1南华大学附属永州临床学院（皮肤科） 420000；
2南华大学附属永州临床学院（肿瘤科） 420000
【摘 要】本文对PAI-1促进皮肤黑色素瘤侵袭转移的作用及机制进行研究，能够为皮肤黑色素瘤的治疗提供更加坚实的理论依据，为及时有效地对黑色素瘤侵袭转移进行控制提供更加科学的方法。皮肤黑色素瘤的侵袭转移是一项连续的多因素过程，从肿瘤细胞周围组织的据侵袭到进入机体脉管系统，再到最后到达周围组织并形成新的的肿瘤病灶。
【关键词】PAI-1；皮肤黑色素瘤；侵袭转移；作用机制
本文研究的旨在通过实验分析的方式对PAI-1在皮肤黑色素瘤中的表达及其在促进皮肤黑色素瘤侵袭转移当中发挥的作用进行明确，并明确PAI-1对肿瘤侵袭转移产生促进作用的机制。试验中通过皮肤外科手术活检方式确诊皮肤黑色素瘤患者，并新鲜获取其皮肤黑色素瘤标本。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究中于医院内部选取12例手术活检后，经病理检查确诊为恶性皮肤黑色素瘤的患者，选取病人的皮肤组织作为实验的样本资料。同时购买SK-MEL-31及A375恶性皮肤黑色素瘤细胞株，作为研究的材料。
1.2 仪器与实验方法
1.2.1 实验试剂与实验仪器
实验中使用的试剂有：碧云天生物技术研究公司生产的4％多聚甲醛、5％BSA、DAPI、防荧光淬灭封片剂、3％的H2O2、苏木精、二甲苯、二甲基亚砜，美国Santa Cruz公司生产的兔抗人单克隆抗体anti-PAI-1和兔抗人单克隆二抗，博奥森生物有限公司生产制造的兔抗人多克隆抗体anti-PAI-1和免疫组化二抗试剂盒，以及基因技术上海有限公司生产的DAB。实验中使用的主要仪器设备有倒置显微镜、甩片机、台式高速离心机、冰冻切片机、4℃冰箱和荧光显微镜。
1.2.2 实验方法
（1）皮肤黑色素瘤中PAI-1的免疫组化与免疫荧光检测
使用免疫组化及免疫荧光方法，对皮肤黑色素瘤中PAI-1的表达进行实验研究。免疫组化实验研究的步骤为：首先将制备的恶性皮肤黑色素瘤组织切片使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次冲洗时间为5min；随后将切片放到枸橼盐酸缓冲液容器当中，使用微波炉对容器进行加热，加热时温度设定为中档，保证容器中的枸橼盐酸缓冲液能够在沸腾的同时不会外溢，加热中保证容器内液体的温服保持在92℃～95℃，同时监测r容器中液体的沸腾状况，沸腾后10min～15min实施抗原修复，然后将容器取出，在室温条件下让液体自然库冷却；以上步骤完成之后，从容器中取出恶性皮肤黑色素瘤组织切片，将切片放到3％过氧化氢当中，在室温环境下进行10min的孵育，以此来消除组织切片当中内源性过氧化物酶的生物活性；随后将倒除3％过氧化氢溶液，把恶性皮肤黑色素组织切片放置到蒸馏水当中清洗三次，单次清洗时间是10分钟；以上步骤完成之后，把组织切片放置到5％BSA当中进行封闭处理，在室温环境中孵育10min后，去除恶性皮肤黑色素瘤组织表面残留的5％BSA；再将羊抗人单克隆anti-PAI-1以1：50的比例滴注到组织切片的表面，然后将组织切片放入到4℃冰箱中，孵育过夜；第二天从冰箱中取出组织切片，将表面物质去除，并使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次冲洗时间为5min；再用二抗试剂盒进行化学染色，再用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次冲洗时间为5min；随后对切片组织进行DAB显色，再用自来水进行冲洗后，使用苏木精进行5min复染，之后使用盐酸乙醇对组织切片进行分化处理，再用自来水反蓝处理；随后使用梯度酒精进行脱水处理，并使用二甲苯透明，最后将切片组织进行封片处理，并使用显微镜进行观察。
