罗海玲[1]2001年在《血管内皮生长因子对体外生产牛胚胎体外发育的影响》文中研究表明本研究通过11个系列试验，采用人重组VEGF165，研究了血管内皮生长因子（VEGF）对体外生产牛胚胎体外发育的影响。 一、为了确定VEGF是否对体外成熟、体外受精牛胚胎的体外发育能力有促进作用，试验1和2分别选用由卵丘细胞包围的黑白花牛（Holstein）和日本和牛（Japanese Black）的卵母细胞（COC），在改善后的合成输卵管液体（m-SOF）中体外成熟（IVM）22小时（h）、BO液中受精（IVF）6h、m-SOF液中培养42h（IVC1）。各培养过程中每100μl液滴内置入20±2个卵母细胞或受精卵，每种培养液中添加0（对照）、0.1、1.0和10ng/ml四种不同浓度的VEGF进行处理。体外受精后（Pi）48h检测其卵裂率和初期发育率。结果表明，在IVM、IVF、IVC1过程中添加1或10ng/ml VEGF能显着提高胚胎的卵裂率和发育至4-8细胞期的发育率（P＜0.05）。添加0（对照）、0.1、1.0和10ng/ml四种不同浓度的VEGF，黑白花牛和日本和牛的卵裂率分别为41.5、44.7、61.8和55.6％与47.3、51.4、72.6、和68.5％，胚胎发育至4-8细胞期的发育率分别为24.1、23.4、41.1和36.1％与32.0、36.4、59.7和52.9％。 二、为了选择最适宜的VEGF添加浓度，根据试验1和2的结果，在IVM、IVF、IVC1过程中，设计1、2、5ng/ml VEGF的添加浓度。结果表明，1、2和5ng/ml VEGF的添加浓度均可显着提高卵裂率及胚胎发育至4-8细胞期的发育率，分别为49.1、48.5和48.7％与42.7、42.7和45.1％。并且各处理组之间无显着差异。为了得到更多的4-8细胞期胚胎，因而5ng/ml VEGF的 添加浓度为最适宜的添加浓度，并选择此浓度进行进一步研究。 叁、为了探明添加VEGF对牛卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外发 育的影响，完成了6个不同的试验。． 1、为了检测VEGF对牛卵母细胞体外成熟性的影响，进行了以下3个试． 验，即： 试验4、将Cte分别在0（对照）和5 ＂g／ml VEGF的mSOF液中培养22 h，卵母细胞的成熟率从对照的78．t显着提高到90．5％（P＜0．05）。 试验5、在IW和IVF过程中Cpe分别培养在添加或不添加VEGF的培养 液中。结果表明，当VEGF单独添加于IW培养液或IWh与IVF培养时均添 加VEGP，可显着提高卵母细胞的受精率，分别从对照的63．4％提高到79．8％ 和 82．8（P＜0．05）。 试验6、Cot体外成熟时同试验4一样用VEGP添加或不添加处理，体外 受精与体外培养（至 162 Pi）时不添加 yEGF，其胚胎卵裂率、胚胎发育至 4－8细胞期的发育率和囊胚率显着提高（P＜0．05），处理组与对照组分别为 82．h、70．3％和45．1％与67．3＄、52．5＄和33．3＄。 以上结果揭示，VEGF对卵母细胞的体外成熟具有良好的促进作用。 2、为了检测VEGF对牛胚胎体外发育的影响，进行了3个试验，即： 试验 7、当 COC在体外成熟与体外受精阶段时不添加 VEGF，体外培养0 （IVCI）时在 m－SOF中添加 5 ng／ml VEGF，其卵裂率和胚胎发育至 4－8细胞。期的发育率显着增加（w0．05），VEGr组与对照组分别为70．3％和62．3％与 49．W和38．4＄；而当IVM和IVCI均添加VEGF时则可得到最高的卵裂率 （75．9％）和胚胎发育至 4－8细胞期的发育率（67．8％）。 8 试验8、为探明VEGF对胚胎后期发育的影响，选择4－8细胞期胚胎培养 在含或不含有 VEGF的 mSOF中至第 8天m抢＊，对照组与 VEGF组第 6、7 和 8天时的囊胚率分别为 31．6％、47．8％、57．h和 38．9％、47．9％、52．2％ （＞0．05）。）试验 9、在 48 Pi时，将 IW、IVF和 IVCI过程中添加 VEGF（处理组） 与不添加 VEGF（对照组）的两个组中的 4－8细胞期胚胎分别在无 VEGF的 m－SOF口 液中培养，于第6、7和8天检测其囊胚率，处理组与对照组无显着差异 （P＞0．05），分别为48．6％、65．po、78．8％和48．6％、61．1％、73．6％。 以上结果说明，！VM阶段添加 VEGF可以显着提高卵母细胞的成熟率、受 精率、胚胎的卵裂率、胚胎发育至4干细胞期的发育率及囊胚率；IVCI阶段 添加VEGF也可显着提高胚胎的卵裂率、胚胎发育至4－8细胞期的发育率及囊 胚率；IVCZ阶段添加 VEGF对 4士细胞期胚胎发育至囊胚的发育率提高无显 着效果。因而，可以认为IV’M及IVCI阶段添加VEGF促进胚胎囊胚率的提高 是由于此阶段添加 VEGF显着增加了 4－8细胞期胚胎的数量而致。 四、为了对VEGF促进牛卵母细胞发育
曹忻[2]2008年在《血管内皮生长因子促进绵羊卵母细胞体外成熟机理研究》文中认为本研究通过10个系列试验,在绵羊卵母细胞体外培养液中添加血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF),研究VEGF对绵羊卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响,并通过绵羊卵母细胞成熟过程中细胞的形态学结构、细胞骨架、胞内丝裂原活化蛋白激酶(P44/p42 Mitogen-activated Protein Kinases,P44/p42 MAP kinases)、蛋白激酶C (Protein Kinase C,PKC)和酪氨酸蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinases,PTK)活性的变化,以及VEGF及其两受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞成熟过程中表达的研究,揭示VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟的作用和机理。