒性方面的作用。对肝胰腺和肌肉组织中的FcGS基因进行荧光定量分析显示，不同氨氮浓度胁迫下肝胰腺和肌肉中FcGS基因均上调，从整体来看，肌肉组织中的FcGS基因表达水平要略高于肝胰腺，这与酶活测定的实验结果一致。以上结果说明谷氨酰胺合成酶对外界氨氮胁迫具有积极的响应，说明谷氨酰胺合成酶在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。
刘敬文[8]2014年在《凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析》文中研究说明凡纳滨对虾作为我国养殖产量最高的种类，在对虾养殖中占有举足轻重的地位，其可持续养殖一直为是对虾养殖业追求的目标。然而由于优良种质的缺乏以及对虾病害的频发严重影响着养殖业的健康可持续发展。对虾白斑综合症病毒（WSSV）以其致死率高、感染范围广、传播速率快、极难治愈的特征成为对虾养殖业的头号杀手。培育具有WSSV抗性的对虾品系用于对虾养殖业，是从根本上解决种质和病害问题的唯一途径。由于抗性性状选择的复杂性，分子标记技术可以辅助选育工作，避免选育的盲目性并增加选育的进程。单核苷酸多态性（SNP）被认为是在遗传育种中最具发展前景的分子标记。本研究在凡纳滨对虾多个转录组数据的基础上，以选育品种科海一号的多家系种质库资源作为研究对象，对免疫相关基因SNPs进行了验证及筛选，一方面研究了对虾重要免疫效应因子ALFs在应答WSSV刺激时的表达变化及其多态性与抗性的相关分析，另一方面以免疫信号通路和多个效应因子基因为目标进行了抗性关联分析，以期获得与对虾抗WSSV相关的SNP标记，以指导对虾的抗性育种。主要进展如下：1、根据基因注释信息，从solexa测序和454测序的数据库中分别筛出156条和86条unigenes，共计242条unigenes，其中56条为免疫信号通路相关基因，186条为免疫效应因子基因。通过对这些基因序列进行进一步的生物信息学分析，获得含1644个SNPs (868个来自solexa测序数据库，776个来自454测序数据库)的免疫基因的SNPs初级库。从初级库中随机选取72个位点进行了验证，确定以Q>20(solexa)和duel min≥9(454)作为筛选高质量SNPs (预测准确率>85%)的条件。将unigenes序列与已有的部分基因组序列进行了比对，剔除无法在基因组序列中进行定位的位点，最终确定了由681个SNPs组成的免疫基因候选标记库(solexa中593个，454中88个)。2、对从转录组中获得的6个ALFs (nLvALF1、2、4、5、6、7)基因进行了序列验证，这6个ALFs的开放阅读框(ORF)分别编码123、94、120、124、123、122个氨基酸，它们的ORF中均含有ALF保守功能结构域-LPS结合结构域(LBD)，除nLvALF6外其余五种ALFs的LBD均呈现正电性。序列比对和系统进化分析表明本研究中只有nLvALF4、7为已有报道的LvALF，其余4种均为新的亚型且与中国对虾ALFs具有高度的相似性和同源性。6种ALFs在9种组织(Oka、肝胰脏、鳃、血细胞、肠、胃、心脏、表皮、眼柄)中表达存在明显差异。在WSSV感染后36-72h，感染组的nLvALF1、2、4、5、6表达量均显着高于对照组(P<0.05)，而nLvALF7则为下调表达。推测各亚型ALFs发挥了不同程度的作用。3、以科海一号多家系种质库个体为材料进行了WSSV感染实验，共历时19天，取初期死亡的48尾对虾作为易感组，最后存活的48尾作为抗性组材料，对两组进行了病毒拷贝数检测发现其拷贝数存在极显着差异(P<0.01)，推测抗性组体内发生了有效的病毒清除过程。将ALFs基因序列与基因组信息进行比对及拼接后获得了不同ALFs的基因组序列，然后通过扩增、测序获得了较完整的nLvALF1、2、4、6、7基因组序列及SNPs分布信息。凡纳滨对虾的nLvALFs具有较高的多态性，平均每21bp存在一个SNP。选取这些ALFs的部分SNPs在抗性组和易感组中进行了分型，结果表明，nLvALF1内含子I中的位点g.1361-T>C、g.1370-T>C、g.1419-T>A的等位基因分布频率在易感组和抗性组间存在显着差异，其抗性优势等位基因分别为C、C、A。nLvALF2及nLvALF6中也发现了与WSSV易感/抗性关联的SNPs且均位于3’ UTR，nLvALF2中g.2422A>G、g.2466T>C和g.2529G>A抗性优势基因型分别为AA、TT、AA，nLvALF6中g.2994T>A的AT型与易感性相关。nLvALF1的SNP位点g.1415-C>A和g.1419-T>A组成的单倍型CT与科海一号对WSSV易感性显着相关。