刘振声[1]1995年在《EB病毒致瘤机理与基因治疗的实验研究》文中研究指明EBV是一种肿瘤病毒。已经明确，EBV与Burkitt's淋巴瘤(BL)和未分化鼻咽癌(UNPC)的发生有密切关系。近年来的研究报道，在其他肿瘤中包括何杰金氏病，各种T—细胞淋巴瘤，以及唾液腺癌，胸腺癌，肺癌等也检测到EBV基因组。表明EBV能感染大量不同的细胞类型。虽然已经清楚EBV是人群中广泛存在的特殊病毒，但EBV究竟与哪些肿瘤有关系?EBV在这些肿瘤发生中起什么作用还不完全清楚。虽然许多分子生物学和免疫学的证据都表明EBV与鼻咽癌的发生有关，但目前国内外所有的文献并没有完全肯定EBV就是鼻咽癌的病因。迄今为止，尚未有EBV感染鼻咽上皮细胞致癌的直接实验证据。有鉴于此，我们进行了本课题的实验研究，内容包括以下四个方面。 一、人鼻咽癌细胞株中EBERs的原位杂交研究 采用地高辛标记的EBERs探针对人高分化和低分化鼻咽癌细胞株进行原位杂交，结果显示在高分化鼻咽癌CNE-1细胞株和低分化鼻咽癌CNE-2、CNE-3细胞株中均有EBERs存在，EBERs定位于细胞核中，且含量丰富，细胞阳性率达92％以上。由于EBERs在EBV感染后的早期转录，EBV感染后36小时即可在细胞中检测出来，且具有相对的稳定性，用原位杂交技术较容易检测到，可望作为鼻咽癌理想的早期诊断工具。 二、头颈肿瘤组织中EBERs的原位杂交检测 本研究采用地高辛标记的EBERs检测127例头颈肿瘤组织标本。结
李力力[2]2007年在《EB病毒致瘤蛋白LMP1调节p53功能活性的研究》文中认为鼻咽癌是中国南方高发的肿瘤，具有人种和人群的易感性、家族聚集现象、低分化和高转移为主的临床病理特征，并与EB病毒高度相关。其中EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌为切入点，我们多年的研究工作一直致力于LMP1介导的信号转导通路的研究。从建立LMP1可调控表达体系入手，以细胞内重要的信号转导分子NF-κB、AP-1、STAT作为枢纽，系统地研究了LMP1介导的信号转导通路异常以及由此产生的一系列生物学效应。p53是重要的抑瘤基因，作为细胞基因组稳定性的“守护神”(guardian)，p53蛋白对细胞的存活具有双面性(double faces)：p53通过作用于受损细胞的细胞周期限制点，延缓细胞周期行进，以使细胞在DNA复制和细胞分裂前修复DNA损伤保证细胞高质量存活；但当DNA损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞进入凋亡。在50％以上的人类肿瘤中存在有p53的突变，p53功能的丧失是人类肿瘤发生发展过程中常见的分子事件。与其他肿瘤细胞不同的是，在鼻咽癌中p53基因的突变频率很低(＜10％)，且出现了p53蛋白积聚的现象。临床样本的检测发现p53的过表达与鼻咽癌的发病密切相关，p53的表达在鼻咽癌组织和癌旁组织中显著的相关性提示p53的过表达出现在鼻咽癌癌变的早期发展阶段，且随着鼻咽癌病程的发展，p53的阳性表达率及表达强度均增加，与淋巴结的转移也具有一定的相关性。在构建的LMP1转基因小鼠中也发现p53的积聚现象。这些结果强烈提示我们：p53在鼻咽癌发生和发展过程中可能具有功能活性。我们前期的研究工作发现病毒致瘤蛋白LMP1通过调节p53表达的增加，导致细胞G_2／M期行进过程中重要的正性调节因子cdc2／cyclin B1复合物激酶活性下降，使其停滞于G_2／M期。这提示我们p53作为一个受EB病毒LMP1调控的关键转录因子在细胞周期调节中具有重要的功能。除此之外，已有研究表明LMP1通过p53上调抗凋亡基因A20，Bcl-2，Survivin和△NP63抑制凋亡的发生。故LMP1介导p53增加而不诱导肿瘤细胞发生凋亡。研究发现，LMP1通过调节p53从而稳定EB病毒的潜伏感染，促进上皮细胞的转化，有助于宿主和病毒之间平衡的维持。这为我们从一个新的视野来研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理学意义提供了新的启示。一直以来，关于EB病毒转化作用的研究都是在非鼻咽上皮来源和非上皮细胞来源的细胞中进行的，EB病毒感染和其编码的致瘤蛋白LMP1所参与的信号转导通路的研究局限于肿瘤细胞中完成，不能充分阐明癌变多阶段演进过程中的分子机理以及遗传因素和环境因素在癌变过程中的相互作用关系。在国家自然科学基金委与香港研究资助局联合科研资助基金(No．30418004)的资助下，我们引进了体外处于癌变早期阶段的实验模型平台：NP69、转染了空白载体pLNSX的NP69-pLNSX和转染了LMP1的NP69-LMP1细胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69细胞模型探讨肿瘤的发病机理是一个很好的切入点。我们首先对NP69细胞模型中p53的特征进行了研究，在该模型中证实有大量游离的、野生型的p53的存在，且LMP1不仅能促进p53的核积聚，同时还促进p53的转录活性和蛋白水平的表达。