佳木斯市疾病预防控制中心 黑龙江佳木斯 154002
摘要：目的：探讨梅毒的四种检测方法及其临床价值，建立适合自己实验室的梅毒检测流程和报告系统。方法：收集2010年1月～2015年6月我中心自愿咨询门诊梅毒患者的血标本100例，分别采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）、胶体金快速检测试验（ACONSYP）、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）检测血清梅毒。结果：先进行TP-ELISA初筛检测的100例梅毒患者血清中，四种方法均为阳性者94例，其中TPPA阳性98例，TRUST阳性94例，ACONSYP阳性96例。而在 120例非梅毒对照组中，经TP-ELISA检测阴性例数为114例，特异性为95%。结论：四种方法均存在一定的假阴性和假阳性，为了提高梅毒检出率，对于TP-ELISA阳性标本，要做TRUST和TPPA复检。
关键词：梅毒；检测；对比
梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种传染病，人体一旦被感染上梅毒螺旋体后，其血清中就会产生特异性抗螺旋体抗体和非特异性抗类脂质抗体（又称反应素）。而且早期梅毒在治愈后复发率较高，治疗难度大。临床按照病程将梅毒感染分为一期、二期、三期、胎传梅毒和潜伏梅毒，感染时期越长，梅毒螺旋体独行增加，治疗难度越大，耐药性增加，致残率和致死率较高[1]。所以，对梅毒感染或怀疑有梅毒感染的患者要尽早明确诊断，使用青霉素类、四环霉素类、红霉素类药物进行治疗，控制症状。临床上常用诊断梅毒的实验室方法主要有：酶联免疫吸附试验（ELISA）、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）、胶体金快速检测试验（ACONSYP）、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）、蛋白印迹实验（WB）等，不同检测方法的特异性和敏感性有差异，如何选择或联合以上检测方法，不同的实验室不尽相同[2]。为了尽早发现和确诊梅毒，各实验室应建立一套适合自己的完整的、统一的梅毒实验室报告系统。及时为临床提供准确的检验结果，使之能采取相应治疗措施和有效控制病情发展。为此，我们收集了100例梅毒患者血清标本，分别采用四种检测方法，并对结果进行比较分析，现报道如下：
1 资料与方法
1.1 研究对象
100例均为2010年1月～2015年6月来我中心艾滋病自愿咨询门诊（vct）检测梅毒患者，经TP-ELISA检测血清标本均为阳性，其中实验组100例患者中男62例，女38例，年龄16～74岁，平均年龄（43.7±3.4）岁，按照病理分期分为一期梅毒感染24例，二期梅毒感染45例，三期梅毒感染31例。120例非梅毒对照组，其中男68例，女52例，年龄18～75岁，平均年龄（44.1±3.6）岁。实验组和对照组选择依据中华人民共和国卫生部行业标准《梅毒诊断标准及处理原则》。两组观察对象均了解实验目的，签署知情同意书，获得我中心批准。两组观察对象的性别、年龄等资料无显著性差异（P＞0.05），有可比性。
1.2 方法
抽取梅毒患者肘静脉血3 ml，分离血清后及时检测，对于用TP-ELISA检测为阳性的血清标本，再分别采用TRUST、ACONSYP、TPPA三种方法检测。本次实验所使用的试剂均在有效使用期内，严格按试剂说明书进行规范操作。
1.3 试剂和仪器
TP-ELISA试剂由北京万泰有限公司提供，TRUST试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，ACONSYP试剂由艾康生物技术有限公司提供，TPPA试剂则由日本富士珠式会社提供。仪器为安图AUTO -PHOMO酶标仪和 安图AUTO-iwo全自动洗板机。
2 结果
2.1 四种检测方法对两组观察对象梅毒的阳性和阴性检测结果