4、通过高通量SNaPshot分型技术对筛选出的叁条主要免疫信号通路基因(JAK/STAT、Toll、IMD pathways)的SNPs和主要免疫效应因子SNPs进行了分型，进而分析了各SNPs与WSSV抗性/易感性的关联性，结果表明，位点unigene30237(STAM,3’ UTR)和unigene16729(TRAF6, nsSNP)的基因型及等位基因型均与WSSV抗性显着相关(P<0.05)，位点unigene15411(TLR, sSNP)的G等位基因在抗性组的发生频率远高于易感组(P<0.05)，位点Unigene26970(Hemocyanin)的CT型、Unigene34569(Cu/Zn SOD, sSNP)的AA型与WSSV抗性相关(P<0.05)，位点Unigene34129-1(未知基因, sSNP)的CT型及T等位基因型在抗性组中的频率显着高于易感组(P<0.05)。本研究为ALFs在对虾抗病毒免疫机制的功能研究提供了一定的辅助作用，通过关联分析获得的差异SNPs可作为科海一号WSSV抗性品种选育的分子标记。
杜盈[9]2013年在《中国对虾基因组DNA甲基化MSAP技术的建立与应用》文中提出本文建立并优化了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组DNA甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术，从表观遗传学角度分析讨论了中国对虾野生群体和人工选育种黄海1号不同组织间的甲基化水平和多态性差异，分析了在氨氮和pH胁迫条件下中国对虾基因组DNA的甲基化模式，探讨了甲基化修饰是否参与中国对虾抗逆性状的分子机制，以期为中国对虾抗氨氮和pH新品种培育提供理论依据。主要研究内容分为以下叁个部分：第一部分建立并优化了中国对虾DNA甲基化分析的MSAP程序和体系。主要从酶切体系、预扩增PCR体系和选择性扩增体系叁个方面进行。包括内切酶量、酶切时间、模板浓度、预扩增缓冲液量以及聚丙烯酰胺凝胶浓度等条件的优化，获得最佳反应程序和体系。酶切反应：7.5U同裂酶HpaII或MspI，EcoRI对1uL DNA模板37℃酶切8h；预扩增反应：10倍稀释连接产物为模板，1U TaqDNA Polymerse，2.2uL10×Taq buffer (Mg2+=33pmol)共20体系；选择性扩增反应：10倍稀释预扩增产物为模板，30pmol引物，1U Taq DNA Polymerse，2.0uL10×Polymerse buffer。选扩增产物经变性在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳下进行MSAP分析。第二部分应用建立的MSAP技术分别对中国对虾野生群体和选育品种“黄海1号”的肌肉、鳃、血液叁种组织基因组DNA的CCGG甲基化水平进行对比分析，试图从表观遗传学角度探讨影响中国对虾生长性状的分子机制。采用30对引物进行选择性扩增，结果显示：中国对虾野生群体肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为23.1%、22.3%和19.7%；黄海1号肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%。中国对虾野生群体和“黄海1号”同一组织间的甲基化水平不同（P≤0.05），而肌肉、鳃和血液不同组织间的甲基化水平也各不相同（P≤0.05）。DNA甲基化多态性分析结果表明：中国对虾野生群体和“黄海1号”各组织的多态性条带转变中，鳃组织的多态性变化幅度最大，Class d、Classc、Class b中typeⅠ均发生增高或降低；肌肉其次，只在Class b中typeⅠ升高54.2%；而血液最为稳定，无明显变化。第叁部分应用MSAP技术对不同浓度氨氮和不同pH梯度急性胁迫处理的中国对虾肌肉组织进行基因组DNA甲基化模式分析，以期为中国对虾抗氨氮和抗pH品系的选育提供理论依据。氨氮胁迫试验结果表明：中国对虾DNA甲基化水平变化在23.66%-24.17%，当NH4Cl≤8mg/L时，中国对虾DNA总甲基化水平下降，但与对照组相比，差异不显着（P≧0.05），而半甲基化水平则发生明显上升（P≤0.05）。当NH4Cl≥8mg/L，DNA总甲基化水平上升，其上升趋势与氨氮浓度呈一定的正相关性。pH胁迫试验结果表明：中国对虾DNA甲基化水平变化的幅度为21.73%-22.11%，pH值小于8.0或大于8.8急性胁迫时，DNA总甲基化水平降低，前者降低幅度（pH7.2和7.6时分别降低0.34%和0.38%；）与后者（pH=8.8和9.2时分别降低0.21%和0.28%）相比差异显着（P≤0.01）。而半甲基化水平反应趋势则随pH的增加而降低。
