李凯龙[1]2016年在《褐飞虱蜕皮及变态信号途径相关基因的功能分析》文中研究说明褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)属半翅目飞虱科,是我国和许多亚洲国家水稻生产上的重要害虫。调控昆虫蜕皮和变态的主要信号通路为蜕皮激素信号通路和保幼激素信号通路,本研究在基因组和转录组数据的基础上,对褐飞虱核受体基因、蜕皮激素和保幼激素信号通路基因的保守结构域、系统发育关系和基因表达模式等进行了研究,并利用RNA干扰技术研究了褐飞虱蜕皮和变态信号通路上主要基因的功能,主要研究结果如下:1、本研究基于基因组和转录组数据搜索得到了褐飞虱蜕皮与变态信号途径相关基因,包括蜕皮激素合成基因、蜕皮激素受体基因、受体转运蛋白基因、变态决定因子、保幼激素合成基因、保幼激素早期诱导基因和保幼激素信号通路下游基因。并搜索得到了褐飞虱体内具有20个核受体家族基因(包括蜕皮激素响应基因Nl E75、Nl HR3和Nl FTZ-F1)。2、本研究克隆得到了5个蜕皮激素合成的Halloween基因(Nl Cyp307、Nl Cyp306a1、Nl Cyp302a1、Nl Cyp315a1、Nl Cyp314a1)、蜕皮激素受体基因Nl USP的2个转录本、1个蜕皮激素受体转运蛋白基因Nl Ran、蜕皮激素前期响应基因Nl E75的5个转录本、蜕皮激素中期响应基因Nl HR3的2个转录本、蜕皮激素中后期响应基因Nl FTZ-F1的2个转录本、2个保幼激素合成基因(Nl JHAMT和Nl FAMe T)、2个保幼激素信号通路基因(Nl Broad-C和Nl Kr-h1)、1个变态决定因子Nl E93。分析了各个基因的开放阅读框、预测氨基酸序列、理化特性、跨膜区域、保守结构域和基因结构,初步预测了其功能地位。3、实时荧光定量PCR检测这些基因的时空表达模式结果显示,5个蜕皮激素合成基因在5龄蜕皮后的24h和60小时出现两个表达峰值从而控制蜕皮激素滴度的波动,进而完成对褐飞虱生长变态的调节作用;蜕皮激素受体、Ec R核转运基因、蜕皮激素信号转导基因均在蜕皮期间高表达,协调褐飞虱的若虫-若虫和若虫-成虫的蜕皮过程,是褐飞虱蜕皮和变态的必需条件;Nl E93和Nl Kr-h1在不同时间段呈反向表达动态,这种表达平衡反映它们之间的相互抑制作用并保证了褐飞虱在正确时间点发生变态过程。4、本研究通过RNAi验证了这些基因的生物学功能,结果表明Nl Cyp314a1、Nl USP、Nl Ran、Nl E75、Nl HR3和Nl FTZ-F1对褐飞虱完成蜕皮过程是不可或缺的。分别将这6个基因干扰后,褐飞虱若虫都会出现蜕皮困难的致死表型:旧表皮自胸背板处开裂但并未全部褪去,旧表皮蜕不下来在尾部形成拖尾而出现双层表皮结构,或旧表皮并未开裂但虫体变细长,并最终蜕皮失败死亡。此外我们还发现,Nl Cyp314a1基因干扰后褐飞虱卵母细胞的发育畸形、卵黄原蛋白的产生或填充受阻;Nl Ran基因干扰后褐飞虱卵巢发育畸形,无正常的卵和卵壳形成,无后代孵化;Nl HR3被干扰后也会导致褐飞虱卵巢发育畸形,卵巢中的卵为椭圆形小卵。Nl E93和Nl Kr-h1对褐飞虱完成正常的变态过程具有决定作用。干扰Nl Kr-h1后会有早熟畸形虫(若-成中间体)褐飞虱的出现,而干扰Nl E93基因后会有超级若虫6龄褐飞虱的出现。再结合两者的龄期定量结果,可以发现Nl Kr-h1能抑制变态的发生,而Nl E93的表达是褐飞虱变态起始地决定因子,两者的平衡在褐飞虱变态中起到关键作用并决定褐飞虱在适当的时间点进行变态。同时我们对干扰后各个基因及其相关基因的表达量进行了检测,初步分析了蜕皮激素和保幼激素级联反应中各个基因的作用关系。基于上述研究结果,我们构建了褐飞虱体内蜕皮和变态信号转导通路模式图,包括蜕皮激素的合成、蜕皮激素受体、蜕皮激素响应基因的信号转导的通路以及Nl E93和Nl Kr-h1的互作调控变态的信号转导通路。为进一步了解蜕皮和变态信号转导通路在褐飞虱生长发育中的功能奠定了基础,为在基于RNAi的褐飞虱的防治中筛选合适靶标提供了重要的参考信息。