一、血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响试验1:不同浓度VEGF对绵羊胚胎体外发育的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+胎牛血清)、HSOF受精液及SOF胚胎发育液中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml、试验组Ⅰ5 ng/ml和试验组Ⅱ10 ng/ml),研究其对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。结果显示:对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ卵母细胞成熟率分别是80.68%、86.09%和85.22%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显着的提高了卵母细胞成熟率(P<0.01),但试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异不显着。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的卵裂率分别是75.18%和73.48%,高于对照组的69.38%,但差异不显着。试验组Ⅰ的桑葚胚率和囊胚率是45.45%和30.06%,极显着的高于对照组37.61%和23.65%(P<0.01);同时试验组Ⅱ的桑葚胚率和囊胚率是40.25%和27.80%,低于试验组Ⅰ,高于对照组,但差异不显着。结果表明:体外培养液中添加5ng/mlVEGF为适宜添加量,VEGF明显提高了受精卵发育到桑葚胚和囊胚的能力。试验2:BSA成熟培养液中添加VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响本试验采用在成分相对明确的BSA成熟培养液系统中,添加不同浓度VEGF,检测对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用。成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mlVEGF对照组、5 ng/ml、10 ng/ml的VEGF试验组卵母细胞成熟培养后,经体外受精和体外培养。结果显示:试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的成熟率分别是83.98%和80.23%,对照组是75.76%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显着的提高了绵羊卵母细胞的成熟率(P<0.01),并且试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异显着(P<0.05)。试验组Ⅰ的卵裂率是79.39%,高于试验组Ⅱ和对照组的72.24%和75.85%,差异不显着。试验组Ⅰ桑葚胚率是45.03%,明显高于试验组Ⅱ和对照组38.85%和38.94%的桑葚胚率,差异不显着。试验组Ⅰ囊胚率是23.54%,极显着高于对照组的18.09%(P<0.01);试验组Ⅱ囊胚率是21.05%,高于对照组Ⅰ的18.09%,差异不显着。结果表明:BSA成熟培养液中添加5ng/ml VEGF为适宜添加量,对绵羊卵母细胞体外胚胎的发育有积极的促进作用。试验3:VEGF添加对绵羊卵母细胞体外受精多精入卵的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)成熟培养,经体外受精培养后,地衣红染色结果显示:试验组和对照组的受精率分别是83.86%和75.75%,多精入卵率分别是7.68%和12.64%,未受精率是8.47%和11.60%。试验组受精率极显着高于对照组(P<0.01);试验组多精入卵率极显着低于对照组(P<0.01);试验组的未受精率显着低于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF明显降低了多精入卵率,有效的抑制了绵羊卵母细胞受精过程中的多精入卵现象的发生。二、VEGF促进绵羊卵母细胞体外成熟的机理研究1、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核成熟和细胞质成熟的影响试验4:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再采用地衣红染色技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中染色体形态的影响。结果显示:试验组拥有正常染色体成熟卵母细胞的成熟率是87.42%,高于对照组的83.89%。结果表明:VEGF对卵母细胞体外成熟和维持染色体正常形态具有一定的促进作用。试验5:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中α-tubulin蛋白和微管组织中心(Microtubule Organizing Centers,MTOCs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了α-tubulin从微管组织中心向染色体的空间迁移和重新组装。同时试验得出,试验组和对照组的微管蛋白和MII期染色体的正常分布率分别是77.50%和62.60%。试验组与对照组相比,极显着的提高了微管蛋白和MII期染色体的正常分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF促进了MTOCs从胞内和皮质区的消失,并加速了α-tubulin重新分配和向染色体的聚集,有效的提高了卵母细胞核成熟质量。试验6:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中皮质颗粒(Cortical Granule,CGs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了CGs从胞质向皮质区的时空迁移。试验组和对照组的皮质颗粒正常迁移分布率分别为79.24%和60.97%。试验组与对照组相比,极显着的提高了皮质颗粒正常迁移分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF通过促进绵羊卵母细胞成熟过程中CGs的时空迁移,对绵羊卵母细胞胞质成熟具有积极促进作用。