李秀云[1]2002年在《鸡新城疫吉林强毒株的分离及其致病性的研究》文中研究表明近年来，在新城疫La Sota疫苗免疫鸡群及高抗体鸡群中不断有新城疫的发生，有学者报道，其原因不仅与免疫方法、途径、疫苗等有关，更重要的是与新城疫毒株的变异，不同基因型的出现有关。 用SPF鸡胚在吉林省患病鸡群中分离到一株病毒，经病毒形态学、结构特征、生物学、血清学及致病性等试验研究，确定该病毒为鸡新城疫强毒，对La sota免疫鸡的致病性及其致死率与鸡新城疫标准强毒E_9F_(48)对比差异显着，La Sota疫苗对该株病毒免疫保护效果不理想。
李晓婷[2]2013年在《新城疫病毒F蛋白对其致病性影响的研究》文中指出新城疫(ND)是禽类特别是鸡类的一种具有高度传染性的病毒性疾病，引起这种疾病的病毒为新城疫病毒（NDV）。NDV是副粘病毒科（paramyxoviridae）副粘病毒亚科（paramyxovirinae）腮腺炎病毒属(rubulavirus)的一种病毒。NDV基因组为单股负链RNA病毒，编码6种蛋白。其中的F基因对其毒性起到了决定性的作用。研究发现F蛋白裂解位点的碱性氨基酸数目与NDV毒性密切相关，因此编码裂解位点氨基酸的核苷酸顺序在NDV致病性的研究中至关重要。本研究下载了在2012年11月年之前上传到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的所有中国新城疫病毒中基因全长为1662bp的F基因核苷酸序列共329条，对其进行遗传进化分析，且对其编码的氨基酸进行变异分析。研究发现F蛋白裂解位点附近核苷酸序列具有保守性，为了研究这些序列与新城疫致病性的关系，从中国近10年发表的文献中选取在中国境内分离的18株新城疫毒株序列，并对F基因的206~540位核苷酸进行分析。研究结果表明，中国NDV有ClassⅠ和ClassⅡ两个分支，其中ClassⅡ的毒株居多。分离株中ClassⅡ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ五种基因型占到了99%，其中Ⅶ基因型的毒株数量最多，并且以Ⅶ d亚基因型为主。通过对F蛋白裂解位点氨基酸变化的研究发现，裂解位点和毒力有一定关系。因此，对中国新城疫病毒F蛋白遗传进化的分析为研究NDV毒性分子机制以及ND的防控提供了理论依据。F和HN蛋白是新城疫病毒的两种囊膜蛋白，与宿主细胞膜的融合相关。其中F蛋白是不同NDV毒性强弱的主要原因，并且F蛋白的裂解位点起到了重要作用。本文将中等毒力的Mukteswar疫苗株的F和HN基因克隆到pMD18-T载体上，构建F-pMD18-T、HN-pMD18-T质粒，并将F基因裂解位点的核苷酸突变为典型弱毒株裂解位点GRQGRL与典型强毒株裂解位点KRQKRF的核苷酸。再将基因连接到pcDNA3.0真核表达载体上，并转染到BHK-21细胞中观察细胞融合的情况，来判断F基因裂解位点与病毒毒性的关系。转染过程中同时转入了能稳定表达T7RNA聚合酶的质粒pEGFP-N3-T7及荧光蛋白基因GFP，T7RNA聚合酶表达的内转录活性使F、HN、GFP基因共表达。通过实验结果可以发现F蛋白裂解位点的确与细胞膜融合密切相关，因此其对新城疫病毒的毒性也有重要作用。RNA病毒的反向遗传系统可以定向的改变病毒的基因序列，检测人工改造后病毒的变化作用。本实验将含有新城疫病毒Mukteswar疫苗株F蛋白裂解位点的质粒F5-pMD18-T使用双重PCR的方法进行基因突变，突变为弱毒株的裂解位点GRQGRL。F5-pMD18-T与F6-pMD18-T质粒分别经SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切之后连接为FR5-6-pMD18-T。 FR5-6-pMD18-T使用XbaⅠ、StuⅠ、VspⅠ叁酶切、F1-4-pMC18用XbaⅠ和StuⅠ双酶切并回收目的片断，使用T4连接酶将目的片断连接，并用叁组酶进行酶切验证，分别为XbaⅠ和StuⅠ、SnaBⅠ和StuⅠ、SnaBⅠ和Eco72Ⅰ。连接成功后将片断F1-6-pMC18用SnaBⅠ和XbaⅠ双酶切，F6-11-HT-pMC18用XbaⅠ、SnaBⅠ、VspⅠ叁酶切，目的片断回收连接后鉴于拼接片断过长，使用6组酶进行酶切验证，分别是用SnaBⅠ和XbaⅠ、NcoⅠ和XbaⅠ、SacⅡ和NcoⅠ、MluⅠ、BstEⅡ、NsiⅠ。检测均正确则表明新城疫病毒Mukteswar疫苗株的全长cDNA拼接完全。本研究为新城疫病毒的反向遗传系统构建提供了基础，并且新城疫疫苗多为弱毒株或减毒株，本研究也为构建人工新城疫苗提供了理论支持。