这为我们进一步利用该细胞模型研究致瘤蛋白LMP1调节p53功能活化的分子机制提供了重要的基础。p53翻译后修饰是其最主要的激活机制，其中一个重要的机制是磷酸化。近年来p53磷酸化对p53的功能活化取得了新的进展。已有将近18个p53的磷酸化位点得到阐明，它们分别位于p53功能结构域的N端、核心区和C末端，其中以N末端和C末端较为集中，不同的磷酸化位点参与p53转录活性、稳定性和抗凋亡功能的调节。但病毒致瘤蛋白LMP1对p53磷酸化的调节尚不清楚。从众多的p53磷酸化位点中，我们选取了N末端具有代表性的p53 Ser15、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作为研究对象，来阐明p53的功能活性。蛋白的磷酸化需要一种或多种蛋白激酶的作用。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是由一组级联活化的丝／苏氨酸蛋白激酶组成，主要包括ERK1／2、JNK和p38激酶通路，MAPK对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。已有研究表明在UV或DNA损伤等外界环境因素的刺激下，MAPK通路的活化能使p53多位点磷酸化。新近研究证实MAPK信号级联通路在LMP1介导的肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。因此从翻译后修饰-磷酸化的水平来研究在LMP1的作用下p53激活的分子机制将为我们深入了解LMP1致瘤的病理生理功能提供重要的启示。利用NP69细胞模型为材料，通过本研究发现，LMP1能显著促进p53 Ser 15、Ser 20、Ser 392和Thr 81位的磷酸化，进一步确定LMP1主要通过ERK1／2信号通路调节p53 Ser 15位的磷酸化；通过JNK信号通路调节p53 Ser 20位和Thr 81位的磷酸化；通过p38信号通路调节p53 Ser 392位和Ser 15位的磷酸化。其中LMP1通过JNK信号通路调节p53 Ser 20位的磷酸化程度最为显著，而p53 Ser 15位的磷酸化以ERK1／2信号通路调节为主，这提示LMP1所致的JNK信号通路的激活在p53磷酸化的调控中是一条重要的信号。进一步我们证明，LMP1所致的MAPK多条通路的异常激活导致p53多个位点的磷酸化，使p53转录活性增加，同时影响下游基因p21、MDM2蛋白水平的表达，促进反式激活能力的增强。这些科学发现为阐明LMP1通过调节p53的磷酸化参与p53的功能活化提供了新的实验证据。p53翻译后修饰的另一个重要机制是泛素化，细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化，而这种调控依赖于蛋白的磷酸化。蛋白的泛素化和磷酸化协同作用，相辅相成，精确调控细胞内的信号转导通路。p53的降解是泛素化依赖性的，主要受MDM2的介导。MDM2具有泛素连接酶(E3)的作用。我们的研究表明，EB病毒LMP1能减少MDM2与p53的结合能力，由此我们推测LMP1有可能通过泛素化的途径参与p53的功能活化。目前对泛素化的研究主要集中于Lys 48和Lys 63。与Lys 48结合的多泛素链(Ubk48)，作为一种信号，介导泛素修饰底物进入26S蛋白酶体，执行降解功能；与Lys 63结合的多泛素链(Ubk63)介导的泛素化在DNA损伤修复、炎症反应、胞吞作用和核糖体蛋白的合成中起重要作用，而不依赖于经典的蛋白酶体的途径。通过本研究，我们发现LMP1通过MAPK信号通路调节p53的磷酸化介导Ubk63泛素分子和p53的结合，尤以JNK通路介导的p53 Ser 20、Thr 81位的磷酸化对其泛素化的调节最为显著，这与p53的稳定性和功能活性的调节密切相关。而p53的磷酸化能抑制Ubk48与p53的结合，促进p53稳定性的调节。因此，泛素分子Ubk48和Ubk63可能通过与p53的结合，执行不同的功能，在LMP1所致的p53中发挥重要功能。综上所述，本研究证实了EB病毒致瘤病毒LMP1调节p53的组成性磷酸化谱，明确了LMP1调节p53磷酸化的关键激酶，即MAPK信号通路，提出了工作模式图，证明了p53是受LMP1调控的重要转录因子，建立了LMP1→MAPK→p53的信号转导通路，证明了磷酸化是调节p53转录活性、反式激活和稳定性的重要修饰方式，确定了LMP1通过MAPK信号通路调节p53磷酸化与泛素化之间的相关性。因此，本研究首次从翻译后修饰—磷酸化和泛素化的角度阐明了EB病毒重要的致瘤蛋白LMP1调节p53的功能活性，这为阐明p53在鼻咽癌癌变过程中的重要生物学作用提供了重要的实验依据，为全面理解LMP1的致瘤功能提供了新的理论依据和开拓了新的视野，最终为鼻咽癌和EB病毒相关其它肿瘤抗癌药物和基因治疗靶点的选择创造了条件。