张磊[2]2015年在《褐飞虱SRAP标记连锁图谱构建和致害性表型的分析》文中提出褐飞虱(Nilaparvata lugens St?l,Hemiptera:Delphacidae)是水稻生产上主要害虫之一,它一方面通过直接的去取食水稻韧皮部的汁液从而对水稻造成危害,另一方面充当一些病毒的传递媒介危害水稻的正常发育。通过种植含有抗性基因的水稻是防治褐飞虱的一种有效方法,但是褐飞虱能够与抗性水稻协同进化,从而很快地克服并适应抗性水稻,演化出新的生物型继续危害水稻,这种生物机制使得褐飞虱的防治面临巨大的挑战。运用分子遗传学的理论和技术能够揭示褐飞虱致害性的遗传变异规律。本研究使用两种不同生物型的褐飞虱结合相关序列多态性标记构建褐飞虱遗传连锁图谱,并通过四种致害性相关的表型评价田间群体褐飞虱个体的致害性。同时开发白背飞虱基因组微卫星标记,填补该领域的研究空白。研究结果如下:1.对近交系生物型1和生物型2的褐飞虱与致害性相关的三个表型进行鉴定:若虫选择性分析表明生物型1褐飞虱更倾向于感性水稻TN1,生物型2褐飞虱对感性水稻TN1和含抗性基因Bph1的水稻Mudgo没有明显偏好;若虫的存活率分析表明生物型1褐飞虱在TN1上高于Mudgo,且两者存在显著差异,而生物型2在两种水稻上没有显著差异;雌虫的72 h体重比分析结果表明在TN1上生物型1的体重比(0.88)和生物型2的(0.91)没有明显差异(P=0.669),在Mudgo上生物型1体重比(0.8)低于生物型2(0.95),且两者有极显著型差异(P=0.001)。致害性表型的差异预示两种不同的生物型褐飞虱在基因组水平上存在明显的差异,适合作为作图群体的亲本。2.采用L16(45)正交试验设计,对褐飞虱SRAP-PCR反应体系中的5个因素Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度,进行4水平的优化,从而确立褐飞虱SRAP-PCR最优的反应体系。最佳的褐飞虱SRAP-PCR反应体系是:总体积为10μL,Mg2+浓度3 mmol/L、dNTPs为150μmol/L、Taq DNA聚合酶2 U、正反向引物各0.3μmol/L、DNA用量25 ng以及1×PCR Buffer。使用生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体对优化后的褐飞虱SRAP-PCR反应体系进行验证,获得了条带清晰、多态性丰富的图谱,并发现共显性条带,因此表明确立的反应体系稳定可靠。3.以近交14代生物型1的雄虫和近交9代的生物型2雌虫为亲本,构建包含92个雌性个体的f2作图群体,并使用98对在亲本间具有多态的srap标记组合对该群体进行基因型分析,然后使用jionmap4和mapchart2.2软件进行连锁分析和绘制连锁图。最终构建了褐飞虱以srap分子标记为基础的遗传连锁图谱,其中由14个连锁群组成,包含188个位点,总长度为600.6cm,标记间的平均间隔3.12cm,图谱的覆盖率为81.9%。4.使用构建遗传连锁图谱的98对srap引物组合分别对取食水稻的五种生物型(t、m、a、y、p)褐飞虱、一种取食杂草李氏禾的李氏禾生物型(j)褐飞虱,以及两种褐飞虱的近缘物种拟褐飞虱(n)和伪褐飞虱(l),进行基因型分析,总共得到了600条多态性条带,平均每对引物组合有6.1条条带,最后进行聚类分析。在聚类图中,在0.5到0.82的范围内进行聚类,分为两大组,第一组为是褐飞虱种内的6种生物型,第二组为两种褐飞虱的近缘物种伪褐飞虱和拟褐飞虱。在第一组中取食水稻上的5种生物型聚在一起,而李氏禾褐飞虱单独一支,5种水稻褐飞虱中,生物型1和生物型3聚在一起,而生物型2、生物型y和生物p聚在一起,生物型y和p在里面有单独分为一支。在水稻褐飞虱中的聚类刚好和致害性的强弱相对应,表明这些多态性的标记可能与褐飞虱致害性相关。5.使用田间群体的152个褐飞虱,在以9311为背景的抗褐飞虱基因bph9的近等基因系植株上对褐飞虱的蜜露量、蜜露ph、体重增量和腹部发育四种与致害性相关的表型进行分析。以48h蜜露量大于10㎎、48h体重增量大于1㎎、蜜露量ph大于8和48h腹部隆起为凸状的褐飞虱的为致害性个体。发现蜜露量和体重增量都可以确定30个致害性个体,且这30个个体中同时满足两种指标的个体数为27,达到90%。对蜜露量和体重增量的相关性分析,相关系数r=0.808(p<0.01),为极强相关;利用蜜露ph指标鉴定出2个非致害性个体和20个致害个体,2个非致害性个体的蜜露量和体重增量的表型同样为非致害性,但是20个致害性个体的蜜露量和体重增量的表型表现为致害性为60%和65%;利用腹部发育指标共鉴定出32个致害性个体,蜜露量、体重增量和蜜露pH表型表现为致害性的分别为84.3%、90.6%和100%。经过分析,本研究认为只有在48 h体重增量为1㎎且蜜露量也达到10㎎才能确定为致害性个体。6.