郝雪微1 阮 莹2 刘欣宇1 顾园竹1 李金桐1
（1哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院 黑龙江 大庆 163000）
（2哈尔滨医科大学药学院 黑龙江 大庆 163319）
【摘 要】目的：研究活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用。方法：用MTT法检测乳香挥发油对结肠癌细胞SW480的抑制率，用流式细胞术检测细胞内ROS含量及细胞的凋亡率。 结果：乳香挥发油对结肠癌细胞有抑制作用，同时使细胞内ROS含量增加，凋亡率增加，加入GSH后可以减少ROS含量，减少凋亡率。结论：乳香挥发油可以抑制结肠癌细胞的增殖及诱导凋亡，GSH可以通过减少活性氧含量减少细胞凋亡。
【关键词】乳香挥发油；人结肠癌细胞SW480；活性氧；凋亡
【中图分类号】R34 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）5-0235-02
1 实验材料
药品与试剂：乳香挥发油为课题组之前制备[2]，成分大多为单萜、倍半萜、醇及酯类等，其中含量最高的成分为乙酸辛酯、橙花叔醇异丁酯、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇甲酸酯及β-榄香烯，含量分别为34.660%、18.290%、9.612%和5.614%。左旋谷胱甘肽(L-Glutathione, GSH)购于Sigma公司。MTT，活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司。
细胞及培养：人结肠癌细胞SW480细胞为本室保存, 接种在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg /ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃，5%的C02环境下培养。
2 实验方法
2.1 MTT测定细胞的增殖活性
取对数生长期的SW480细胞，以1×105个/ml接种于96孔板(100μl/孔)，培养过夜后，加入不同浓度的乳香挥发油及活性氧清除剂(GSH),实验分组为：Control、EOF低剂量(20μg/ml)、EOF高剂量(40μg/ml)、GSH(10μg/ml)、EOF低剂量(20μg/ml)+GSH(10μg/ml) 、EOF高剂量(40μg/ml)+GSH(10μg/ml)；复设3孔。药物作用12小时，弃培养基，向每孔分别加入20μl的5mg/ml的MTT存储液，并于37℃孵育4小时。之后向每孔加入150μl的DMSO, 酶标仪570nm波长处测定吸光度值A。按以下公式计算抑制率(IR):IR=(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100%。
2.2 检测ROS的生成量
取对数生长期的SW480细胞，接种于6孔板培养皿中。按 2.1中分6组，12小时后离心收集细胞，并用200μl的RPMI1640培养液制成单细胞悬液。然后加入10μl ROS探针于37℃孵育45分钟，最后用PBS缓冲液清洗以出去未结合探针。用BD FACs Aria Ⅰ型流式细胞仪通过荧光密度来检测ROS的含量。GSH于乳香挥发油作用前1小时进行预处理。
2.3 通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率
将肿瘤细胞按照1×105/ml的浓度接种到6孔板中，培养12 h后按以上分组计量加药，每个药物浓度设置3个平行孔。药物作用12h后用预冷的PBS清洗细胞两次，用结合液重悬细胞并加入Annexin V-FITC避光孵育10 min，离心沉淀细胞后用结合液重悬，并加入PI冰上避光孵育5min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2.4 统计学方法
所有实验结果均是以3次独立实验数据分析所得。采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及方差分析。
3 结果
3.1 乳香挥发油对SW480细胞的增殖抑制
结果表明乳香挥发油对细胞抑制呈剂量依赖性(图1)，分别使用浓度的20μg/ml和40μg/ml的挥发油作用12h后抑制率分别为(22.8±3.1)%和(46.1±4.7)。在使用活性氧清除剂GSH后，抑制率减少到(18.7±2.5)%和(41.4±5.4)%。
图1 乳香挥发油及GSH对细胞的抑制作用
（vs Control: **P<0.01, *P<0.05; vs EOF(L): △P<0.05; vs EOF(L)+GSH: ▲▲P<0.01 ）
3.2 乳香挥发油诱导凋亡与ROS的生成增加有关
用流式细胞仪检测乳香挥发油对SW480细胞内的ROS的生成的影响(图2)。横坐标荧光强度代表ROS的生成量。结果表明乳香挥发油处理的SW480细胞ROS增加呈剂量依赖性(EOF(L) vs Control, P<0.01; EOF(H) vs Control, P<0.01; EOF(H) vs EOF(L), P<0.05)，而加入GSH可以减少ROS的生成(EOF(L)+GSH vs EOF(L) ,P<0.05; EOF(H)+GSH vs EOF(H), P<0.05)。
图2乳香挥发油和GSH对细胞作用下的ROS含量
3.3 流式细胞仪检测乳香挥发油SW480细胞的凋亡的影响
乳香挥发油作用细胞12h后通过流式细胞仪检测结果显示，对照组、低剂量组和高剂量组的细胞早期凋亡率为(5.8±0.9)%、(14.8±2.1))%和(27.5±2.9)%，呈剂量依赖性(EOF(H) vs EOF(L), P<0.01)，在加入GSH后，凋亡率分别为(8.3±1.9)%、(12.1±2.4)%和(23.3±2.0)%。使挥发油诱导的凋亡率下降(EOF(L)+GSH vs EOF(L) ,P<0.01; EOF(H)+GSH vs EOF(H), P<0.05)，证明活性氧在乳香挥发油诱导的细胞凋亡中发挥作用。
4 讨论
细胞内过量的ROS蓄积可以引起线粒体膜电位下降，直接诱导细胞凋亡 [3]。GSH被认为是平衡细胞内氧化还原状态的重要调节因子。抗氧化剂的加入则抑制凋亡的发生，表明ROS的生成在细胞凋亡中担任了重要的作用。很多抗肿瘤药物在启动肿瘤细胞凋亡过程前，细胞内GSH被耗竭，同时伴有活性氧的蓄积[4]。将SW480细胞在乳香挥发油作用前用GSH预处理，考察GSH对乳香挥发油诱导细胞凋亡的影响。结果表明，乳香挥发油所引起的SW480细胞凋亡作用可以被GSH抑制，即提示ROS在乳香挥发油诱导的SW480细胞凋亡过程中发挥了关键作用。总之，此次实验研究表明乳香挥发油可有效的诱导人结肠腺癌SW480细胞的凋亡发生，其凋亡机制还需要进一步深入研究。
参考文献：
[1]郭辉,张玲.乳香中化学成分和药理作用的研究进展[J]. 食品与药品,2007, 9:50-52
[2]赵金凤,周春兰,周凤琴等．乳香挥发性成分GC-MS分析[J].中国中药杂志，2011，8:112-116
[3]赵云罡,徐建兴.线粒体，活性氧和细胞凋亡[J]. 生物化学与生物物理进展,2001,02:168-171
[4]金春英,崔京兰.氧化型谷胱甘肽对还原型谷胱甘肽清除自由基的协同作用[J].分析化学,2009,09:1349-1353
基金项目：
黑龙江省卫生厅科技项目（2013-120）
通讯作者：
雪微，1986.03，硕士，从事抗肿瘤药物研究
作者简介：
郝雪微，1986.03，硕士，汉族，职称助教，籍贯黑龙江省绥化市，从事抗肿瘤药物研究
论文作者:郝雪微1,阮莹2,刘欣宇1,顾园竹1,李金桐1
论文发表刊物:《河南中医》2015年5月供稿
论文发表时间:2015/10/14
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