王晓春[3]2007年在《靶向HPV16 E6的siRNA治疗宫颈癌的实验研究》文中研究表明目的本研究拟探讨应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达在宫颈癌的早期诊断中的临床应用价值；进一步应用RNA干扰技术为手段，以HPV编码的癌蛋白E6为靶标，探讨靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌细胞的生物学行为的影响，从而为HPV16-E6这一重要的致瘤蛋白的功能研究开辟了一个新的途径，为HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了新的理论和实验依据；为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法收集宫颈癌组织病理切片应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达；构建靶向HPV16-E6的siRNA表达载体，应用体外转染试剂转染HPV16-E6阳性的宫颈癌CaSki细胞，分别应用western blotting和RT-PCR检测CaSki细胞中E6蛋白质和mRNA的表达；应用MTT分析检测细胞的增殖活性，应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。进一步应用western blotting、细胞色素c检测以及caspase活性分析等检测细胞凋亡相关分子的表达和活性，研究靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的分子机制。进一步建立宫颈癌裸鼠移植瘤模型，应用靶向HPV16-E6的siRNA进行瘤体内多点注射，观察靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌裸鼠移植瘤的影响。结果宫颈癌组织病理切片免疫组化检测结果显示：在慢性炎症HPV16-E6阳性率为8％，CINs中HPV16-E6阳性率为22.7％，宫颈癌组织中HPV16-E6阳性率为55.9％。在宫颈癌中，Ⅰ期HPV16-E6阳性率为44.4％，Ⅱ期HPV16-E6阳性率为55.6％，Ⅲ期HPV16-E6阳性率为80％。western blotting和RT-PCR检测结果显示瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，CaSki细胞中E6蛋白质和mRNA的表达下调；MTT分析结果表明瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞的增殖活性被抑制；流式细胞术检测结果表明，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞周期被阻滞于G1／S期，同时细胞凋亡增加；进一步应用western blotting检测抑凋亡蛋白Bc1-2的表达显示，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，Bc1-2的表达下调；细胞色素c释放实验结果显示，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞色素c自线粒体中释放到细胞浆中，从而诱导细胞凋亡；Caspase活性分析结果亦表明，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞内Caspase3、Caspase8、Caspase9均被激活。在体内实验亦表明，靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。结论HPV16-E6的表达与宫颈癌的发生发展密切相关，随着病情恶化，HPV16-E6的阳性率逐渐增加。应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达有助于宫颈癌的早期诊断。在宫颈癌细胞CaSki中，靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞于G_0／G_1期，并诱导细胞凋亡。靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的可能机制为：靶向HPV16-E6的siRNA抑制HPV16-E6的表达后，使凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调；并改变线粒体膜的通透性，诱导细胞色素C的释放，介导细胞凋亡。并进一步证明抑制HPV16-E6可活化Caspase-3，-8和-9，并且Caspase-3和-9活性升高比Caspase-8更明显。表明在宫颈癌细胞CaSki中，靶向HPV16-E6的siRNA不仅能够介导细胞凋亡的线粒体通路的活化，而且能够活化细胞凋亡的死亡受体通路，但以线粒体通路的活化为主。在宫颈癌裸鼠移植瘤模型中，靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，我们认为HPV编码的癌蛋白E6可能为靶向基因治疗的潜在关键分子靶标；靶向HPV16-E6的siRNA能够抑制宫颈癌细胞增殖诱导细胞凋亡，从而为HPV16-E6这一重要的致瘤蛋白的功能研究开辟了一个新的途径，为HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了新的实验依据；为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新方法。