白背飞虱同样是对水稻危害极大的害虫之一。到目前为止没有任何的SSR标记的研究报道,为了填补这一领域的空白,本研究使用磁珠富集快速分离技术开发了18对多态性的基因组SSR标记,通过在武汉田间32个雌性个体的自然群体分析发现等位基因个数有2到15个,平均7.3个等位基因,观测杂合度从0.094到0.871,平均值为0.572,预测杂合度从0.148到0.924,平均0.633。跨物种检测发现,新开发的18对微卫星标记在褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱通用性很高。开发的这些多态性SSR标记对以后白背飞虱的群体遗传学和生态学研究提供重要工具。
张小磊, 廖逊, 毛凯凯, 万虎, 卢鹏[3]2016年在《湖北稻区褐飞虱田间种群对常用杀虫剂抗药性监测》文中研究表明【目的】明确目前褐飞虱Nilaparvata lugens田间种群对常用防治药剂的抗性现状,为制定褐飞虱的科学用药策略提供科学依据。【方法】于2009-2014年采用稻茎浸渍法监测了湖北褐飞虱武穴梅川、枣阳十里铺、孝感陈店、鄂州长港和武汉江夏稻田的褐飞虱田间种群对11种杀虫剂的敏感性。【结果】湖北稻区褐飞虱田间种群已对吡虫啉(抗性倍数RR=101.8~1 239.4)、噻嗪酮(RR=15.9~1 326.3)产生高水平抗性;对噻虫嗪(RR=24.9~146.5)产生中等水平至高水平抗性;对噻虫胺(RR=9.9~16.5)、呋虫胺(RR=13.5~15.9)、乙虫腈(RR=18.3~60.4)、毒死蜱(RR=17.4~29.8)、异丙威(RR=13.9~46.0)产生中等水平抗性;对啶虫脒(RR=5.1~9.9)产生低水平抗性;对噻虫啉(RR=3.9~7.1)处于敏感至低水平抗性水平;对醚菊酯(RR=1.3~4.9)处于敏感水平。此外,褐飞虱对噻虫嗪、噻嗪酮抗性上升明显,同时褐飞虱对吡虫啉抗性也有上升的趋势。【结论】仍需暂停吡虫啉、噻嗪酮在水稻上防治稻飞虱,严格限制吡蚜酮在水稻上的使用次数;醚菊酯可作为吡虫啉、噻嗪酮和吡蚜酮的替代药剂或轮换药剂。
周会[4]2015年在《褐飞虱属几个种的遗传基础研究》文中指出褐飞虱是重要的水稻害虫,每年对粮食生产带来了巨大的损失。褐飞虱与水稻存在协同进化,含有致害基因的褐飞虱也容易发生变异,对水稻造成严重的危害。因此,通过分子手段和细胞学手段,对变异褐飞虱的亲缘关系研究意义重大。本研究从ITS序列,重复序列,染色体数目几个方面对褐飞虱遗传基础进行了研究。具体内容如下:1,通过提取DNA以及PCR扩增褐飞虱ITS序列的方法来得到褐飞虱属相关种的ITS扩增产物,经克隆测序而得到他们的碱基序列,在NCBI上对数据的可靠性进行检验后通过Clustal X对不同来源的褐飞虱ITS序列进行比对,利用软件DNASPversion对碱基组成和变异位点进行了统计,用MEGA4.0对上述序列进行了碱基含量的分析、多态位点分析以及进化树的构建,并用RNAstructer软件对其ITS1和ITS2二级结构进行了预测。结果发现:生物型3(A)、生物型1(T)、生物型2(M)、李氏禾褐飞虱(J)四种生物型的褐飞虱亲缘关系紧密,它们与拟褐飞虱(N)和伪褐飞虱(L)相比较而言,与拟褐飞虱(N)的亲缘关系较近。通过多序列比对发现,在其ITS1序列中存在3处较大的变异。相对于ITS1来说ITS2较为保守,没有大片段的插入缺失,多为单碱基的变异。3种褐飞虱的ITS1有三种构型,同一个种的不同生物型之间ITS1构型一致。3个种的ITS1的二级结构都由4个臂区和1个中间环组成。3种褐飞虱的ITS2二级结构差异较大,有四种构型,但是褐飞虱的4个生物型的ITS2二级结构都由6个臂区和一个中间环组成,拟褐飞虱由5个臂区和1个中间环组成,伪褐飞虱由4个臂区和一个中间环组成。对褐飞虱各种之间的亲缘关系与进化关系的研究不仅对褐飞虱的种属关系得到了更为全面的认识,更重要的是对水稻危害的防治的研究也具有非常重要的意义,因为ITS1、ITS2参与核糖体的构成,调控特定的反应,对基因的转录,翻译都有一定的影响。2,利用重悬法对田间褐飞虱(主要为生物型2(M))幼虫进行了有丝分裂染色体和减数分裂染色体的制备,观察,统计以及相应的分析,结果发现褐飞虱染色体数目为30(2n=28+XY)条,有些细胞会有染色体的丢失(亚倍性),在亚倍体中丢失一条染色体的概率较大。通过统计发现,亚倍性要多于假多倍性。XY染色体分布在常染色体组成的中空环的边缘,X染色体交Y染色体长,长度约为其2倍。