李志杰[3]2006年在《鹅源副粘病毒抗原变异及复合RT-PCR诊断方法研究》文中指出鹅源副粘病毒病的发生与流行说明随着新城疫病毒对禽类易感谱的变化以及新的基因型的不断变化,该病毒的抗原性也在不断的变化。因此,无论从流行病学、病理变化、免疫学特性、基因水平来看,鹅源副粘病毒与经典的新城疫病毒在抗原性和致病性上发生了较大变异。由于二者都是危害我国养禽业的严重传染病之一,从抗原性变化角度来判断和区分鹅源副粘病毒与鸡新城疫病毒引起的疫病,对预防和控制鹅源副粘病毒病和鸡新城疫不仅具有重要的理论价值,而且具有重要实用价值。本研究将鸡新城疫病毒F48E9株与本试验室分离纯化、鉴定的鹅源副粘病毒NA-1株进行鸡胚增殖,测定其血凝效价,经甲醛灭活,制备油佐剂灭活苗,分别免疫鸡、鹅,采血制备高免血清,测定其血凝抑制效价;采用抗原比值(R值)分析方法,通过交叉血凝抑制试验、鸡胚交叉中和试验、细胞交叉中和试验、交叉攻毒保护试验所得的抗原比值,来判断鹅源副粘病毒NA-1株与鸡新城疫病毒F48E9株之间的抗原差异。试验结果表明,鹅源副粘病毒与鸡新城疫病毒能够发生交叉中和反应,两毒株的血清均可分别中和鹅源副粘病毒与鸡新城疫病毒,说明二者含有相同的抗原成分,但根据抗原比值分析,可判断两者存在抗原差异。为了鉴别鹅源副粘病毒与鸡新城疫病毒,本试验将分离纯化的鹅源副粘病毒NA-1株与鸡新城疫病毒F48E9进行基因组RNA提取,通过自行设计的3条引物,通过优化PCR条件,根据扩增片段的大小来鉴别病毒的F基因,从而建立了一种能够鉴别鹅源副粘病毒病与鸡新城疫的复合RT-PCR技术。
王珂[4]2016年在《新城疫病毒强弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及试剂盒的组装》文中研究说明新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性禽类传染病,严重危害禽类健康,其发病率和死亡率都很高。近几年,新城疫的发病情况和流行态势日益复杂,新城疫病毒强弱毒株混合感染在禽群中越来越常见,区分新城疫病毒强弱毒株在新城疫诊断与防控上也越来越受到重视。常见的实验室检测新城疫强、弱毒的方法耗时耗力难以满足需求,如鸡胚平均死亡时间(MDT)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)等。与这些方法相比荧光定量RT-PCR方法省时省力、操作简便、安全可靠,并且特异性、敏感性优异。近年来,国外虽有利用多重荧光定量RT-PCR检测方法区分新城疫病毒强、弱毒株的研究,但国外新城疫流行株的基因型与我国当前新城疫流行株的基因型(Ⅶ型)存在着一定的差异。目前国内市场上还未出现快速鉴别新城疫病毒强、弱毒株的试剂盒,因此建立荧光定量RT-PCR检测新城疫病毒强、弱毒株的方法及组装试剂盒迫在眉睫。本实验通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计了数对探针和引物。通过筛选两组探针及引物,选择NDV-F和NDV-R作为最佳引物组,NDV-V-Probe和NDV-L-Probe作为最佳的探针组;确定最佳的反应条件及反应体系,其中最佳退火温度为56℃,NDV-F、NDV-R的终浓度为0.6μM,NDV-V-Probe、NDV-L-Probe的终浓度分别为0.6μM和0.2μM。建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法,根据所建立的检测方法组装成试剂盒,检验试剂盒的特异性、敏感性、重复性等参数,并确定试剂盒的保存期和保存条件。该实验所建立的方法以及根据该方法组装的试剂盒对NDV NA-1株RNA标准品的最小检出量均为102copies/μL,对NDV La Sota株RNA标准品的最小检出量均为101copies/μL,用组装成的试剂盒检测临床样品,阳性检出率高于国家标准的检测新城疫RT-PCR方法,具有良好的应用价值。