徐娟[4]2010年在《EB病毒LMP1通过转录因子EGFR调节酪氨酰蛋白硫酸转移酶TPST-1介导趋化因子受体CXCR4活性的分子机制》文中指出鼻咽癌是以高转移性为突出特点的恶性肿瘤,大部分患者由于早期发生转移而预后不良。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)编码的主要致瘤蛋白即潜伏膜蛋白1 (latent membrane protein, LMP1)与鼻咽癌的发生和转移密切相关。趋化因子影响肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移,趋化因子及其受体参与肿瘤转移的机制尚未完全阐明。趋化因子SDF-1 (CXCL12)受体CXCR4表达和活化可促进肿瘤细胞向高表达SDF-1的部位(如骨和淋巴结)转移,与多种肿瘤的生长和转移相关。最近几年,酪氨酸的硫酸化(tyrosine sulfation)作为一种重要的翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的方式,因其对趋化因子受体活性调节而受到重视。酪氨酸的硫酸化的主要作用是促进分泌型蛋白的分泌或膜蛋白与其它蛋白特别是配体之间的相互作用。趋化因子受体CXCR4第21位的酪氨酸是其主要的硫酸化位点。体内负责催化酪氨酸硫酸化的酶为酪氨酰蛋白硫酸转移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST),编码该酶两种亚基的基因即TPST-1和TPST-2,都具有高度保守的硫酸转移酶区域,定位于高尔基体中的TPST-1可对酪氨酸进行硫酸化,参与酪氨酸的硫酸化循环。我们前期工作发现,LMP1在鼻咽癌细胞中通过NF-κB信号通路上调EGFR的表达并使其发生磷酸化；作为一个新型的转录因子,磷酸化的EGFR转位入核可反式活化与细胞增殖有关的基因如cyclinD1和cyclinE。同时,我们通过生物信息学发现TPST-1基因(GenBank AF038009)5'UTR内存在一个可能的EGFR结合位点,即TGTTT(位于-28—-24位之间)。这一发现使我们有理由推测EGFR可能通过该酶催化CXCR4硫酸化从而影响其与配体的结合。因此,我们提出LMP1可能通过EGFR调节CXCR4的活性促进鼻咽癌细胞的转移。1. CXCR4硫酸化促进鼻咽癌细胞的转移酪氨酸的硫酸化作为一种重要的翻译后修饰的方式,其在趋化因子受体活性调节中发挥重要的作用。利用高转移的5-8F和不转移的6-10B鼻咽癌细胞为基本模型,研究发现高转移的5-8F细胞呈高硫酸化状态。提示,硫酸化可能与细胞的转移能力有关。进一步利用硫酸化特异性抑制剂氯酸钠(sodium chlorate)抑制高转移的5-8F细胞蛋白硫酸化活性,通过趋化实验(chemotaxis)和Matrigel侵袭实验发现抑制5-8F细胞硫酸化可以抑制细胞的趋化活性和侵袭转移能力。同时利用不转移鼻咽癌6-10B细胞,转染野生型WT-CXCR4和突变型MUT-CXCR4表达质粒后,进行趋化实验和Matrigel侵袭实验,发现转染WT-CXCR4表达质粒后细胞的趋化活性和侵袭转移能力明显增强,而转染MUT-CXCR4表达质粒后并没影响细胞的趋化活性和侵袭转移能力。这些结果提示,细胞蛋白的硫酸化,特别是CXCR4的硫酸化与细胞的转移相关,而CXCR4第21位酪氨酸硫酸化在促进鼻咽癌细胞转移的过程中起到非常重要的作用。我们检测高转移5-8F细胞和不转移6-10B细胞的TPST-1的表达发现,高转移5-8F细胞TPST-1的mRNA水平和蛋白水平均高于6-10B细胞。进一步抑制5-8F的TPST-1可以抑制其CXCR4的硫酸化水平,而在6-10B细胞中转染TPST-1表达质粒可以上调CXCR4的硫酸化水平。近年来,在人们发现细胞表面的膜受体EGFR和FGFR能够移位入核之后,新近有研究发现细胞膜表面受体CXCR4同样能够入核。我们首先检测高转移和不转移的5-8F细胞和6-10B细胞的CXCR4是否存在核定位,采用亚细胞组分结合Western Blot及激光共聚焦技术,从定性和定量水平均发现5-8F细胞核内存在CXCR4蛋白的表达。进一步利用特异性硫酸化抑制剂和TPST-1 siRNA处理5-8F细胞后,SDF-1α30nm刺激细胞30min,发现其细胞核内的CXCR4蛋白明显减少。提示,CXCR4的核移位与CXCR4的硫酸化密切相关。2.EB病毒LMP1通过调节CXCR4功能活性促进鼻咽癌细胞转移上一个部分我们在5-8F和6-10B细胞中研究发现CXCR4的硫酸化与鼻咽癌细胞的转移密切相关。