X染色体相对长度为6.81,Y染色体相对长度为3.44,在染色体组长度的排名中分别占据第6位和第15位。最长的和最短的染色体的比值(染色体长度比)为3.13。通过对褐飞虱染色体有丝分裂和减数分裂时期的细胞学特征的研究了解到了褐飞虱的遗传关系,为此物种遗传分离和繁殖行为现象解释提供非常重要的线索或依据,并掌握了基本的核型情况。3,对褐飞虱生物型1(T)基因组进行了Solexa高通量测序,随机挑选了5100万个读长的末端进行分析,通过Novak等的相似碱基读长聚类方法对重复序列进行了鉴定,并通过BMC生物信息学软件对重叠读长进行聚类(分组)。通过分析得到的重复序列,在NCBI的primer-BLAST中获得相应的引物序列。对基因组DNA进行扩增,获得相应的串联重复序列,并以此进一步合成探针,在生物型2(M)染色体上进行定位。荧光原位杂交实验结果表明,CL33在染色体上有4对杂交信号,CL38,CL13在染色体上有2对杂交信号,CL55,CL62在染色体上有1对杂交信号。CL33的4对杂交信号有2对位于染色体对的末端,2对位于染色体的近着丝粒处。CL13,CL38,CL55,CL62的杂交信号位于染色体的末端。CL13,CL33,CL38,CL55,CL62占总染色体组的百分比分别为14.96%、2.11%、8.88%、5.56%、1.69%。将测序所得的序列经过NCBI比对之后发现,CL33中有部分序列与褐飞虱ag-75克隆微卫星序列以及irp2 mRNA胰岛素相关多肽2部分片段重叠。CL13中有部分片段与锥蝽克隆TDAK76以及TDAK51微卫星序列部分片段重叠。cl38中有61bp的序列与褐飞虱中隔离NLMSRDA11甲基化片段的基因组序列相同,68bp-125bp与褐飞虱中隔离NLMSRDA4甲基化片段的基因组序列部分片段相似度达86%。CL55中有部分序列与野猪BAC克隆KNP_1159H5以及阿里山潜蝇茧蜂的跨膜9超家族成员2的转录变异X2的mRNA部分片段重叠。CL62中有部分片段与转移功能有关的家族1成员3(mta3)的转录变异X3的mRNA的部分序列重叠。
唐耀华[5]2016年在《褐飞虱体内组氨酸合成基因的研究》文中认为褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)是我国水稻上的主要害虫,专一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻筛管液。褐飞虱必需氨基酸的营养来源颇受关注,一般认为与体内共生菌有关。利用基因组和转录组数据,前人初步构建了褐飞虱及其体内类酵母共生菌(YLS)参与必需氨基酸的合成途径。组氨酸是必需氨基酸的一种,本文进一步对其合成途径的相关基因进行了克隆和来源分析,并利用RNAi技术研究了部分重要基因在褐飞虱生长、发育和存活中的作用。结果分述如下:1.组氨酸合成基因的克隆与来源分析本研究利用生物信息学手段,从褐飞虱类酵母共生菌基因组中预测得到合成组氨酸的7个基因,通过RT-PCR克隆得到了全部序列,分别命名为EdeHis1、EdeHis2、EdeHis3、EdeHis4、EdeHis5、EdeHis6和EdeHis7。序列比对、相似性分析结果表明这7个基因与真菌基因同源。系统进化分析表明7个基因均与肉座菌目真菌在进化关系上最为相近。采用褐飞虱中肠、头、足、体壁、卵巢和脂肪体c DNA作为模板,进行定量PCR分析,结果表明在含有类酵母共生菌的腹部脂肪体中的表达量显著高于中肠、头、足和体壁中的表达量。另外,利用褐飞虱头、翅和腹的基因组DNA作为模板,进行普通PCR扩增,在不含YLS的头和翅中不能扩增出片段。综合这些结果,我们认为克隆得到的这7个组氨酸合成基因均来源于YLS而非褐飞虱或者ARS。在此基础上,我们进一步构建了褐飞虱体内组氨酸合成通路。2.组氨酸合成关键基因EdeHis1的研究选择组氨酸合成关键基因EdeHis1进一步研究。注射浓度为0.05、0.5和1.5μg/μL的dsEdeHis1,不管是饲养于水稻苗还是缺组氨酸的人工饲料上,在第三天时,目的基因的表达量与对照相比均显著下调。两种食物对EdeHis1表达量的影响不显著(p=0.22)。另外,EdeHis1的沉默导致褐飞虱体内游离组氨酸含量显著低于对照组,且初羽化雌雄成虫的体重显著低于对照,表明EdeHis1参与了褐飞虱体内组氨酸的合成,且与褐飞虱的生长发育有关。通过注射和喂食不同浓度的组氨酸,发现组氨酸的缺失引起EdeHis1表达量的上调,而组氨酸的过量抑制其表达。