首先对梅毒患者血清标本进行TP-ELISA初筛测定，结果为阳性的分别同时进行TRUST、ACONSYP、TPPA测定，在100例梅毒患者血清中，四种方法均为阳性者94例，其中TPPA阳性98例，TRUST阳性94例，ACONSYP阳性96例。TRUST敏感性略低于TPPA，TP-ELISA和ACONSYP。120例非梅毒对照组中，经TP-ELISA检测阴性例数为114例，特异性为95%。
2.2 梅毒分期及敏感性、特异性
实验组100例梅毒感染患者中，一期梅毒35例，二期梅毒48例，三期梅毒17例。TRUST检测方法对一期梅毒和三期梅毒的阳性诊断率、对梅毒的敏感性明显低于其他三种检测方法，详细检测情况见表1。
3讨论
我国梅毒感染患者众多，特别是近年来，梅毒感染患者呈持续增加的趋势。在全球范围内，每年约有一千多万新感染梅毒患者，感染梅毒的孕妇中约有25%会出现流产、死胎，威胁患者及婴儿的生命安全，梅毒感染成为全球性卫生问题。感染梅毒后就会引发闭塞性动脉内膜炎、梅毒瘤、小血管周围炎、血管炎等，一期梅毒感染主要表现为生殖器部位的硬性圆形结节、淋巴结肿大、淋菌性皮炎等。对于症状隐匿感染容易延误病机，形成二期感染。二期梅毒发生于感染后2-6月，通过淋巴结、血液进行全身扩散，引起发热、疲乏、食欲不振、淋巴结肿大、肝脾肿大、梅毒疹等症状，及时采取治疗措施后，十分之七的患者可以痊愈。三期梅毒发生于感染二年后，主要表现为树胶肿、心血管梅毒、神经梅毒，预后较差，死亡率高。先天性梅毒由母体传播，2岁以下婴儿梅毒感染为早期先天性梅毒，2岁以后有明显的三期梅毒症状，应及时治疗。通常梅毒感染后2周左右的潜伏期，患者有不同部位硬下疳症状，所以针对症状应及时采取诊治措施，平时做好性卫生工作。据文献报道，人体感染梅毒螺旋体后血清中产生的抗螺旋体抗体比抗类脂质抗体出现早[3]。且特异性抗体出现早、消失迟，即使经过正规抗梅毒治疗，仍可检测出其特异性抗体，甚至可终生检出。临床常用诊断梅毒的方法有：暗视野显微镜检暗视野显微镜检查、梅毒血清学检查、梅毒螺旋体IgM抗体检测、脑脊液检查、分子生物学检测等。分子生物学检测是目前临床主要采用的诊断梅毒感染的检测方法，而且检测途径较多，但是还没有统一的标准的检测方法，检测方法的准确性关系下一步治疗方案。影响诊断方法差异性除技术原因外，梅毒患者感染梅毒后机体产生的抗原有差异，有明显梅毒螺旋体特异性抗体的诊断难度较小，利用分子生物学检测方法可以进行早期诊断，及时采取治疗措施。但是非梅毒螺旋体特异性抗体的诊断难度较大，如RPR、USR等。患者通常在感染梅毒后一个多月才能检查出变异抗体，容易延误早期治疗时机。
ELISA采用双抗原夹心法，即在聚乙烯微孔条上预标记基因表达梅毒抗原，用辣根过氧化物酶（HRP）标记基因重组梅毒抗原，检测血清中TP-IgG抗体和早期的IgM抗体。该法利用抗原或抗体不同特性，通过固相化和酶标记测定其免疫活性，进行定量分析，通过免疫吸附法进行测定，联合使用可得到更高的敏感性和特异性[4]。主要实验步骤为：（1）利用抗体联合固相载体形成固相抗体。（2）将受检标本进行保温反应，结合固相抗体和标本中的抗原形成固相抗原抗体复合物，洗涤杂质。（3）将酶标抗体进行保温反应，结合固相抗原抗体复合物和酶标抗体，将未结合的未结合的抗体进行洗涤，清除所有杂志，测定酶量。（4）利用固相中的酶催化底物是标本显色，通过对比色彩辨别受检标本中的抗原量。在实验室检验中，ELISA法适用于大分子抗原、单个决定簇的检验，如HBsAg、hCG等。在抗血清的检测中，抗体分取不同种属的检测准确性才高，否则误差较大。但是ELISA法容易受类风湿因子和多个决定簇的影响，影响诊断结果，在检测时要注意排除干扰因素[5]。TP-ELISA具有结果客观准确，操作简便，试剂成本低等优点，可作为早期梅毒诊断的方法，尤其适用于二期梅毒的诊断。但TP-ELISA本身也存在问题，如标本中一些类过氧化物酶样物质的增高，血浆蛋白紊乱等，会造成假阳性。而当标本梅毒螺旋体抗体滴度低于试剂检测限时，又可出现假阴性。从上述结果中可看到，对于对照组的检测，120例中出现6例假阳性。