我们实验室前期研究发现LMP1在高转移5-8F细胞的表达高于不转移6-10B细胞,结合LMP1在鼻咽癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用,提示我们：在鼻咽癌细胞中,LMP1可能是通过对CXCR4硫酸化的调控,进而影响鼻咽癌的转移。首先应用流式细胞术进一步确证高硫酸化的5-8F细胞高表达LMP1后,采用可调控LMP1表达的细胞系,本研究发现在鼻咽癌细胞系中LMP1可诱导CXCR4的表达,并呈剂量诱导效应。进一步采用免疫共沉淀将CXCR4沉淀分离后,Western Blot检测酪氨酸硫酸化水平即CXCR4硫酸化变化。结果发现,随DOX剂量的增加,CXCR4的硫酸化也随之增加。提示,LMP1能够上调CXCR4的硫酸化。同样我们应用Tet-on LMP1 HNE2细胞,用不同DOX剂量诱导24h后,在不同浓度的SDF-1α的作用下,进行趋化实验,结果发现LMP1能够上调CXCR4的趋化活性,说明LMP1通过上调CXCR4硫酸化进而影响其功能活性。业已证实LMP1调控CXCR4的硫酸化及其功能活性,那么我们将探讨LMP1是否诱导CXCR4核移位。采用亚细胞组分结合Western Blot及激光共聚焦技术,我们从定性和定量水平均发现Tet-on LMP1HNE2细胞核内部分存在CXCR4的蛋白表达,且随LMP1表达的增加而增加。进一步我们在Tet-on LMP1 HNE2细胞中转染WT-CXCR4和MUT-CXCR4表达质粒24h后,分别在DOX (0,6ug/ml)剂量诱导下,采用亚细胞组分结合激光共聚焦技术,我们从定性水平发现LMP1促进了WT-CXCR4组细胞CXCR4蛋白的核积聚。这些结果表明LMP1通过调控CXCR4的硫酸化进而影响CXCR4的核移位。最后利用HNE2-PSG5和HNE2-LMP1细胞,分别转染WT-CXCR4和MUT-CXCR4表达质粒24h后,Matrigel侵袭实验发现LMP1促进转染WT-CXCR4质粒组细胞的侵袭转移能力,并没有影响MUT-CXCR4质粒组细胞侵袭转移能力。进一步说明LMP1通过诱导CXCR4第21位酪氨酸硫酸化功能活性进而促进鼻咽癌细胞的转移。3.EB病毒LMP1通过EGFR介导CXCR4硫酸化我们的前期工作证实LMP1上调转录因子EGFR的表达,而且我们通过基因信息学发现酪氨酰蛋白硫酸转移酶TPST-1的启动子区存在EGFR的结合位点。因此我们推测LMP1有可能是通过EGFR介导TPST-1上调CXCR4的硫酸化。采用鼻咽癌Tet-on LMP1 HNE2细胞,应用Real-time-PCR和Western Blot技术发现LMP1上调TPST-1的mRNA和蛋白水平,EGFR siRNA处理Tet-on LMP1 HNE2细胞24h阻断EGFR表达后,TPST-1表达下调,初步说明LMP1诱导的TPST-1是EGFR所依赖的。采用ChIP发现,LMP1可以促进EGFR与TPST-1的结合,采用报告基因分析发现,LMP1增加TPST-1启动子活性,而突变EGFR与TPST-1的结合位点,我们发现LMP1增加的TPST-1启动子活性显著下调。进一步说明LMP1诱导的TPST-1和CXCR4的硫酸化是EGFR所依赖的。小结：我们以鼻咽癌细胞系为基本实验模型,从比较具有不同转移潜能的鼻咽癌细胞系之间CXCR4硫酸化状态的差异入手,进行LMP1对CXCR4硫酸化及亚细胞定位和功能的研究,本研究主要采用阻断策略结合Western Blotting、趋化实验、侵袭实验、ChIP、体外定点突变等分子生物学实验方法,从蛋白硫酸化修饰的角度来阐明LMP1调节CXCR4的分子机制,取得如下重要的创新性发现：1.首次发现CXCR4的硫酸化可以促进鼻咽癌细胞的转移。抑制高转移5-8F细胞的硫酸化可以抑制其CXCR4的趋化活性和细胞的侵袭转移能力,且转染野生型的CXCR4表达质粒可以促进不转移的6-10B细胞CXCR4的趋化活性和细胞侵袭转移能力。高转移鼻咽癌细胞高表达硫酸化转移酶TPST-1,且TPST-1siRNA可以有效的阻断CXCR4的硫酸化。首次发现鼻咽癌5-8F细胞核内存在CXCR4蛋白的表达。利用特异性硫酸化抑制剂和TPST-1siRNA抑制CXCR4的硫酸化可有效阻断5-8F细胞CXCR4蛋白核移位。2.首次发现EB病毒LMP1上调CXCR4的硫酸化水平、功能活性和促进CXCR4蛋白的核移位,并呈一定剂量效应。且发现LMP1调控CXCR4核移位是通过其上调CXCR4的硫酸化实现的。同时发现LMP1上调CXCR4的硫酸化与鼻咽癌细胞转移相关。3.首次发现LMP1可以上调TPST-1的mRNA和蛋白表达水平,并呈剂量依赖效应。EGFR siRNA可以抑制LMP1上调的TPST-1表达。在LMP1调控下,转录因子EGFR与TPST-1的启动子结合增强。并发现LMP1增加TPST-1启动子活性,突变EGFR在TPST-1启动子上的结合位点可以下调LMP1调控的TPST-1的启动子活性。本论文以EBV的致瘤蛋白LMP1通过转录因子EGFR对酪氨酸硫酸化转移酶TPST-1的调控为切入点,从CXCR4硫酸化翻译后修饰的角度来阐明LMP1-EGFR-TPST-1-CXCR4信号转导通路在鼻咽癌转移中的分子机制及其生物学意义。通过本研究,将EB病毒与趋化因子及其受体通过信号转导联系起来,提出了新的工作模式。为EB病毒致瘤分子机理研究开拓一个新的视野,为靶向LMP1和CXCR4抗信号转导治疗肿瘤提供了新的实验依据,这将有助于从分子水平揭示鼻咽癌转移发生机制,为鼻咽癌的防治提供新的理论依据。