2、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响试验7:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合透射电镜技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响。结果显示:①VEGF有效促进了微绒毛的发育和变化,增加了游离端斜行插入透明带微绒毛的数量,促进了细胞内外物质交流和养分的吸收;②VEGF促进了皮质颗粒在卵母细胞成熟培养过程中向皮质区迁移的时间和空间变化;③发现特征性绵羊卵母细胞线粒体――带帽状线粒体,并且VEGF对线粒体的迁移有一定的促进作用;④VEGF的添加对卵母细胞成熟过程中脂滴数量的增加没有显着的作用,但VEGF减少了小脂滴聚集为大脂滴。3、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性变化的影响试验8:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合酶联免疫技术,检测胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性的变化。结果显示:绵羊卵母细胞成熟过程中叁种磷酸化激酶活性都呈波动变化,试验组的P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK相对含量始终高于对照组相对含量。成熟培养16小时和20小时时,试验组P44/p42 MAP kinases(Erk1和Erk2)含量显着高于对照组(P<0.05);成熟培养16、21小时和24小时时,试验组PTK含量显着升高于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF添加到绵羊卵母细胞成熟培养液中,改变了PTK磷酸化水平,进一步引起信号传递分子MAP kinase和PKC的磷酸化,从而有效促进了绵羊卵母细胞体外成熟。4、VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞体外成熟过程中的表达试验9:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合RT-PCR技术,研究VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1mRNA在绵羊卵母细胞体外成熟过程中颗粒细胞和卵母细胞细胞中的表达。结果显示:①卵母细胞培养前VEGF mRNA在卵母细胞中就有表达。在整个成熟过程中对照组中其表达一直持续,但比培养前的表达量有所下降;在试验组中,VEGF mRNA在卵母细胞中的表达呈下降趋势,到成熟培养24小时时表达量微弱;卵母细胞培养前VEGF mRNA在颗粒细胞中有表达。到培养8小时时,对照组表达量升高,但后期表达量明显下降。试验组在培养8小时时表达量就已经下降,24小时时持续低水平表达。②卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续表达量明显下降。培养8小时和24小时对照组比试验组表达强,到24小时试验组几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达;卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在颗粒细胞中有表达,到8小时时对照组表达加强,随培养时间延续其表达量下降,直至24小时检测不到。试验组从培养8小时开始就几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达。③卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续,无论是试验组还是对照组其表达量都明显上升;卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在颗粒细胞中有强表达,随培养时间的延续其表达量在对照组培养8小时时加强,但在试验组中减弱,培养到24小时时,两组表达量都很微弱。结果表明:外源VEGF的加入,改变了卵母细胞和颗粒细胞中VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1 mRNA的表达。试验10:结合免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究KDR/Flk-1和Flt-1蛋白在卵母细胞成熟观过程中颗粒细胞和卵母细胞中的表达。结果显示:绵羊卵母细胞成熟培养过程中,无论是在卵母细胞膜表面还是在颗粒细胞膜表面都检测到KDR/Flk-1和Flt-1蛋白的表达。
汪锋[3]2014年在《白藜芦醇和褪黑素对卵母细胞成熟及胚胎发育的作用机制》文中研究表明卵母细胞体外成熟及胚胎发育是发育生物学研究的基础,改善胚胎体外生产效率对提高动物生产及促进辅助生殖技术的应用具有重要意义。本文研究了白藜芦醇和褪黑素与卵母细胞体外成熟及胚胎发育的作用机制。结果如下：1.研究了不同浓度白藜芦醇(0.1,1.0或10μM)对牛卵母细胞成熟的影响及作用机制。研究显示,牛体外成熟培养液中添加适宜浓度白藜芦醇能显着增加卵丘细胞孕激素分泌及减少雌二醇的分泌。1.0μM白藜芦醇能显着促进卵丘扩展和极体形成,提高卵母细胞体外受精后囊胚率、孵化囊胚率和囊胚细胞数。白藜芦醇显着降低卵母细胞ROS水平,提高GSH水平。同时,本研究首次发现Sirt1在牛颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞和囊胚中表达,且白藜芦醇能促进Sirtl的表达。本研究证明了白藜芦醇通过诱导孕激素分泌和抗氧化作用促进牛卵母细胞成熟及体外受精后胚胎发育,这种促进作用可能依赖于Sirtl途径。2.研究了不同浓度褪黑素(10-11,10-9,10-7,10-5,10-3M)对牛胚胎发育的影响及其作用机制。研究表明,前期培养液中添加10-7M褪黑素,后期培养液中添加10-9M褪黑素均能显着促进牛胚胎发育。qRT-PCR、免疫荧光和western blot检测表明,牛不同发育阶段胚胎上均存在MT1和MT2受体。进一步研究发现,褪黑素对牛胚胎发育的促进作用通过MT1受体介导。同时,褪黑素能显着影响牛胚胎发育过程中氧化、凋亡及发育相关重要基因(SLC2A1, DNMT1A和DSC2)的表达。