（1遵义医学院法医病理教研室 贵州 遵义 563099）（2牡丹江医学院红旗医院 黑龙江 牡丹江 157011）（3牡丹江医学院基础医学院 黑龙江 牡丹江 157011）（4遵义医学院生理教研室 贵州 遵义 563099）
【摘要】目的：研究CD44v6、Transgelin、Transgelin2在结直肠癌中的表达及其与临床病理因素之间的关系，探讨CD44v6、Transgelin、Transgelin2对结直肠癌预后影响。方法：采用免疫组化SP法，对112例结直肠癌及相应癌旁组织做CD44v6、Transgelin、Transgelin2的抗原标记。结果：CD44v6表达与肿瘤大小、AJCC分期、组织学分级、淋巴结转移密切相关（P＜0.05）；Transgelin表达与组织学分级、淋巴结转移显著相关（P＜0.05）；Transgelin2表达与AJCC分期，淋巴结转移显著相关（P＜0.05）。Transgelin和Transgelin2在结直肠癌中呈负相关；Transgelin2和CD44v6呈正相关；Transgelin和CD44v6无相关性。CD44v6明显影响患者生存率（P=0.000），Transgelin、Transgelin2对患者预后无明显影响。结论：CD44v6和Transgelin2在结直肠癌发展过程中起相互促进作用，Transgelin和Transgelin2呈相互抑制作用，CD44v6可作为判断结直肠癌预后的标记物。
【关键词】CD44v6；Transgelin；Transgelin2；结直肠癌；预后
【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）26-0187-03
结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是一种多基因疾病，由抑制基因、致癌基因、错配修复基因以及细胞周期调控基因的改变引起[1]。虽然近年相继报道了一些肿瘤干细胞标记物如CD133、CD44等以及结直肠癌预后相关分子标记物如IMP3、S100A2等[2]，但随着干细胞标记物的深入研究证实多种恶性肿瘤的发生发展都与CD44v6有密切关系[3]，CD44v6是最早发现的一种CD44粘附分子，在肿瘤侵袭、转移过程中起重要促进作用[4]，但CD44v6是否可作为独立判断结直肠癌预后标记物的研究报道甚少。因此，本研究拟联合检测CD44v6和Transgelin、Transgelin2在结直肠癌中的表达，并分析其与临床病理特征及对预后生存的影响。
1.材料与方法
1.1 材料
收集徐州医学院附属医院（2005～2008年）资料完整的原发性结直肠癌112例及相应癌旁组织，男62例，女50例，年龄21～87岁，平均53.6岁，病例依据（AJCC）TNM分期标准：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期53例，低分化32例，高-中分化80例（表1）。实验标本征得徐州医学院附属医院伦理委员会同意。
1.2 试剂和方法
标本制成组织微阵列（tissue microarray，TMA），厚4um连续切片，采用S-P（streptavidin-perosidase）试剂盒（福州迈新）检测3种抗体：CD44v6（ABD serotec，货号:MCA1730）、Transgelin（Proteintech，货号：10493-1-AP）和Transgelin2（Proteintech，货号：10234-2-AP）。Transgelin、Transgelin2（1:150稀释）、CD44v6（1:200稀释），用0.01mol/L枸橼酸盐酸缓冲液（pH6.0）高温高压法行抗原修复，PBS液代替一抗做空白对照。
1.3 结果判定
分析阳性细胞占同类细胞的百分比及阳性细胞的着色强度，判断免疫组化结果。三种蛋白均成棕褐色表达，CD44v6线性表达于细胞膜，Transgelin颗粒状表达于细胞核，Transgelin2颗粒状表达于胞浆；每例标本观察5个视野（400倍），计算阳性细胞数，染色强度：无染色为0，轻度染色为1，中度染色为2，强染色为3；阳性细胞所占百分比：0分为阳性细胞＜10%，1分为10%～30%，2分为30%～50%，3分为50%～70%，4分为70%～100%，两种积分相乘，依照0为阴性（-），1～3为弱阳性（+），4～8为阳性（++），9～12为强阳性（+++）。免疫组化结果由两名病理科医生独立判读，判读结果不一致时，由第三方病理医生参与协商做出判读。
1.4 统计学处理
采用SPSS17.0和Stata12.0进行统计分析，分别用以秩和检验、Pearman相关分析、Kaplan-Meier生存分析、Cox模型分析。
2.结果
2.1 CD44v6、Transgelin、Transgelin2表达
三种蛋白均为棕褐色表达，CD44v6在112例结直肠癌中阳性表达74例（66.1%），呈线性分布于癌细胞膜，癌巢及周边区域表达明显增强（图1-A、B、C、D），癌旁无表达。Transgelin有94例（83.9%）阳性表达，呈颗粒状表达于细胞核，（图1-E、F、G、H），癌旁间质偶有表达。Transgelin2有71例（63.4%）呈棕褐色颗粒表达于癌细胞浆，（图1-I，J、K、L），癌旁组织偶有表达。
2.2 Transgelin、Transgelin2、CD44v6表达与结直肠癌临床病理特征的关系