但注射或饲喂不同浓度的外源组氨酸,褐飞虱体内的游离组氨酸与对照无显著差异,表明褐飞虱体内的组氨酸含量有一个动态调节机制。另外,利用原核表达的EdeHis1蛋白,经葡聚糖凝胶层析技术研究表明,外源组氨酸的存在导致EdeHis1构型由二聚体形式转变为六聚体。3.组氨酸合成基因EdeHis2及EdeHis6的研究EdeHis2、EdeHis6基因也是组氨酸合成中的重要基因,RNA干扰结果表明,注射dsEdeHis2或dsEdeHis6后,褐飞虱的死亡率显著升高、若虫发育历期有所延长,这表明干扰EdeHis2或EdeHis6对褐飞虱生长、发育、存活有一定的负面作用。另外,干扰EdeHis6后,部分褐飞虱表现为翅畸形,雌雄虫表现有所差异,其中雌虫有11%的翅发育不完全,雄虫有13%的翅呈现弯折,表明EdeHis6在褐飞虱翅发育中可能具有重要的作用。
王树叶[6]2011年在《中国飞虱族瓶额飞虱亚族昆虫分类研究（半翅目：蜡蝉总科：飞虱科）》文中研究说明本文是中国飞虱族Delphacini瓶额飞虱亚族Numatina昆虫的分类研究论文。文中概述了该亚族国内、外分类研究历史及现状;介绍了该亚族的分类特征以及各特征在分类研究中的应用、材料来源和研究方法、经济意义,并对中国瓶额飞虱亚族昆虫区系作了简要分析。分类部分系统记述了中国瓶额飞虱亚族77属、157种,其中包括1新记录属、4新种及5中国新记录种,编制了分属和分种检索表,提供了中国103种成虫背面、侧面观及颜面特征图,绘制了新种的雄性外生殖器特征图;文末附有参考文献和学名索引。新种和新记录种如下:新记录属:特里飞虱属Trichodelphax Vilbaste, 1968新种:叉突扁角飞虱Perkinsiella furatua sp. nov.,单突新叉飞虱Neodicranotropis monoprocessis sp. nov.,无刺星飞虱Hadeodelphax nonspinois sp. nov.,腹弯长跗飞虱Kakuna venterocurva sp. nov.新记录种:等突芋飞虱Tarophagus persephone (Kirkaldy, 1907)、奇异扁角飞虱Perkinsiella miriamae Emeljanov, 1987、三裂叉飞虱Garaga trifurca Guo et Liang 2004、普思黎氏飞虱Ribautodelphax pusilla Emeljanov, 1972、卢氏特里飞虱Trichodelphax lukjanovitshi (Kusenzov, 1929)。新种的模式标本均保存在西北农林科技大学昆虫博物馆(NWAFU)。
胡新娣, 杨静波, 李湘民, 魏洪义[7]2018年在《不同水稻品种对褐飞虱的抗性评价》文中研究表明【目的】调查目前江西主栽水稻品种对褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)的抗性级别,为抗褐飞虱水稻品种的选育、推广和褐飞虱的防治提供基础数据。【方法】采用标准苗期集团筛选法,评价了江西推广的25个水稻品种(3个早稻品种,15个中稻品种,7个晚稻品种)苗期和成株期对褐飞虱的抗性。【结果】早稻品种苗期和成株期的抗级为7级(感虫)或9级(高感);中稻品种中隆两优534和五山丝苗苗期抗级为5级(中抗),但成株期抗性丧失,其余品种苗期、成株期的抗性等级为7级(感虫)或9级(高感);晚稻品种高优红88和丰源优2297苗期抗级分别为7级(感虫)和9级(高感),成株期抗级均为5级(中抗),其余品种苗期、成株期的抗级为7级(感虫)或9级(高感)。【结论】目前在江西普遍种植的水稻品种中,多为感虫和高感品种,抗性品种较少,且抗性不高。
吕璐[8]2013年在《褐飞虱线粒体基因组与适应性进化的研究》文中提出褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是属于半翅目飞虱科(Hemiptera: Delphacidae)的昆虫,也是重要的水稻害虫,它可以直接取食水稻或是将病菌和病毒传给水稻,影响水稻的生长和发育,给粮食生产带来巨大的损失。目前,随着抗虫水稻品种的日益丰富,能够克服寄主抗性而产生适应性进化的各种褐飞虱生物型群体也层出不穷,给虫害防治带来新的困难。从分子进化学的角度研究褐飞虱生物型及其近缘物种的褐飞虱属昆虫,能够揭示褐飞虱生物型的遗传变异和对抗性水稻寄主适应性进化的规律,为制定科学有效的防治策略提供理论依据。