本研究结果提供了褪黑素在体外条件下促进下牛胚胎发育的新机制。3.研究了褪黑素对体外发育胚胎质量的影响。本实验研究了褪黑素处理对体外发育囊胚玻璃化冷冻后死亡率、孵化率及发育相关基因表达的影响。研究表明,褪黑素(10-7M)组牛囊胚玻璃化冷冻并解冻培养24小时后囊胚孵化率显着高于对照组,而褪黑素组囊胚冷冻解冻后48至72h,囊胚死亡率显着低于对照组。此外,褪黑素组囊胚冷冻解冻后ⅠNMT3A,OCC,CDH1表达显着上调,AQP3的表达显着下调。综上所述,褪黑素不仅加快牛胚胎体外发育的速度及提高囊胚发育率,而且还通过提高抗冷冻能力及调控发育相关基因的表达而提高囊胚质量。4.研究了褪黑素对小鼠体外发育囊胚移植后附植效率的影响。研究显示,10-7M褪黑素能显着提高小鼠体外发育囊胚移植后的妊娠率(95.0%vs.67.8%),窝产仔数(4.1只/窝vs.2.7只/窝)和出生后代的存活率(96.84%vs.81.24%)。分子研究显示,褪黑素显着上调了超氧化物歧化酶(SOD)和抗凋亡基因bcl-2的表达,下调了促凋亡基因p53和caspase-3的表达。说明褪黑素通过减少ROS产生及抑制细胞凋亡而提高了囊胚质量,高质量的囊胚移植后能产生更多且更健康的后代。综上所述,白藜芦醇诱导牛卵母细胞孕激素分泌和降低胞内ROS水平、提高GSH水平,并可能通过Sirtl途径提高牛卵母细胞成熟及体外受精后发育效率；褪黑素通过降低胚胎发育过程中抗氧化抗凋亡基因(GPX4,SOD1和BCL-2)和发育相关重要基因(SLC2A1, DNMT1A和DSC2)的表达,下调促凋亡基因(P53,Bax和Caspase-3)表达,且通过MT1受体提高牛胚胎体外发育的效率和质量；通过上调DNMT3A、OCC、CDH1表达,下调AQP3表达,增强牛胚胎冷冻保存的抗冷冻能力；通过上调超氧化物歧化酶(SOD)和抗凋亡基因bcl-2表达,下调促凋亡基因p53和caspase-3表达,减少ROS产生及抑制细胞凋亡,显着提高小鼠囊胚移植后的附植和产仔成活效率。
杨慧欣[4]2006年在《影响绵羊体外胚胎生产效果因素的研究》文中提出本论文从卵母细胞采集、体外成熟培养、体外受精、胚胎体外发育培养以及卵母细胞冷冻保存方面研究了影响绵羊体外胚胎生产效果的因素,以期提高绵羊体外胚胎生产的效率。 在卵母细胞采集方面,研究了不同采集方法(抽吸法和切剖法)和不同季节对绵羊卵母细胞采集效果的影响。结果表明,平均每个卵巢获得的可用卵数,切剖法显着高于抽吸法(2.02枚vs1.05枚,P<0.05);9、10月份屠宰绵羊平均每个卵巢所采集的卵母细胞数(1.50枚,1.68枚)极显着高于其它月份(1、2、3、4、5、6、10、11、12月份)(P<0.01)。 在卵母细胞体外成熟培养方面,比较了成熟液中添加FBS和ESS对卵母细胞成熟效果的影响。结果表明:成熟液中添加ESS较FBS能显着提高卵母细胞的成熟率(72.7%vs60.2%,P<0.05)。 在体外受精方面,研究了精卵共孵育时间长短和不同精液处理方法对体外受精卵裂率的影响。结果表明:精卵共孵育24h组卵裂率高于6h组(60.4%vs22.7%,P<0.05),而与18h组差异不显着(60.4%vs58.6%,P>0.05);低温保存精液上游法的卵裂率(78.6%)显着高于低温保存精液Percoll离心法和冻精Percoll离心法(60.2%,62.3%)(P<0.05),极显着高于冻精上游法(21.1%)(P<0.01)。 在体外胚胎发育培养方面,研究了在发育液中添加EDTA、葡萄糖以及发育液不同更换方式对体外胚胎发育的影响。结果表明,胚胎发育培养液中添加10μM EDTA能显着提高卵裂率(55.7%vs43.6%,P<0.05)和桑椹胚率(24.6%vs16.1%,P<0.05);在胚胎发育不同阶段添加变化浓度的葡萄糖可显着提高卵裂率(66.1%vs44.7%,P<0.01)和桑椹胚率(33.7%vs17.1%,P<0.05);半量更换发育液方式的桑椹胚率高于全换液和不换液方式(42.0%vs33.3%and16.2%,P<0.05)。 本论文还研究了在培养液(包括成熟液、受精液和发育液)中分别添加0,1,2,5和10ng/ml的VEGF对绵羊体外胚胎生产效率的影响。结果表明:VEGF添加量为5ng/ml和2ng/ml的组卵裂率(86%,69%)和桑椹胚率(31.0%,25.0%)显着高于其它各组(P<0.05)。 在绵羊卵母细胞冷冻保存方面,研究了利用EDFS30玻璃化冷冻液,采用OPS法玻璃化冷冻体外成熟绵羊卵母细胞效果的研究。结果表明:经冷冻保存的卵母细胞解冻后体外受精和孤雌激活的卵裂率、桑椹胚率(42.3%、50.0%和18.4%、33.4%)显着低于非冷冻组(65.3%、68.2%和27.0%、13.4%)(P<0.05),冷冻组没有胚胎发育到囊胚。
罗海玲, 木村康二, 青木真理, 平子诚, 赵有璋[5]2002年在《血管内皮生长因子对牛胚胎体外发育影响的最适添加浓度筛选试验》文中研究指明为了探明血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthfactor,VEGF)对牛卵母细胞体外发育影响的最适添加浓度,试验中应用了人类重组VEGF165。结果表明,添加1ng/ml、2ng/ml和5ng/mlVEGF均可显着提高胚胎的卵裂率和体外发育率,但以5ng/mlVEGF处理组可以得到最高的胚胎发育至4-8细胞期的发育率,因而选择5ng/mlVEGF浓度作为以后VEGF系列试验的添加浓度。