王兵[10]2003年在《中国对虾免疫相关基因和性别相关核酸片段研究》文中指出因为中国对虾比较显着的性别二态性可以给生产带来巨大利益,性控研究一直是国际同行研究的热点与难点,对对虾性别相关核酸片段的研究不但具有广阔的应用价值,而且还可以为进一步的研究提供理论依据和指导; 由于对对虾抗病机制了解的甚少,对虾养殖业因病害大规模爆发而损失惨重,因而免疫基因的研究有助于弄清对虾的抗病机理,为对虾病害的预防和控制奠定基础。本研究运用差异显示技术,筛选了中国对虾性别相关核酸片段; 利用cDNA文库和消减文库、EST大规模测序、基因芯片和生物信息学等技术手段,对中国对虾免疫相关基因进行研究,获得了一些重要进展,结果如下:1.通过双随机引物差异显示技术,筛选到了一条中国对虾性别相关核酸片段,该片段大小为±500bp。在PCR反应条件相同的情况下,该片段表现为在雌性个体的扩增产物要多于雄性个体。将该片段克隆后进行了测序,并根据测序结果设计了特异性PCR扩增引物。该片段的差异在DNA和RNA中都可以检测出,可以作为探针为性别控制技术提供快速检测手段。2.构建了中国对虾头胸部组织的cDNA文库并首次对中国对虾EST进行大规模的测序,共获得EST 10446条,拼接后得到3120条无冗余基因片段。在中国对虾EST数据的分析中,通过功能注释,共获得了1373条已知基因,其余1747条unique基因为未知基因。从EST数据中挖掘出微卫星324个,约占总EST数目的3%,并对中国对虾的新陈代谢途径、基因功能分类等重要生物学信息进行了分析。3.构建了中国对虾WSSV感染前后的正、反向抑制性消减杂交cDNA文库(正向库容为3.7e×10~4,反向文库为1.2e×10~4)。获得了相当数量的分别在正常和感染虾体内特异表达的基因,为抗WSSV基因的筛选奠定了基础。4.利用已知序列的EST和对虾消减文库中的克隆,构建了中国对虾表达谱芯片。该芯片共有待研究cDNA片段3114个,其中1578个克隆来自EST数据中的unique基因,1536个克隆来自消减文库(正、反向文库各768个)。5.利用cDNA芯片杂交技术,对WSSV感染后6小时组织和濒死对虾组织进行了研究,筛选与抗WSSV病毒相关的基因。经数次实验结果迭加后,来自
参考文献：
[1]. 编码中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）和凡钠对虾（Litopenaeus vannamei）一种HSP70的cDNA研究[D]. 焦传珍. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2003
[2]. pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究[D]. 王芸. 上海海洋大学. 2011
[3]. “黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及其与抗WSSV性状的关联分析[D]. 逄锦菲. 上海海洋大学. 2013
[4]. KK-42对凡纳滨对虾热激蛋白基因表达的影响[D]. 李昕. 河南师范大学. 2011
[5]. 中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析[D]. 李旭鹏. 中国海洋大学. 2014
[6]. 中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析[D]. 李微. 中国海洋大学. 2014
[7]. 中国对虾氨氮代谢酶基因的cDNA克隆及其在氨氮解毒代谢过程中的作用[D]. 李少飞. 大连海洋大学. 2014
[8]. 凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析[D]. 刘敬文. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2014
[9]. 中国对虾基因组DNA甲基化MSAP技术的建立与应用[D]. 杜盈. 中国海洋大学. 2013
[10]. 中国对虾免疫相关基因和性别相关核酸片段研究[D]. 王兵. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2003
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