线粒体基因组是目前进行动物基因组学和分子进化研究的理想材料,具有基因组小、组成稳定、母性遗传和很少发生重组等特征,也为系统发育等研究提供了丰富的分子标记。本研究首次对褐飞虱属七个昆虫群体(褐飞虱生物型1、2、3、Y、L,伪褐飞虱和拟褐飞虱)的线粒体全基因组进行扩增、测序及注释,利用比较基因组学和生物信息学等方法分析了褐飞虱属昆虫线粒体基因组的结构特征及种内种间的异同点,并结合已测序的其他24种半翅目昆虫的线粒体基因组数据对系统发育关系进行了研究。褐飞虱属昆虫的线粒体基因结构一致,包含37个编码基因和一段非编码的控制区,其蛋白质编码基因的排列顺序和转录方向与已有报道的半翅目昆虫基本一致,但是与飞虱科另一种昆虫灰飞虱Laodelphax striatellus相比tRNA基因trnHis发生了基因重排的现象。褐飞虱属昆虫线粒体基因组各个组成成分的碱基组成均存在很强的A+T含量偏向性,表明线粒体基因组具有很强的GC→AT的进化选择压力。褐飞虱属昆虫线粒体基因组的其蛋白质编码基因都使用ATN作为起始密码子,多数基因使用完整的三联密码子TAA或TAG作为终止密码子,少数使用不完整的T为终止子；且在蛋白质编码基因中,密码子和氨基酸的使用也都具有很强的偏向性,其中NNT和NNA密码子的使用频率非常高,而含量最高的四种氨基酸分别为Leu, Phe, Ile和Ser。比较褐飞虱属七个昆虫群体发现,在线粒体基因组大小、基因同源性、碱基组成、氨基酸组成、密码子的使用、基因间隔区和重叠区长度等方面,褐飞虱种内的五种生物型之间存在微小的差异,但其差异远远小于与伪褐飞虱以及拟褐飞虱相比的种间差异。从线粒体基因组进化角度来看,在同一个昆虫种内产生不同的生物型或群体的一个重要内因就是线粒体基因组中蛋白质编码基因的核苷酸的突变；再加上其他一些变化的积累可能对一个新物种的产生起了重要作用。基于线粒体基因组中13个蛋白质编码基因的核苷酸及氨基酸序列的联合数据及构建了半翅目昆虫的系统发育树,采用BI和ML分析方法,所得的拓扑结构类似。结果显示褐飞虱种内的五个生物型群体聚在一起,其次是伪褐飞虱与拟褐飞虱；而蜡蝉亚目与胸喙亚目及异翅亚目是姐妹群,这与前人的研究结果基本一致。除了线粒体基因组,我们还选择了30个核基因,在褐飞虱属七个昆虫群体中扩增并测序,结合线粒体基因组的13个蛋白质编码基因,按基因功能进行分类计算基因非同义突变率与同义突变率的比值(Ka/Ks)。结果显示,与取食李氏禾的野生的褐飞虱属昆虫群体相比,寄主转移到栽培水稻上的褐飞虱生物型群体氧化磷酸化及消化解毒相关基因有更高的Ka/Ks值,这预示着与对照基因相比,褐飞虱体内的氧化磷酸化及消化解毒相关基因与寄主转移的发生密切相关,因此寄主转移到栽培水稻的褐飞虱体内相关基因受到环境和寄主的正向选择作用。此外,与取食李氏禾的野生的褐飞虱生物型L相比,在更短时间内发生寄主转移到抗虫水稻上的褐飞虱生物型群体,其线粒体编码基因和部分核基因却有着更快的碱基突变率,说明寄主转移到抗性水稻上的褐飞虱线粒体及核基因组迅速的发生了适应性进化,而人工培育的抗性水稻加速了褐飞虱基因组的进化。本研究从昆虫适应性进化的角度为植物-昆虫的协同进化提供了有力的分子生物学证据,揭示了昆虫的寄主适应性进化机制和物种多样性及新物种形成的机制,同时为农业害虫的防治奠定了基础。
朱友理[9]2012年在《褐飞虱四个发育相关基因的克隆与mRNA表达分析》文中研究指明褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)属同翅目Homoptera飞虱科Delphacidae,是亚洲国家的一种重要水稻害虫。目前,化学防治仍是控制褐飞虱的首要选择。然而,大量化学药剂的不合理使用已导致褐飞虱对包括有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类、苯基吡唑类杀虫剂和一些昆虫生长调节剂在内的多种杀虫剂产生了抗药性,且部分杀虫剂造成褐飞虱天敌群落破坏以及亚致死剂量杀虫剂刺激褐飞虱生殖,由此引发的褐飞虱再猖獗问题已经引起了广泛关注。组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶以及液泡型H+-ATPase (V-ATPase)在昆虫生长发育过程中具有重要作用。本文对组蛋白乙酰转移酶ELP3和Mof,去乙酰化酶HDAC3及V-ATPase d亚基等几个与昆虫生长发育相关基因进行了克隆和序列分析,并研究了这些基因在褐飞虱不同发育阶段的mRNA表达动态以及亚致死剂量三唑磷对其表达水平的影响。