田秀芝[6]2017年在《褪黑素和CNP对绵羊卵母细胞体外成熟的影响及过表达AANAT的研究》文中研究说明卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎工程研究的重要基础环节,但体外成熟卵母细胞的质量与体内相比仍有很大差异。大量的研究表明褪黑素(MT)和C-型钠钛(CNP)在动物的生殖活动尤其是对卵母细胞的成熟发育具有重要的意义。因此本研究利用MT和CNP对绵羊卵母细胞进行体外成熟培养,以期进一步完善体外培养体系并研究卵母细胞体外成熟的调控机理,从而为绵羊的体外受精、核移植等生物技术的开展奠定基础。实验一研究了褪黑素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。免疫荧光检测表明在绵羊GV和MII卵丘颗粒细胞、卵母细胞上都表达褪黑素受体MT1和MT2,western blot检测表明MT1和MT2在壁颗粒细胞、GV和MII卵丘颗粒细胞及卵母细胞上都表达,且MT1在颗粒细胞和GV卵丘颗粒细胞上的表达显着高于GV卵母细胞、MII卵母细胞和卵丘颗粒细胞;MT2在MII卵母细胞上的表达显着高于GV颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和卵母细胞及MII卵丘颗粒细胞;成熟液中添加10-9～10-7 mol/L褪黑素显着提高卵丘颗粒细胞扩展和极体排出率,且10-7 mol/L显着提高了卵裂率和囊胚率;RT-PCR结果表明10-7mol/L褪黑素对卵母细胞GDF9、DNMT1的表达没有影响但提高了卵母细胞上BMP15及卵丘颗粒细胞PTX3、HAS2、EGFR的表达;添加抑制剂Luzindole组极体排出率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率与对照组相比没有差异,但显着低于MT组;MT显着降低卵母细胞的cAMP、增加颗粒细胞的cGMP。本研究结果说明MT主要是通过MT1受体发挥作用的。实验二研究了 CNP对绵羊卵母细胞减数分裂的影响。RT-PCR检测表明在绵羊壁层颗粒细胞、GV卵丘颗粒细胞和卵母细胞上CNP和NPR2都有表达,且壁层颗粒细胞上CNP含量显着高于卵母细胞和卵丘颗粒细胞,而卵丘颗粒细胞上NPR2显着高于壁层颗粒细胞和卵母细胞。在成熟培养液中添加200 nM CNP处理不同时间(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)的结果表明:CNP处理4 h内能显着抑制核成熟,6 h后抑制作用迅速降低,CNP处理16 h已有卵丘颗粒细胞完全扩展,说明CNP处理最佳时间是4 h且对卵丘颗粒细胞扩展没有影响。CNP处理绵羊COCs 4 h、8 h、12 h卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达变化表明:卵母细胞上CNP、NP和MT18 h表达量最高,卵丘颗粒细胞上NPR2 4 h表达量最高,FSHR、LHR、MT1、MT2、EGFR总体呈上升趋势,说明卵母细胞发生GVBD需要CNP的参与,CNP能够促进成熟相关基因的表达。200 nM CNP处理共培养绵羊壁层颗粒细胞(MGC)和COCs 4 h、8 h、12 h结果表明:GC细胞上CNP、NPR2、MT1、MT2和LHR的表达量呈上升趋势,说明GC分泌CNP,同时促进了 GC上NMT1、LHR的表达;COCs上CNP也增加,主要可能是由于GC合成的CNP进入COCs,而COCs上NPR2在4 h表达量最高,充分说明了壁层颗粒细胞分泌CNP并通过卵丘颗粒细胞上NPR2发挥作用。本研究结果揭示了 CNP在4 h内能够抑制卵母细胞的减数分裂恢复,且不影响COCs的卵丘颗粒细胞扩展,其作用机制是通过壁层颗粒细胞分泌CNP作用于卵丘颗粒细胞上的NPR2受体,从而影响了卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达,进一步影响COCs的体外成熟。实验叁研究了 CNP和MT共同处理对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎体外发育的影响。实验结果表明,CNP预处理4 h再继续成熟24 h和28 h组孤雌激活胚的卵裂率显着高于对照组,再成熟24 h组囊胚率显着高于对照组,而再成熟28 h组囊胚率和对照组没有显着差异。研究结果还表明CNP、MT单独或联合使用胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数都显着高于对照组;定量PCR结果表明,CNP、MT、CNP + MT叁组CNP、NPR2、FSHR和EGFR都显着提高;CNP、MT、CNP + MT叁组线粒体均匀分布比例显着提高,皮质颗粒完全迁移的比例显着提高。综上所述,利用CNP、MT进行绵羊卵母细胞体外成熟培养都能够促进胞质与核成熟的同步性,增加成熟相关细胞因子的分泌,从而显着提高卵母细胞体外成熟的质量,从而提高胚胎的发育能力。实验四研究了过表达AANAT基因对转基因绵羊生产效率的影响。研究结果表明OPS冷冻胚胎的产仔率、羔羊存活率和转基因阳性率与未冷冻胚胎没有显着性差异,但冷冻胚胎的后代平均初生重高于未冷冻胚胎,转AANAT阳性后代的超排效率和后代扩繁效率与对照组差异不显着,但显着高于阴性组,后代扩繁的窝产羔数显着高于对照组和阴性组,但扩繁后代初生重低于对照组。以上结果揭示了原核注射AANAT基因的胚胎过表达AANAT基因,提高了胚胎的褪黑素水平和后代卵母细胞的质量,进而提高了胚胎移植效率、转基因阳性率和后代的繁殖效率。综上所述,MT能够促进绵羊卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的体外发育;CNP在4 h内能够显着抑制卵母细胞的减数分裂恢复;CNP、MT单独或者联合使用,都有利于卵母细胞的体外成熟,提高CNP、NPR2、FSHR、LHR、EGFR、MT1和MT2基因的表达及线粒体均匀分布和皮质颗粒完全迁移的比例;显微注射转入AANAT基因提高了胚胎的褪黑素水平,提高胚胎移植的效率和转基因后代的阳性率及转基因后代的繁殖效率。
郭宪[7]2003年在《牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究》文中进行了进一步梳理随着胚胎工程技术的深入研究和商业化推广应用，牛卵母细胞体外成熟、体外受精技术成为解决体外生产胚胎紧缺问题的重要途径之一。本研究在总结前人研究的基础上，应用体外培养技术对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育作了进一步研究，旨在建立健全一套完整的体外生产高产优质牛胚胎的高新技术体系，为胚胎工程和生产实践提供技术操作规程和方法，为理论研究积累资料。研究结果如下： 1．从屠宰场获取的卵巢，先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢，可显着提高可用卵母细胞数；卵巢保存时间在2h以内最好，最晚不超过6h；牛卵巢表面卵泡卵母细胞的体外成熟时间以22～24h最佳，而牛卵巢内卵母细胞的体外成熟培养时间可延长1～2h。利用活体采卵技术可生产血缘清楚、遗传品质优秀的胚胎。 2．