陈胜利[5]2013年在《不同宿主来源新城疫病毒全基因组特征及其V蛋白对DF-1细胞IFN-β生成的影响》文中研究说明新城疫是一种严重危害多种禽类健康的传染病，给世界养禽业造成巨大经济损失。该病的病原新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）属于副黏病毒科(Paramyxovirudae)、禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），是禽副黏病毒1型的唯一成员。病毒基因组为单链负股RNA，长度约为15.2kb。NDV对不同宿主的致病性存在很大差异。近年来，NDV感染和致病宿主范围正在不断扩大，给新城疫的防控带来新的挑战。干扰素系统是宿主抵抗病毒的第一道防线，近些年研究发现，副黏病毒的V蛋白能够有效拮抗宿主干扰素系统，对病毒的免疫逃避发挥功能，同时在病毒致病性和宿主限制方面发挥重要作用。与其他副黏病毒相似，NDV的P基因通过RNA编辑现象，编码产生的V蛋白在病毒拮抗宿主干扰素过程中发挥关键作用。已有研究均是对1株或2株NDV毒株V蛋白拮抗宿主干扰素作用进行研究报道，然而众多动物来源、不同毒力和基因型的NDV毒株V蛋白的分子进化特性及拮抗宿主干扰素功能差异目前尚不清楚。为了阐明不同动物来源NDV基因组演化特点、宿主特性改变的原因及V蛋白与病毒致病性和宿主特异性的关系，本研究在对实验室多种动物来源新城疫病毒分析的基础上，对3株NDV代表性毒株（2株朱鹮源和1株猪源）进行生物特性研究、全基因组克隆测序及遗传进化分析，同时对其他动物来源如鸡、鸽、鹅和野鸟源等22株不同NDV毒株V蛋白的分子特征、遗传变异规律及拮抗宿主干扰素功能差异进行了系统研究。具体研究内容和结果分为以下五个部分：1、2株朱鹮源新城疫病毒分离鉴定、全基因测序分析对2010年1月陕西省周至县楼观台珍稀野生动物救护饲养研究中心朱鹮暴发的疑似ND病料及实验室2006年2月收集的发病朱鹮病料，进行病毒分离鉴定、病毒致病指数测定，并运用RT-PCR技术对分离株进行全基因扩增并测序。利用DNAStar及MEGA4.0软件，对获得的全基因序列与NDV参考毒株的全基因组成、基因编码区及非编码区序列进行同源性分析、比较、并构建系统发育进化树。结果共分离鉴定出2株NDV，分别为Shaanxi06和Shaanxi10，病毒致病指数测定结果表明Shaanxi06为强毒，而Shaanxi10为中强毒。但F蛋白裂解位点区氨基酸序列均为~(112)R-R-Q-K-R-F_(117)，与强毒株F0蛋白裂解序列相符。全基因组测序结果表明，Shaanxi06（GenBank登录号：KC853019）和Shaanxi10（GenBank登录号：KC853020）基因组全长15,192bp，分离株与NDV参考毒株基因组特征、蛋白编码区和非编码区序列并无太大差异，但2株朱鹮源NDV分离株具有一些新的特征。系统进化树表明，2株朱鹮源NDV分离株均为NDV class II群，Shaanxi06属于基因VIId亚型，而Shaanxi10属于一个新的基因亚型VIi，这2株朱鹮源NDV分离株与陕西省同一地区2006~2010年其他禽类NDV流行株亲缘关系最近，而与我国传统的NDV疫苗毒La Sota、B1和clone30株及我国NDV标准强毒F48E9亲缘关系均较远。2、猪源新城疫病毒HX01株分离鉴定、全基因测序分析2009年12月从陕西省户县某养猪场疑似猪流感病死猪采集肺脏病料，进行病毒分离鉴定，致病性测定及运用RT-PCR技术对分离株进行全基因扩增并测序。利用DNAStar及MEGA4.0软件，对获得的全基因序列与NDV参考毒株的全基因组成、基因编码区及非编码区序列进行同源性分析、比较、并构建系统发育进化树。结果显示，分离出1株新城疫病毒，命名为HX01株。致病性测定结果显示分离毒株为NDV弱毒株。F蛋白裂解位点氨基酸组成为~(112)G-R-Q-G-R-L~(117)，符合弱毒特征。全基因组测序结果表明，HX01株（GenBank登录号：JF795531）基因组全长15,186bp，基因组特征与其他NDV参考毒株相似。