CD44v6与结直肠癌肿瘤大小（χ2=22.002，P=0.000）、AJCC分期（χ2=30.023，P=0.000）、组织学分级（χ2=14.638，P=0.002）、淋巴结转移（χ2=34.504，P=0.000）密切相关；Transgelin与组织学分级（χ2=22.409，P=0.000）、淋巴结转移（χ2=7.932，P=0.047）显著相关；Transgelin2与AJCC分期（χ2=32.594，P=0.000），淋巴结转移（χ2=12.406，P=0.006）显著相关。
2.3 CD44v6、Transgelin、Transgelin2的相关关系
结直肠癌中Transgelin 和Transgelin2为负相关性（r=-0.228，P=0.016），Transgelin和CD44v6无相关性（P＞0.05），Transgelin2和CD44v6呈正相关（r=0.556，P=0.000），Transgelin2和CD44v6在结直肠癌中起相互促进作用。
2.4 CD44v6、Transgelin、Transgelin2表达与各临床病理参数对患者预后影响
Kaplan-Meier生存分析如图2示，CD44v6阳性患者术后五年生存率明显低于阴性患者（P=0.000）（图2-i），而Transgelin、Transgelin2表达患者术后五年生存率与阴性患者无显著差异（P=0.386，P=0.982）（图2-g，h）；肿瘤大小，AJCC分期，组织学分级，淋巴结转移（图2-c，d，e，f）均与预后明显相关（P=0.000），而性别、年龄与生存无关（P=0.956，P=0.508）（图2-a，b）。
2.5 Cox模型分析
经Cox分析显示：肿瘤大小[HR（95%CI）：0.573（0.361～0.908）；P=0.018]、组织学分级（Poor）[HR（95%CI）：13.408（5.330～33.728）；P=0.000]、AJCC 分期（Ⅲ+Ⅳ）[HR（95%CI）：5.051（2.959～8.621）；P=0.000]、 CD44v6[HR（95%CI）：0.277（0.131～0.587）；P=0.001]均可作为判断结直肠癌预后的指标。（HR：hazard ratio；CI:confidence interval）
3.讨论
人类CD44基因因其结构中外显子的差异分为：CD44（s）标准型和CD44（v）变异型[5]，而CD44v6是最早发现的一种CD44粘附分子，在肿瘤细胞侵袭、转移过程中起重要促进作用[4，6]。已证实乳腺癌等多种肿瘤的侵袭转移都与CD44v6有密切关系[3]。Matilde Todaro等[7]发现CD44v6可能是一个功能性生物标记分子又是结直肠癌干细胞治疗性靶点之一。本研究发现结直肠癌中CD44v6表达显著高于癌旁组织，并且CD44v6表达与肿瘤大小、AJCC分期、组织学分级及淋巴结转移均关系密切，并随着肿瘤细胞分裂增多，癌巢周边其阳性表达增强，可能与肿瘤干细胞分裂旺盛及蛋白表达增多相关。本研究通过Kaplan-Meier和Cox分析发现，CD44v6表达患者术后五年生存率明显低于阴性患者，进一步明确CD44v6可作为判断结直肠癌预后的独立标记物。
Transgelin也被称为SM22[6-8]、转胶蛋白等，并证实存在于细胞骨架中[9]，Transgelin可通过抑制HT1080细胞中MMP9表达而抑制细胞转移[10]。Transgelin2是Transgelin的同系物，其具体功能作用机制不详。本研究发现Transgelin表达与组织学分级、淋巴结转移关系密切，Transgelin2与结直肠癌AJCC分期，淋巴结转移显著相关，预后分析显示，Transgelin和Transgelin2都不可作为判断结直肠癌预后的标记物，但可作为评判肿瘤进展能力的指标。研究还发现癌组织中Transgelin和Transgelin2的表达均比正常组织增强，其研究结果与Shields JM[11]、Kaplan-Alberquerque[12]等的研究结论不同，同时揭示，Transgelin和Transgelin2在结直肠癌中呈负相关，即二者在肿瘤发生发展中呈相互抑制作用，这在以前研究结果中鲜有报道。至于Transgelin和Transgelin2在不同恶性肿瘤中表达的不同以及功能的差异，可能因样本量、地区差异、实验试剂等多方面因素导致。
CD44v6和Transgelin2表达呈正相关，说明CD44v6和Transgelin2的协同表达在肿瘤发生、发展过程中起相互促进作用，此结果与Lee等[13]报道转胶蛋白可促进肿瘤干细胞的侵袭和迁移，肿瘤细胞中转胶蛋白的表达量高于非肿瘤细胞中的25倍相符，研究结果进一步证实转胶蛋白具有促进肿瘤干细胞侵袭和迁移的功能。转胶蛋白在结直肠癌中即促进肿瘤的发展又与CD44v6相互作用影响肿瘤恶性进展，但其作用机制尚不清楚。
综上所述，CD44v6可作为独立判断结直肠癌预后的生物标记物，而Transgelin和Transgelin2可作为评判肿瘤进展能力的参考指标。在后续实验中将进一步探讨三者在分子通路中的相关作用机制。
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基金项目：黑龙江省自然科学基金（No.2017074）.
论文作者:曹永1,郑慧哲2,金在顺3,吕强3（通讯作者）,高晓
论文发表刊物:《医药前沿》2018年9月第26期
论文发表时间:2018/10/16
标签：肿瘤论文; 结直肠癌论文; 淋巴结论文; 阳性论文; 组织学论文; 细胞论文; 标记论文; 《医药前沿》2018年9月第26期论文;