30～39℃的生理盐水保存卵巢，卵母细胞的成熟率(63.9％)和卵裂率(34.4％)最高，与2～8℃(16.7％、0％)、20～29℃(54.1％、31.7％)两组差异显着(P＜0.05)。 3．用四孔培养板800μl培养液与微滴(50μl)培养牛卵母细胞，其体外成熟率(61.1％vs62.9％)和卵裂率(34.4％vs35.2％)均无显着差异性(P＞0.05)。 4．采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为69.2％、64.3％)，无显着差异性(P＞0.05)。 5．直径2～6mm卵泡中的卵母细胞成熟率(72.1％)最高，与直径小于2mm(58.4％)、6～8mm(56.4％)及大于8mm(35.0％)卵泡中的卵母细胞组差异显着。 6．成熟培养基中添加10％的新鲜牛卵泡液(bFF)对牛卵母细胞的体外成熟有促进作用，但高浓度的bFF(20％、30％)则抑制牛卵母细胞的体外成熟。 7．卵丘-卵母细胞复合体的质量影响卵母细胞的体外成熟，A、B、C叁级卵母细胞成熟率分别为86.1％、66.3％、35.6％，卵裂率分别为42.8％、31.9％、10.5％，差异均显着(P＜0.05)。 8．M199是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基，M199+50IU／ml LH+100 IU／ml FSH+1μg／ml 17β-E_2和M199+50IU／ml GnRH+1μg／ml 17β-E_2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为69.4％、67.5％，卵裂率分别为35.4％、42.7％)。 9．BO液上浮法和TALP液Percoll法是牛精子洗涤和体外获能的理想方法，受精后卵裂率分别为56.1％、57.6％，无显着差异性(P＞0.05)。 10．输卵管上皮细胞是克服牛胚胎发育阻断理想的共培养细胞(囊胚发育率为32.4％)；分步培养适宜于研究牛早期胚胎的体外发育(8-细胞发育率为60.4％，囊胚发育率为35.5％)。
潘阳阳[8]2016年在《生长因子提高牦牛IVF、SCNT胚胎发育和卵母细胞冷冻适应性的机制研究》文中研究说明牦牛作为青藏高原地区重要物种资源,通过辅助繁殖技术提高其繁殖性能对我国“丝绸之路经济带”畜牧业的发展至关重要。为了提高体外生产牦牛胚胎的质量,阐明生长因子对牦牛体外胚胎发育的调控作用,及其对细胞凋亡的影响,并试图通过生长因子改善牦牛卵母细胞和胚胎冷冻技术,本研究进行了以下实验并取得了一定成果。(1)采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中EGF及EGFR表达动态,分析EGF对牦牛卵母细胞成熟率、胚胎发育能力、囊胚质量的影响,并检测细胞凋亡相关基因的表达变化。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达EGF和EGFR,且成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,EGFR的表达水平高于EGF。加入EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,最佳的作用浓度为100 ng·mL-1。EGF作用后成熟卵母细胞中促凋亡基因Bax表达显着降低(p?0.05),而抗凋亡基因Baxi的表达水平显着增加(p?0.05),囊胚中HSP70和Survivin的表达也可在100 ng·mL-1 EGF处理组中显着提高。结果表明牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中EGF和EGFR作为重要的自分泌或旁分泌因子,可通过调控Bax、Baxi、HSP70和Survivin等凋亡相关基因的表达提高牦牛卵母细胞和体外受精胚胎的发育能力。(2)运用Real-time PCR、WB和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中IGF-1及IGF-1R表达动态,同时在牦牛卵丘细胞体外培养、体外胚胎发育中加入不同浓度的IGF-1,分析卵丘细胞的凋亡率及凋亡相关基因的表达变化,及其对胚胎发育能力的影响。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达IGF-1和IGF-1R,成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,IGF-1R的表达水平高于IGF-1、外源的IGF-1可以显着提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,浓度为100 ng·mL-1时,作用效果最佳。体细胞培养过程中IGF-1可以显着降低细胞凋亡率(p?0.05),在IGF-1浓度为100 ng·mL-1处理组中卵丘细胞的凋亡率最低,且Bax的表达水平最低,HSP70和Bcl-2的表达水平最高。研究结果表明,igf-1可调节卵丘细胞的hsp70、bax和bcl-2表达,降低细胞凋亡率,且igf-1在牦牛移植前胚胎发育过程中作为重要的生长因子,可以提高囊胚的形成和细胞增殖。(3)采集6月龄和24月龄牦牛睾丸组织,real-timepcr、wb和ihc方法从基因和蛋白水平分析牦牛睾丸发育过程中egf和egfr的表达变化;在牦牛冻精体外获能过程中加入不同浓度的igf-1,分析获能后精子的活性、评估不同处理组受精后胚胎的卵裂率,并采用real-timepcr、wb和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测igf-1对牦牛精子bax和bcl-2表达的变化。研究发现24月龄牦牛睾丸组织中egf和egfr的表达水平显着高于6月龄睾丸组织(p?0.05),egfr的水平高于egf,24月龄睾丸组织中表达更广,睾丸间质细胞、曲精小管肌上皮细胞、睾丸支持细胞、生殖细胞和精子均可表达egf和egfr。100ng·ml-1igf-1可以显着提高牦牛的精子活性(p?0.05),该处理组中受精后胚胎卵裂率也显着提高(p?0.05),而精子中bax基因的表达显着降低,bcl-2表达增加。综上表明生长因子可调控牦牛精子的生成和活性,从而促进后续胚胎的发育,且这种调控作用与细胞凋亡有关。