刘涛[5]2005年在《鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1和热休克蛋白90β的实验研究》文中指出本研究分两部分,现分述如下: 1.热休克蛋白90β(HSP90β)在鼻咽癌组织中的表达及其意义 目的 热休克蛋白是一种肿瘤相关抗原,在肿瘤组织中的表达水平一般较高,其中HSP70、HSP90和gp96与肿瘤的关系最为密切。研究发现,HSP90β与肿瘤的分化程度有关,鉴于鼻咽癌98%为低分化鳞癌,分化差,恶性程度高,考虑HSP90β在鼻咽癌组织中应高表达,但有关鼻咽癌组织中HSP90β的表达情况经查阅文献未见报道。所以本部分实验拟用免疫组化检测HSP90β在人鼻咽癌组织中的表达情况,分析其在鼻咽癌组织分级和预后中的意义,为鼻咽癌的预后判断寻找较为可靠的生物学指标。方法 应用免疫组化SP法检测50例鼻咽癌组织中HSP90β的表达情况,经X~2检验对资料进行处理,分析其表达与鼻咽癌预后的关系。结果 鼻咽癌组织中HSP90β高表达,阳性率明显高于鼻咽部炎性组织;随着鼻咽癌分化程度的降低,HSP90β的阳性表达率升高。结论 HSP90β高表达可能与鼻咽癌的发生、发展以及预后有关;HSP90β的测定有可能作为估计鼻咽癌患者预后的指标之一。
黄国平[6]2007年在《转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞的构建及其细胞特征分析》文中研究说明端粒酶是一种由RNA和蛋白质两种组份构成的核糖核蛋白复合体,其中RNA组份是端粒酶复制时用的模板,蛋白质组分主要是端粒酶催化亚单位,又叫做端粒酶逆转录酶(hTERT),它的功能是利用RNA模板复制端粒的重复片段,延长端粒。端粒的长度和细胞分裂时端粒损失的速度决定了不表达端粒酶细胞的衰老和寿命,而在表达端粒酶的细胞中端粒酶能补充端粒长度,使细胞的生命延长甚至永生。骨髓间充质干细胞(hMSCs)在细胞移植,基因治疗,组织工程方面有重要作用,但是骨髓间充质干细胞体外增殖能力弱,传代能力差。延长骨髓间充质干细胞的生命周期能弥补骨髓间充质干细胞来源的不足,具有重要的实际意义。因此,本研究制备了表达hTERT基因的重组逆转录病毒,在分离培养骨髓间充质干细胞的基础上,将hTERT基因导入骨髓间充质干细胞中,并传代290代以上。在传代过程中,对转导hTERT基因的细胞进行了功能和特性的分析。目的:通过重组逆转录病毒技术体外转导hTERT基因,建立过表达端粒酶的hMSCs,经传代培养观察过表达端粒酶的hMSCs分裂和增殖能力以及细胞生命周期变化。阐明使用hTERT作为目的基因能否延长hMSCs的生命周期,并研究过表达端粒酶hMSCs的表面抗原,细胞核型特征与致瘤性,向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞方向分化的潜力以及细胞蛋白组学特征。为将来构建适用于临床的、有较长生命周期和有一定分化能力的骨髓间充质干细胞打下理论基础。方法和结果:使用重组病毒技术构建表达hTERT的重组逆转录病毒,用该病毒感染骨髓间充质干细胞,并使用TRAP-PCR方法证实我们重建了细胞的端粒酶活性。我们将转导了hTERT的细胞接种于免疫缺陷小鼠皮下,未见肿瘤形成。转导细胞的软琼脂细胞克隆形成实验阴性,表明转导hTERT的骨髓间充质干细胞未出现恶性转化,没有成瘤作用。另外,转导了hTERT的骨髓间充质干细胞在相应诱导液的作用下,能够向成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞方向分化,证实了细胞的多向分化潜能。采用双向凝胶电泳加基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱方法(2DE-MALDI-TOF-MS)分析转导hTERT与未转导hTERT的hMSCs的蛋白组学差异,我们鉴定了100种蛋白点,发现有20种蛋白质有差异表达。结论:使用表达hTERT的重组逆转录病毒感染的骨髓间充质干细胞能够再建细胞的端粒酶活性,克服细胞的复制衰老,延伸了细胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接种实验和细胞克隆形成实验表明转导hTERT的骨髓间充质干细胞没有成瘤作用。在相应诱导液的作用下,转导hTERT的骨髓间充质干细胞能够向成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞方向分化。差异蛋白组学分析表明,在过表达端粒酶hMSCs中有11种蛋白表达明显升高,有9种蛋白表达明显下降。本文研究结果提示hTERT具有抗复制衰老、延伸细胞生命周期的生物学作用,转导了hTERT的骨髓间充质干细胞具有向多种细胞分化的潜能,在组织工程,细胞工程,和基因工程方面有很大的应用前景。我们的结果为研究hTERT基因延长细胞生命周期的分子机制提供了重要的线索。