ACONSYP采用纯化重组基因的梅毒抗原，以胶体金作为指示标记于硝酸纤维素膜上进行反应，利用免疫层析分析技术、双抗原夹心法原理快速定性检测梅毒螺旋体抗体，灵敏度和特异性也较高，见表1。ACONSYP采用高度纯梅毒螺旋体单抗的的基因抗原，选择高效的结合抗体发生反应，5min就可得出测试结果。操作简单，减少了温度、酸碱度个外界干扰因素[6]。同时，ACONSYP对仪器、设备的要求低，检查迅速，但血清/浆中浓度过低时，ACONSYP会产生假阴性反应，对一期梅毒、先天性梅毒的检测敏感性低。ACONSYP成本低，操作简便，结果明了快速，但不适于批量检测。
TPPA为梅毒确证试验，利用明胶颗粒对抗原进行吸附形成凝集反应，受其他干扰因素的影响较小，其特异性和敏感性相当高，但是检测时间较长，大约为2小时。而且操作较复杂，对操作人员水平要求也较高，价格昂贵，对批量检查还存在不足，有一定的局限性[7]。有资料表明，TPPA对早期梅毒的检出率较低，有可能是梅毒患者血清梅毒螺旋体抗体滴度未达到试剂盒的检测范围，而产生假阴性反应的原因，这点从表1中也可看出。
TRUST是采用牛心脏中提取的心磷脂、胆固醇、卵磷脂组成的性病研究室抗原重悬于含有特制的甲苯胺红溶液制成，检测血清/浆中的抗类脂质抗体，即反应素。有资料显示[8]，TRUST的敏感性和特异性均低于TPPA、TP-ELISA和ACONSYP法，与本文结果一致。TRUST对早期梅毒、三期梅毒、治疗后及潜伏期梅毒易出现假阴性反应，而受到传染病影响如疟疾、风疹、猩红热、结核病、肺炎、类风湿关节炎、自身免疫性溶血及一些原因不明的发热疾病影响时，均可产生生物学阳性反应，还会受到年龄、孕妇、疾病等影响而产生假阳性，梅毒感染患者有病毒性肝炎、类风湿关节炎、细菌性心内膜炎、上呼吸道感染、吸毒等疾病时，容易漏诊[9]。因此TRUST的敏感性和特异性有一定局限性，同时结果为肉眼观察，易出现漏检和误判。TRUST 适于筛选试验，不适于梅毒的诊断，这种非特异性抗体滴度与梅毒活动病程有关，可用于观察疗效、复发和再感染。因此，同时采用TRUST和TP-ELISA 或TPPA进行梅毒血清学检测，既可以提高梅毒阳性检出率，又能观察疗效，非常有利于梅毒的早期诊断。而且无需其他仪器，价格合理，可以作为观察梅毒变化的检测方法。
梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的一种含有多种抗原物质的微生物，进入人体后引起复杂免疫反应，并产生多种多样的症状和体征，给临床诊断带来一定的困难[10]。对于无症状或体征的阳性结果是方法学导致的假阳性，还是可能存在隐性感染或梅毒痊愈后抗体的持续存在，对此都应进行综合分析，采用多种方法进行确定。在日常检测工作中，经常发现一些结果为阳性的患者，特别是老年人、孕妇等，既无相应的临床症状或体征，也无梅毒感染史或感染史不清。我们只好用多种方法复检，并结合临床医生掌握病情，报告结果[11]。这不仅给实验室工作带来麻烦，也给患者或临床医生造成对实验室梅毒结果的可信性降低。因此，为了满足病人和临床需要，建立自己统一、快速、流畅的检测梅毒方法及报告系统，与临床结合，同时开展以上四种检测梅毒的方法[12]。TP-ELISA主要用于临床各科室手术前检查和输血等大批量血标本的筛查试验，TRUST主要用于皮肤科或性病门诊患者的筛查及梅毒患者疗效观察，ACONSYP主要用于临床急诊患者筛查，TPPA主要用于对前三种方法检测出的阳性标本进行复检。若有条件可以对每一份血标本同时进行特异性抗螺旋体抗体和非特异性抗类脂质抗体的检测，这样可以大大提高梅毒的检出率。
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论文作者:王红,马永娟,周迪
论文发表刊物:《健康世界》2016年第8期
论文发表时间:2016/7/13
标签：梅毒论文; 抗体论文; 螺旋体论文; 阳性论文; 血清论文; 抗原论文; 患者论文; 《健康世界》2016年第8期论文;