(4)牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的bmp6,分析卵母细胞成熟率、用成熟的卵母细胞生产克隆胚胎,并评估其发育能力,采用real-timepcr和间接免疫荧光方法分析2细胞胚胎和囊胚中h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3表达的变化,同时分析囊胚bax和bcl-2的表达。研究发现100ng·ml-1bmp6可以显着提高卵母细胞成熟率、克隆胚胎卵裂率和囊胚形成率(p?0.05),囊胚质量也有所提高。在bmp6处理组中,h3k9ac、h3k18ac、bcl-2基因表达增加、而bax、h3k9me3基因表达降低,h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3在2细胞克隆胚胎的表达差异更显着(p?0.05)。研究结果表明bmp6可以提高牦牛卵母细胞和后续克隆胚胎的发育潜能,其作用类似于其他osfs,且这种调节作用与其调控组蛋白修饰和细胞凋亡有关。(5)收集牦牛cocs,采用ct和ssv方法对其进行玻璃化冷冻,冷冻-解冻后分析不同处理组卵母细胞的成熟率和胚胎发育能力,采用real-timepcr、wb从基因和蛋白水平检测成熟卵母细胞、卵裂胚胎、和囊胚中hsp90的表达变化;同时在牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的igf-1,分析卵母细胞的成熟率和CIRP的表达水平,将不同处理组成熟的卵母细胞采用CT法玻璃化冷冻,冷冻解冻后进行孤雌激活,分析胚胎的发育能力。研究发现CT和SSV冷冻组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率比较接近、其中成熟率和卵裂率显着低于对照组(p?0.05),HSP90的表达水平也低于对照组,而叁组囊胚率和HSP90的表达水平比较接近。100 ng·mL-1 IGF-1可以提高成熟卵母细胞CIRP表达和卵母细胞的成熟率,冷冻-解冻后孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率有所提高,但囊胚质量差异不显着。结果表明CT和SSV玻璃化冷冻方法对牦牛未成熟卵母细胞具有相同的冷冻效果,且其对发育能力的影响主要集中在成熟期到早期卵裂期,并与HSP90的表达水平有一定关联性,而卵母细胞成熟过程中IGF-1可以调控CIRP的表达,提高成熟卵母细胞对低温的适应能力,降低低温对卵母细胞损伤,从而提高后续发育能力。
武建朝[9]2007年在《利用性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外生产胚胎的研究》文中指出本研究以长江叁角洲白山羊为研究对象，分别研究了羔山羊不同日龄及激素剂量对卵泡发育及卵巢组织学的影响；与成年羊对比，研究了性成熟前山羊卵母细胞体外减数分裂进程；体外培养成熟的卵母细胞进行体外受精，研究了性成熟前山羊卵母细胞卵龄、成熟过程和受精过程中卵丘存在程度对卵母细胞发育能力的影响，并且比较了性成熟前山羊不同直径卵母细胞体外发育能力，进一步就卵母细胞体外受精及受精卵体外培养方案进行了优化，旨在提高性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外胚胎生产效率。1．日龄和激素剂量对羔山羊COCs的获得影响显着。FSH处理后45日龄羔羊卵巢可见卵泡数、COCs数及未扩展COCs数均显着高于90日龄(P＜0.05)。45日龄FSH70组卵泡数和COCs数显着高于FSH 40组，但未扩展COCs数低于FSH 40组。FSH70组裸卵比例较高，未扩展COCs数较FSH 40组低。FSH 40组45日龄羔羊平均每只单侧卵巢获得可用卵母细胞23.33±1.53枚，显着高于其它各组(P＜0.05)。切片组织学观察发现：FSH处理对原始卵泡、初级卵泡的直径影响不显着，但对卵子直径影响显着，均属正常卵子直径范围内(130～150μm)。FSH 40处理组生长卵泡数明显高于FSH70处理组，其中FSH 70组卵泡较FSH 40组大。2．成年山羊和性成熟前山羊卵母细胞体外成熟过程中减数分裂各时相出现时间不同。在整个体外成熟培养过程中，性成熟前山羊卵母细胞GV期存在时间较长(7.21h)，在成熟培养23.96h后才能进入MⅡ期；成年羊卵母细胞GV期存在时间相对较短(2.94h)，大约在成熟培养20.64h后，进入MⅡ期。体外成熟培养24h和27h，成年羊卵母细胞成熟率差异不显着，但是性成熟前山羊卵母细胞成熟率差异显着(P＜0.05)。与成年山羊相比，羔山羊卵母细胞孤雌发育能力较差，可能与其卵母细胞本身成熟缺陷有关。3．体外成熟24h、27h和30h，性成熟前山羊卵母细胞受精率、卵裂率差异不显着(P＞0.05)，但显着高于21h组(P＜0.05)。成熟24h和27h卵母细胞桑椹胚囊胚率显着高于成熟21h和30h组(P＜0.05)。4．去除卵丘的卵母细胞和裸卵体外培养可以成熟，但受精率、卵裂率、桑椹胚囊胚率显着低于带卵丘的卵母细胞(P＜0.05)。成熟前机械去除卵丘严重影响性成熟前山羊卵母细胞发育能力。1～3层和多层卵丘的卵母细胞受精率、卵裂率、桑椹胚囊胚率差异不显着(P＞0.05)。5．性成熟前山羊卵母细胞受精前卵丘存在程度对其受精率和卵裂率影响不显着(P＞0.05)，但受精前完全去掉卵丘严重影响胚胎后续发育能力，桑椹胚囊胚率显着低于带卵丘的卵母细胞。卵丘完整组与部分卵丘去除组卵母细胞体外发育能力差异不显着。6．性成熟前山羊卵母细胞GVBD发生率及成熟率随其直径的增加而显着增加。成熟培养0h，直径＜110μm卵母细胞GV期比例显着高于其它各组。随着卵母细胞直径的增加，GVBD发生率也增加。成熟培养27h，直径＞135μm组MⅡ期比率(75.00％)显着高于其它组(P＞0.05)，其中直径＜110μm组卵母细胞体外培养不能达到MⅡ期。7．性成熟前山羊卵母细胞受精率、卵裂率随其直径的增加而显着提高(P＜0.05)。卵母细胞直径＜110μm、110～125μm、125～135μm组桑椹胚囊胚率差异不显着(P＞0.05)，但显着低于直径＞135μm组(P＜0.05)。8．TALP液较BO液更适合性成熟前山羊卵母细胞体外受精所用。9．SOFaa较CRlaa更适合性成熟前山羊早期胚胎体外培养所用。