免疫荧光实验方法为：使用冰冻切片将恶性皮肤黑色素瘤切片组织切至8μm厚，将切片组织放到4％多聚甲醛中，在室温条件下固定30min，将组织切片表面的液体去除。
（2）划痕、转移与侵袭实验方法
首先，培养SK-MEL-31及A375恶性皮肤黑色素瘤细胞株。将细胞株放置在温度为37℃的5％CO2培养箱当中，使用DMEM培养液培养细胞株；当培养瓶中的细胞贴壁密度到达80％时，将培养基倒尽，并用磷酸缓冲盐溶液清洗3次；将1ml～2ml的0.25％胰酶消化溶液加入到50ml的培养瓶中，保证瓶中的细胞均能够浸入溶液，随后轻轻摇晃，并将其平放在超净台面上，在室温条件下消化5min，在消化过程中，使用显微镜及时观察监测细胞的消化状况，避免发生消化过度的状况；随后使用倒置显微镜观察细胞的状况，当发现贴壁细胞逐步变圆并周边变亮时，使用吸管吹打培养瓶底部使细胞脱落；随后加入2ml～3ml的完全培养基，使用吸管对贴壁细胞进行吹打，直至其成为悬液，形成单独的悬浮细胞，再用吸管把细胞移送到15ml的离心管中，使用离心机以1000rpm的频率离心处理5min，然后将去除上清液；最后使用10ml～15ml的新鲜培养基实施重悬细胞，同时将细胞分别装到三个培养瓶当中，在37℃环境下继续培养。
（3）免疫荧光实验和抗体阻断实验方法
免疫荧光实验方法：使用甩片机将恶性皮肤黑色素瘤细胞株甩到载玻片上，甩片机的频次为800rpm/min，再进行5min的离心处理，将样本离心至载玻片上，过程中使用显微镜观察细胞甩到载玻片上的稳定性和完整性，发现细胞仍旧在载玻片上游动时，应再次实施5min的离心处理，随后将样本在室温环境下静置15min，等待载玻片上的液体全部干透；将4％多聚甲醛滴加到载玻片上的细胞表面，在室温环境下固定30min之后，谨慎去除多余液体；使用PBS对载玻片细胞表面进行3次孵育处理，每次的时间为5min；上述步骤完成后，使用5％的BSA封闭液在室温环境下对载玻片上的细胞进行30min的封闭处理，并去除封闭液；将1：100稀释处理的兔抗人单克隆抗体anti-E-cadherin和小鼠抗人单克隆抗体anti-Vimentin加入其中，在30℃温度环境下孵育处理60min；之后取出样本使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，单次冲洗时间为5min；之后再加入羊抗小鼠CY3-IgG荧光二抗抗体和驴抗兔FITC-IgG荧光二抗抗体，室温条件下孵育1h，注意避光孵育处理；再使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，单次冲洗时间为5min；随后使用DAPI对细胞核进行5min的染色处理；再使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，单次冲洗时间为5min；之后使用防荧光淬灭封片剂实施封片，最后使用荧光显微镜进行观察。
1.3 统计学分析方法
对于研究中观察和测量的数据适应均数±标准差的方法进行表达，并使用SPSS17.0统计软件进行处理，数据资料使用t进行检验每当P＜0.05时，表明差异有统计学意义，若P＜0.01，则统计学差异十分显著。
2 结果
2.1 皮肤黑色素瘤中PAI-1的免疫组化与免疫荧光检测对比
通过免疫组化实验观察分析皮肤黑色素瘤中PAI-1的表达能够发现，在恶性皮肤黑色素瘤病人的样本中，PAI-1阳性细胞组织的分布主要是集中在恶性肿瘤细胞的表面以及细胞间质当中的非肿瘤细胞之上，如下图1。