冯晓文[7]2002年在《EB病毒在各类淋巴瘤中的检测及其发病机理研究》文中认为EB病毒为一种嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病毒，与宿主细胞关系的特点是潜伏感染。已知EB病毒在体外转化B淋巴细胞时至少表达10种潜伏基因。其中，LMP1是由病毒编码的与潜伏感染有关的主要蛋白之一，是目前唯一被证实了的有促使细胞转化甚至恶变的癌蛋白，可能在EB病毒致瘤机制中发挥重要作用。LMP1的表达可诱导许多EB病毒感染相关的改变，促幼稚的B细胞成熟并活化原始B细胞，通过诱导抗凋亡蛋白如Bcl-2、Mcl-1、A20的形成从而保护B细胞免于凋亡。LMP1最受关注的作用是诱导抗凋亡。然而最近的研究认为LMP1在介导细胞凋亡活动中具有介导细胞凋亡和抑制凋亡基因表达的双重生物学效应，同时介导涉及到细胞增殖的细胞周期调控和细胞凋亡调控等多种生物学效应基因的表达，从而参与细胞的癌变。EB病毒在癌症发生中的作用和机理报道较多的是鼻咽癌。从中国广东和台湾地区的鼻咽癌中分离的LMP1与B95.8原株相比有几处明确的突变，这些变异的LMP1(del LMP1，以Cao-LMP1为典型)在啮齿类纤维母细胞和上皮细胞中表现出较强的致瘤性。然而，实验和临床研究也表明EB病毒与地方性伯基特淋巴瘤、HL某些亚型、外周T-NHL等疾病相关。在我国，对于EB病毒相关淋巴瘤的研究的结论众说不一，尚不统一，同时对于淋巴瘤病变中的delLMP1的存在与否及其致病性尚未见报导。现有文献表明，对淋巴瘤病变中EB病毒的进一步研究将有助于揭示HL、T-NHL的发生、发展机制和有利于其诊断、治疗和预后的判断。从EB病毒和鼻咽癌发病关系的研究中提示，对delLMP1的研究可能有助于阐明LMP1的信号传导途径及评估LMP1序列变异对EB病毒相关肿瘤的发病机制的作用。 浙江大学硕士学位论文 本研究应用免疫组化、原位杂交、PCR、SSLP等多种方法从多角度、多水平的对EB 病毒进行综合研究，利用高敏感的免疫组织化学方法和原位杂交明确定位EB病毒感染的 细胞及＊B病毒感染模式：进而进一步研究EB病毒相关及不相关淋巳瘤的B。卜2、 CasPase－3、PCNA、P53蛋白的表达状态及EB病毒感染产物LMPI的表达情况，同时检 测本地区各类淋巴瘤中LMP缺失的状态，以期探讨EB病毒及其产物LMPI在各类HL 和NHL发病、发展中的作用及其可能的调控机制。鉴于因方法学上差异的原因所造成的 目前国内外在探讨＊B病毒与各类淋巴瘤相关性之间报道的不一致，在本研究中利用不同 水平的检测方法，对各类淋巳瘤样本中EB病毒的检测作一系统的研究，以同时寻求一套 敏感、可靠的EB病毒检测和验证手段c 材料与方法 1材料：收集1992—2002年我医学院附属医院及省内其他医院127例淋巴瘤标本，经中 性福尔马林固定、石蜡包埋、常规切片、HE染色和免疫组化SP法标记淋巴细胞亚群， 根据肿瘤的免疫表型，划分为B和T细胞性NHL及HLn按照1985年成都会议修订的 NHL分类方案及文献，将105例NHL分为低、中、高度恶性三组；将34例胃肠道粘膜 相关淋巴瘤按Isaacson提出的标准分为低和高度恶性两组，22例HL按经典分类法（…e， 1966）分为四型。 2方法：分别采用免疫组化SP法检测LMPI、Caspase－3、PCNA、P53蛋白，CSA法检 测L＊PI、k卜Z蛋白的表达：E＊Em／三原位杂交检测＊B病毒的感染模式，操作按试剂 盒说明书进行。实验结果进一步用PCR、SSLP方法检测和验证病例中的LMPI基因存在 及其缺失。上述实验均设阳性（RNi细胞株及其DNA）和阴性对照。免疫组化结果进行半 定量评价，根据Caspase－3、Bcl－2、PCNA阳性肿瘤细胞所占比例分为四级：小于5％为（一）， 5～25％为（十），26－50％为（＋十），大于 50％为（十十十）。根据 P53阳性肿瘤细胞所占比例 小于10％定为阴性，大于10％为阳性。原位杂交结果簇集型、弥漫型阳性模式为EB病 毒相关淋巴瘤。实验结果用SPSSrpC”统计软件进行统计学处理，组间比较采用卡方检验 和 Kruskal－Rallls检验。 4 浙江大学硕士学位论文 结 果 l．免疫组化LMPI（CSA法）阳性率：B．NHLZ．5O（2／79），T－NHL27．60（8／29），HL 36％（8口2）：sP法阳性率：＊N＊L13％门／D），T．＊HL丘9％（Z09），＊＊27％（6o2）： CSA法阳性率高于SP法。 2．EBERI／2原位杂交阳性率：T．NHL 31％（9／29），其中结内 417％（5／12），胃肠道 273％ 门／if）。B－NHLZ％（l／44），胃肠道MALTbma中未检测到阳性信号。HL36％（8／22）， 其中结节硬化型10％（3／10）、混合细?