陶勇[10]2004年在《一氧化氮与猪卵母细胞减数分裂成熟》文中研究说明一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种气体自由基，广泛存在于各组织器官的各种细胞中，是重要的信使物质。它在循环系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和免疫系统等多种病理生理过程中发挥重要的调节作用，在动物(包括人类)的饮食营养中受到重视。在生殖系统中，NO参与性行为的表现、类固醇激素的生成、精子发生、卵泡的发育和闭锁、卵母细胞的减数分裂成熟、受精、囊胚植入和胚胎发育等一系列生殖过程。NO对卵母细胞减数分裂成熟的研究主要集中于小鼠，在其他动物上报道不多，尤其是大家畜上研究较少，而且一些研究结果不一致。本论文以猪为对象，研究了NO在卵母细胞减数分裂中的作用及机理。 实验一研究了NO对猪卵母细胞成熟的影响，包括卵丘细胞包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes, CEOs)和脱除卵丘的卵母细胞(denuded oocytes, DOs)。用不同浓度的NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)(0mM、0.1 mM、1 mM和10mM)处理CEOs和DOs，培养结束后，检测卵丘细胞扩展、DNA片段化和卵母细胞减数分裂成熟情况。结果发现，SNP可剂量依赖性地抑制卵丘细胞的扩展和DNA片段化，同时抑制CEOs中卵母细胞的减数分裂恢复，抑制MⅠ向MⅡ期转变。SNP对DOs减数分裂恢复基本没有影响。结果表明，高浓度的NO能通过调节卵丘细胞的功能活动抑制猪卵母细胞的减数分裂恢复，尤其是抑制MⅠ期到MⅡ期的发育过渡。 实验二研究了NO对卵母细胞减数分裂成熟的作用与其培养环境的关系。将CEOs培养于SNP、促性腺激素(FSH和hCG)或/和β-巯基乙醇(β-ME)环境中。结果发现，在自发成熟模型中，SNP能促进卵丘扩展，该作用能被β-ME逆转；SNP不影响CEOs的减数分裂恢复，但可抑制其发育到MⅡ；在生理成熟模型(次黄嘌吟培养基)中，SNP和β-ME都不影响卵丘扩展，但抑制促性腺激素诱导的卵丘扩展。SNP还抑制促性腺激素诱导的减数分裂恢复，尤其是抑制CEOs发育到MⅡ期，而β-ME能逆转SNP的这种作用。在两种培养模型中，β-ME均可促进促性腺激素诱导的减数分裂恢复，促进CEOs发育到MⅡ。实验结果还发现，HX能增加猪卵母细胞透明带的脆性，而促性腺激素、SNP或β-ME均可减弱这种作用。本实验表明，NO在不同的猪卵母细胞成熟模型中作用也不相同，这种作用受自由基清除剂β-ME的影响。 实验叁研究了维生素C和E(Vc，Ve)在卵母细胞减数分裂成熟过程中的抗自由基作用。将CEOs和DOs分别培养于不同浓度的Ve(0μM，10μM，100μM和200μM)和Vc(0μM，50μM，250μM和750μM)中，发现两者都不影响卵丘细胞的扩展，但都能抑制卵丘细胞的凋亡；α-生育酚或L-抗坏血酸可促进DOs恢复减数分裂，并进一步促进DOs发育到MⅡ期，但两种维生素都不影响CEOs减数分裂成熟。这些结果表明维生素C和E促进DOs恢复减数分裂和发育到MⅡ期，可以抑制卵丘细胞的凋亡，尤其是10μM的生育酚和250μM的抗坏血酸。 实验四研究了参与卵母细胞减数分裂成熟的NOS的类型。用不同的NOS抑制剂处理猪CEOs和DOs，即iNOS选择性抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)和eNOS及iNOS的非选择性抑制剂左旋硝基精氨酸(Nco-nitro-L-arginine, L-NNA)和左旋硝基精氨酸甲基酯(Nto-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)。发现AG能抑制卵丘扩展和CEOs的减数分裂恢复，但对卵丘细胞DNA的片段化没有显着影响。L-NAME或L-NNA则同时抑制卵丘扩展，卵丘细胞DNA片段化和CEOs减数分裂成熟，但对DOs的作用不显着。结果表明，iNOS产生的NO对于卵丘扩展和卵母细胞减数分裂成熟是必需的，eNOS和iNOS产生的NO均参与了卵母细胞减数分裂成熟，这些作用可能是通过介导卵丘细胞的功能活动实现的。 实验五研究了不同类型NOS在不同发育阶段的卵泡(包括卵母细胞)中的免疫组织化学定位。实验五分叁个部分，第一部分是培养腔前卵泡(250一300林m)，在培养基中分别加入0 mM (对照组)，0.1 mM，0.3，nM，0.5 mM不1.1，nM sNP，培养4d后观察卵泡的成腔情况。结果发现，0.1 mM SNP对成腔率没有显着影响(P>0.05)，而0.3 mM，0.5 mM或l一nM SNP则可显着抑制成腔率(尸<0.05)。第二是培养CEOs时分别加入0.1 mM SNP和NOS抑制氨基肌(aminoguanidine biearbonate salt，AG，1 0 mM)不11左旋硝基精氨酸甲基酷(N。一nitro一L一a唱ininemethy!ester，L一NAME，1 mM)，培养44h后观察卵母细胞减数分裂成熟情祝。结果发现，^G显着抑制卵母细胞的减数分裂恢复，而L一NAME则可抑制第一极体(first Polar body，PBI)的排出。第叁，利用免疫组织化学的方法研究两种NOS在卵巢上小(直径1~Zm!n)、中(3一6 mm)、大(7一lomm)卵泡包裹的卵母细胞、卵泡以及黄体(eo甲usluteum，CL)不11一勺体(eo甲usalbiean，CA)中的特异性表达部位。结果发现，eNOS在腔前卵泡中有表达，但免疫阳性染色仅限于卵母细胞和膜细胞层，这种eNOS表达从小、中到人卵泡包裹的卵母细胞逐渐增强，并且大卵泡中的卵丘细胞也开始表达eNOS，而此前的卵丘细胞井不表达eNOS。在黄体的周围，部分粒性黄体细胞呈现eNOS免疫阳性染色，而在白体中，eNOS阳性染色见于部分实质内。在原始卵泡和早期有腔卵泡「}一
参考文献：
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[9]. 利用性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外生产胚胎的研究[D]. 武建朝. 南京农业大学. 2007
[10]. 一氧化氮与猪卵母细胞减数分裂成熟[D]. 陶勇. 中国农业大学. 2004
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