采用RT-PCR和RACE技术获得了褐飞虱ELP3、Mof、HDAC3和V-ATPase基因的全长cDNA序列。ELP3的开放阅读框长1656bp,编码551个氨基酸,预测分子量63.06251kDa。Mof的cDNA序列全长1440bp,包括编码450个氨基酸的1353bp开放阅读框,预测分子量53.44258kDa。HDAC3的开放阅读框长1299bp,编码433个氨基酸,预测分子量49.07634kDa。V-ATPase d亚基基因的cDNA序列长1247bp,包括编码349个氨基酸的1050bp开放阅读框,预测分子量39.52216kDa。SMART在线分析发现,ELP3含有延伸因子Elp3结构域和乙酰转移酶Pfam:Acety ltransf_1结构域,Mof含有CHROMO结构域、乙酰转移酶结构域Pfam:MOZ_SAS和锌指结构域ZnF_C2H2, HDAC3含有一个Pfam:Hist_deacetyl结构域和Blast:STYKc结构域,V-ATPase基因含有一个Pfam:vATP-synt_AC39结构域。多重序列比对表明,褐飞虱ELP3、Mof、HDAC3和V-ATPase基因与其他昆虫同源基因具有很高的序列一致性。通过荧光定量PCR研究了这些基因在褐飞虱不同发育阶段的mRNA表达动态。结果表明,ELP3基因在所有发育阶段以长翅雌虫表达水平为最高,在4龄若虫中的表达水平最低。其中,雌虫的表达量显著高于雄虫表达量,若虫ELP3基因表达水平以1龄若虫为最高。Mof基因在若虫阶段的表达无明显差异；在成虫中,雌虫表达量显著高于雄虫,其中又以长翅雌虫表达量最高,长翅雄虫表达量最低。HDAC3基因在雌成虫中的表达水平显著高于雄虫的表达,各发育阶段的相对表达量又以长翅雌虫为最高。V-ATPase基因在2龄若虫的表达水平有一个峰值,然后开始下降,在短翅雄虫中的表达水平达到一个相对较低的水平。通过荧光定量PCR分析了亚致死剂量三唑磷对相关基因表达水平的影响,结果表明：羽化1天后,LD30三唑磷处理的短翅雌虫ELP3基因相对表达量显著上升为对照的1.60倍,长翅雌虫表达量显著下降至对照的0.31倍。羽化3天后,LD30处理短翅雌虫ELP3相对表达量显著上升,是对照的2.03倍,而长翅雌虫ELP3相对表达量显著降为对照的0.57倍。羽化1天后,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雄虫Mof基因表达量显著下降,分别是对照的0.43和0.61倍；LD30处理的长翅雌虫和雄虫Mof相对表达量显著降低,分别是对照的0.52和0.70倍。羽化3天后,LD1o三唑磷处理的雄虫Mof相对表达量显著降低,是对照的.52和0.54倍。羽化1天后,LD30三唑磷处理短翅／长翅雄虫HDAC3基因相对表达量显著下降,是对照的0.67、0.65倍。羽化3天后与对照相比,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雌虫体内HDAC3表达量显著上升,相对表达量分别是对照的1.94和2.00倍；长翅雄虫HDAC3表达水平比对照显著减少,其相对表达倍数分别是对照的0.37和0.69倍。羽化3天后,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雄虫V-ATPase d亚基基因的表达显著升高,其相对表达倍数分别是对照的2.15和2.46倍。
谭椰[10]2014年在《水稻水分胁迫对褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为影响及其生理研究》文中指出褐飞虱Nilaparvata lugens (St l)是亚洲地区水稻的主要害虫之一，属于典型的r对策昆虫，其种群发生明显受气候影响。近年来全球气候变暖导致干旱等极端天气频发，这势必会影响褐飞虱的生物学特性和行为，例如，发育历期、越冬界限、繁殖速率、对寄主的选择性和吸食行为等，进而影响褐飞虱的种群动态。为此，深入了解水分胁迫对褐飞虱取食行为的影响对指导未来干旱胁迫生境的害虫综合治理、保障水稻安全生产具有一定的指导意义。本文用15%与20%浓度的聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG;两种浓度简称为15%P和20%P)对水稻进行不同程度的水分胁迫，以未添加PEG-6000的营养液培育水稻为对照，主要研究了褐飞虱5龄若虫和羽化24h内的短翅型雌虫对受水分胁迫水稻的选择性、取食行为变化及其蜜露分泌的差异，主要结果如下：1.