图11 外源性PAI-1刺激下p65表达的变化情况
3 讨 论
肿瘤的特异性是指不同种类和分型的肿瘤细胞，各自具有差异性的基因表达和表型特征，当外界刺激达到一定的条件时，部分肿瘤细胞就会发生侵袭转移。相关研究分析认为，肿瘤的侵袭转移还具有一定的器官特异性，也就是某些肿瘤会更加倾向于特定的器官进行转移。不同肿瘤侵袭转移途径的实现，均要以肿瘤细胞的运动转移能力为基础，也是发生细胞转移的根源性因素。上皮-间质转化与恶性肿瘤侵袭转移具有较强的相关性，尤其是在乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌等恶性肿瘤疾病的侵袭转移中会产生重要的影响，进而对疾病的发展恶化产生显著影响。
PAI-1在恶性皮肤黑色素肿瘤中的高表达，通过免疫组化和免疫荧光实验得以证实，接下来是分析PAI-1在恶性皮肤黑色素瘤侵袭转移当中发挥的作用。当下在研究恶性肿瘤细胞侵袭转移的实验方法主要有划痕实验、转移实验和侵袭实验三种方式，其中划痕实验能够观察分析肿瘤细胞的运动性及其特征，通过肿瘤细胞向致伤部位的转移来评价肿瘤细胞的运动能力。转移和侵袭实验是利用Transwell小室进行研究，利用Transwell小室间聚碳酸酯膜的通透性，通过观察分析上室中细胞的运动状况，分析下层培养液中细胞因子对细胞生长以及运动的影响。侵袭实验与转移实验的区别在于使用Matrgel基质胶，利用其对细胞基底膜结构、成分、物理特征以及功能的模拟作用，实现对肿瘤侵袭转移的研究。
上皮-间质转化现象在多种肿瘤细胞侵袭转移中的作用被逐渐认知，丰富的研究数据表明，上皮-间质细胞转化现象属于肿瘤细胞侵袭转移的早期重要表现之一，尤其是肿瘤细胞表面E-cadherin蛋白表达的明显减弱，能够成为肿瘤细胞侵袭转移的重要标志之一。E-cadherin分子属于一种黏附分子，对于细胞之间相互聚集具有显著的介导作用，若存在Ca2＋，则可以再蛋白酶水解中发挥显著的抵抗作用。相关人员在其研究中指出，E-cadherin分子在许多种上皮源性的肿瘤细胞当中，会出现表达显著下降的状况，或是分子功能出现显著的缺失，同时与肿瘤细胞的侵袭转移具有密切的关系。相关研究人员指出，E-cadherin在胃癌、乳腺癌以及肠癌等肿瘤组织当中，其表达出现显著下降的趋势，并且这种下降趋势与肿瘤细胞的侵袭转移具有密切关系，E-cadherin能够成为肿瘤细胞侵袭转移的标志物之一。
本文对PAI-1促进皮肤黑色素瘤侵袭转移的作用及机制进行研究，首先对比皮肤黑色素瘤中PAI-1的免疫组化与免疫荧光检测结果，通过实验证明了PAI-1在皮肤黑色素瘤当中的高表达；再通过划痕、转移及侵袭实验证明了外源性PAI-1与过表达PAI-1对皮肤黑色素瘤侵袭转移的显著作用；最后研究表明PAI-1促进皮肤黑色素瘤侵袭转移作用的反应机制，是经由NF-kB信号通路促进上皮-间质转化现象的发生，进而对恶性皮肤黑色素瘤的侵袭转移产生影响。针对PAI-1在恶性皮肤黑色素瘤侵袭转移中的作用和机制，在治疗中采取新的治疗方向与办法，能够在患者的疾病治疗和预后中发挥积极作用。
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论文作者:蒋辉1,江拥军2
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年8期
论文发表时间:2018/11/27
标签：细胞论文; 皮肤论文; 肿瘤论文; 黑色素瘤论文; 切片论文; 组织论文; 免疫论文; 《兰大学报（医学版）》2018年8期论文;