张哲[8]2002年在《鼻咽癌患者EB病毒潜伏膜蛋白1特异性细胞免疫研究》文中研究说明目的 调查HLA-A2基因在广西鼻咽癌患者的分布，以了解HLA-A2与鼻咽癌发病的关联；讨论鼻咽癌患者针对EB病毒潜伏膜蛋白1的特异性细胞免疫能力。方法 用PCR-SSP的方法检测患者的HLA型，调查HLA-A2型在广西鼻咽癌患者中的分布情况，并筛选出HLA-A2型的个体，以合成的来源于EB病毒潜伏膜蛋白1的肽段YLLE和YLQQ作为刺激物，用酶联免疫斑点法检测患者外周血中针对这两个肽段的细胞毒T淋巴细胞的数量。 结果 鼻咽癌病人组HLA-A2基因频率比健康对照组高，但差别无统计学意义；针对LMP1这两个肽段的特异性细胞毒T淋巴细胞在鼻咽癌患者和正常人的PBMC中仅占很小的比例；鼻咽癌患者LMP1肽段特异性CTL数量要少于正常人。 结论 HLA-A2与广西鼻咽癌的发病可能不存在关联；鼻咽癌患者针对EB病毒LMP1的特异性细胞免疫能力低于正常人。
佚名[9]2006年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2006年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中进行了进一步梳理
黄燕萍[10]2001年在《EB病毒与T细胞淋巴瘤关系的研究》文中研究说明恶性淋巴瘤是常见的恶性肿瘤，我国恶性淋巴瘤的发病特点是T细胞淋巴瘤的发生率较高，占非何杰金淋巴瘤的34％，高于欧美国家，与日本相近。研究T细胞淋巴瘤的病因及发病机制，对于预防和控制这部分恶性肿瘤有着极为重要的意义。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种肿瘤病毒。1988年Jones等人首次报道长期慢性EB病毒感染的外周T细胞淋巴瘤患者，其肿瘤性T细胞中可检测到EB病毒的基因组。目前报道EB病毒在T细胞淋巴瘤中的检出率约为58％，而在血管中心性T细胞淋巴瘤中的检出率可高达92％。本课题研究了EB病毒与T细胞淋巴瘤的关系，内容包括以下三个方面： 一．T细胞淋巴瘤中EB病毒感染的分子流行病学研究 通过检测不同类型T细胞淋巴瘤中EB病毒基因编码产物EBERs的表达，探讨EB病毒与T细胞淋巴瘤的关系。应用原位杂交的方法，对60例经组织学和免疫组织化学确定的T细胞淋巴瘤中，EB病毒编码的小RNA EBERs进行检测。按1994年淋巴瘤REAL分类方案，对此60例T细胞淋巴瘤进行分类，分析与EB病毒相关的T细胞淋巴瘤的临床病理特征。结果发现60例T细胞淋巴瘤中EBERs的检出率为
参考文献：
[1]. EB病毒致瘤机理与基因治疗的实验研究[D]. 刘振声. 第四军医大学. 1995
[2]. EB病毒致瘤蛋白LMP1调节p53功能活性的研究[D]. 李力力. 中南大学. 2007
[3]. 靶向HPV16 E6的siRNA治疗宫颈癌的实验研究[D]. 王晓春. 中南大学. 2007
[4]. EB病毒LMP1通过转录因子EGFR调节酪氨酰蛋白硫酸转移酶TPST-1介导趋化因子受体CXCR4活性的分子机制[D]. 徐娟. 中南大学. 2010
[5]. 鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1和热休克蛋白90β的实验研究[D]. 刘涛. 四川大学. 2005
[6]. 转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞的构建及其细胞特征分析[D]. 黄国平. 浙江大学. 2007
[7]. EB病毒在各类淋巴瘤中的检测及其发病机理研究[D]. 冯晓文. 浙江大学. 2002
[8]. 鼻咽癌患者EB病毒潜伏膜蛋白1特异性细胞免疫研究[D]. 张哲. 广西医科大学. 2002
[9]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2006年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2006
[10]. EB病毒与T细胞淋巴瘤关系的研究[D]. 黄燕萍. 中国协和医科大学. 2001