褐飞虱对不同浓度PEG-6000胁迫水稻的寄主选择性研究成对比较试验，设A(CK/15%P)、B (CK/20%P)、C (15%/20%P)三组进行，用落虫数的差数(d)进行分析，结果表明，组内不同时间的差值(d)均未达显著水平(P>0.05)；组间5龄若虫的B、C之间差异不显著(P>0.05)，雌虫B、C之间在6h与12h时差异不显著(P>0.05)，但24h的CK落虫数显著多于20%P，而少于15%P。5龄若虫的落虫数CK与15%P差异不大(d=0.05)，而15%P明显多于20%P (d=1.51)；雌虫落虫数是15%P与20%P差异不大(d=0.20)，而15%P明显多于CK (d=1.87)，但无论是若虫还是雌虫，CK的落虫数总比20%P多。成对比较试验结果落虫数是：15%P>CK>20%P。将三种处理放在一起，供褐飞虱选择的试验结果与成对比较结果一致。但若虫CK和20%P差异不显著(P>0.05)，15%P与20%P达极显著水平(P<0.01)；雌虫三者之间差异均不显著(P>0.05)。2.褐飞虱吸食不同浓度PEG-6000胁迫水稻的刺探电位研究刺探电位图谱(Electrical penetration graph, EPG)研究结果表明，不同处理的发生虫数无论若虫、雌虫均以吸食木质部(N5)为多，韧皮部(N4-b)为少；吸食时间均以韧皮部为长，木质部为短；且除若虫木质部，无论若虫、雌虫，木质部、韧皮部及唾液分泌(N4-a)的时间，均表现为20%P>15%P>CK。同时，试验表明，在韧皮部吸食必须经唾液分泌助吸；而木质部一般不需要。但受水分胁迫，会增加木质部唾液分泌助吸的虫数。结果经显著性测定：木质部吸食时间，若虫15%P与CK及20%P差异达极显著水平(P<0.01)，但雌虫CK与15%P差异不显著(P>0.05)，而两者与20%P差异达极显著水平(P<0.01)；唾液分泌时间若虫、雌虫二处理均与CK达极显著水平(P<0.01)；而韧皮部吸食时间，CK和15%P均与20%P达显著水平(P<0.05)。结果表明，与CK相比，吸食时间是水分胁迫越重，增加的时间就越多，且在韧皮部吸食也明显相应增加唾液分泌的时间。此外，与CK相比，在不同部位吸食的发生虫数，受水分胁迫也相应会减少。无论是若虫还是雌虫有效入刺N5比率都说明褐飞虱较喜欢入刺木质部，且雌虫较若虫更喜欢在木质部吸汁。但经差异显著性测定，仅若虫对照与20%P的差异达极显著水平(P<0.01)，其他各处理间差异均未达显著水平(P>0.05)。而转间吸n5比率说明，在无水分胁迫的情况下(CK)，褐飞虱在韧皮部中吸汁的比率较高，然而当有水分胁迫时，会明显提高木质部吸食比率，但经显著性测定也只有雌虫的对照与20%P的差异达显著水平(P<0.05)。3.褐飞虱取食不同浓度PEG-6000胁迫水稻的取食痕和蜜露分泌量研究取食痕数目的大小与EPG测定中总入刺数的大小相一致。5龄若虫的取食痕数目大小为15%P>CK>20%P，且15%P与CK和20%P差异达显著性水平(P<0.05)，而总入刺数达极显著水平(P<0.01)；雌虫的取食痕数目大小为20%>15%>CK，且CK与15%P和20%P有显著差异(P<0.05)，但总入刺数CK与15%P差异不显著(P>0.05)，而均与20%P达极显著水平(P<0.01)。蜜露分泌量，若虫不同处理均呈现5d>3d>2d，且CK与15%P差异不显著(P>0.05)，而与20%P差异均达显著水平(P<0.05)；雌虫除3d的CK外，其余CK和15%P也均与20%P的差异也均达显著水平(P<0.05)。从均值看不同处理的分泌量，若虫和雌虫均以15%P为大，20%P为小，且CK与15%P相差不大，特别是若虫的CK与15%P几乎没有差异。取食痕和蜜露试验证明，褐飞虱在CK和15%P胁迫下的刺探和取食比20%P都更为明显，进一步验证了EPG的研究结果。本研究结果表明，一定的水分胁迫(15%P)对褐飞虱的取食有影响，但通过昆虫自身的调节可以抵抗水分胁迫的不利作用，而重度胁迫(20%P)下对褐飞虱取食行为造成的不利，昆虫难以自身调节并抵御。
参考文献：
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[10]. 水稻水分胁迫对褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为影响及其生理研究[D]. 谭椰. 中国计量学院. 2014