HX01株与我国传统弱毒疫苗株La Sota及其他猪源NDV毒株同源性最高，与La Sota无论全基因水平还是各个基因水平，同源性均在99.5%以上。遗传进化表明，HX01株与La Sota、clone30等同属于基因II型。但是，HX01株HN基因具有独特性，在HN蛋白第2抗原表位出现S526N点突变和其他点突变N98K、I227T和S464P。此外，HN基因的终止序列出现A-T的点突变。这些突变在NDV进化中的作用有待进一步研究。3、新城疫病毒分离株V基因克隆测序、分子特征及遗传进化分析根据GenBank上已发表的NDV P基因序列，对20株不同宿主来源、毒力和基因型的NDV分离株和2株NDV参考株进行P基因克隆测序，根据测序结果对P基因RNA编辑位点进行定点突变，插入1个非模板G，获取不同NDV毒株V基因序列。利用DNAStar及MEGA4.0软件，对获得的V基因序列与NDV参考毒株的序列进行同源性分析、比较并构建系统发育进化树。结果显示，成功克隆22株不同宿主来源、毒力和基因型的NDV毒株V基因。20株NDV分离株V基因的核苷酸的同源性在80.4%~100%，氨基酸的同源性在67.5%~100%。20株NDV分离株与其他参考株V基因的同源性差异较大，在68.3%~100.0%。不同基因型的毒株V基因的核苷酸和氨基酸的同源性较低，而相同基因型的NDV毒株V基因同源性高达99.1%以上。目前流行的基因VII型毒株与传统疫苗株、我国标准强毒株的V蛋白同源性相比，氨基酸序列发生了较大变异，并且基因VI型不同基因亚型间差异也较大。V蛋白结构分析表明，N端55~105位和C端135~172位氨基酸是V蛋白的高变区，而N端起始MATF/LTDAEI、132KKG134、177HRRE180、182SISW185、C端1个组氨酸和7个半胱氨酸残基形成的锌指结构基序在NDV毒株中高度保守。NDV V蛋白氨基酸变异呈现基因型一致性。遗传进化分析表明，根据V基因全长序列和V蛋白序列所作进化树与F基因（42~470nt）进化树高度一致，表明非结构基因V基因也可应用于NDV遗传进化分析和分子流行病学研究的候选靶基因。提示NDV的演化是所有基因（包括结构基因和非结构基因）同步演化的结果。4、新城疫病毒不同毒株对禽源DF-1细胞系IFN-β生成的研究选取了6株不同宿主来源、毒力和基因型的NDV毒株，构建V蛋白真核表达载体pCMV-3HA-V，转染DF-1细胞，通过双荧光素酶试验、RT-PCR和ELISA，检测NDV的V蛋白过表达对DF-1细胞IFN-β各个水平的影响。结果表明，不同NDV毒株编码的V蛋白均可不同程度的降低poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性、mRNA水平和蛋白水平。不同NDV毒株V蛋白的表达量相近，而它们的V蛋白抑制IFN-β能力存在很大差异。V蛋白抑制IFN-β能力从高到低依次pV-F48E9、pV-Sd-08、pV-Shaanxi06、pV-Gfw-10、pV-Shaanxi10和pV-HX01。F48E9强毒株V蛋白拮抗干扰素能力最强，而猪源HX01株最弱，朱鹮源毒株居中。NDV强毒株V蛋白抑制IFN-β能力强于中强毒和弱毒；NDV毒力越强，其V蛋白抑制IFN-β生成的能力越强，反之，则越弱。研究表明，NDV V蛋白与病毒致病性密切相关，与病毒的宿主来源并无关联。5、新城疫病毒V蛋白拮抗IFN-β生成功能域的初步研究为了探讨NDV V蛋白拮抗IFN-β功能区域及C端半胱氨酸富集区7个半胱氨酸残基在抑制IFN-β中发挥的作用。通过构建P蛋白，V蛋白N端、C端截短突变体，半胱氨酸突变体C1~C7真核表达载体，应用双荧光素酶试验、ELISA和real-time PCR，检测V蛋白突变体与野生型V蛋白过表达对DF-1细胞IFN-β各个水平的影响。参考PIV5V蛋白锌指结构，对NDV V蛋白锌指结构进行模拟。结果表明，各突变体均构建成功，并在DF-1细胞获得高效表达；NDV的V蛋白具有抑制poly(I:C)诱导的DF-1细胞IFN-β启动子活性、mRNA水平和蛋白水平的能力，而P蛋白虽具有与V蛋白共同的N端，但并不具有抑制IFN-β作用。NDV V蛋白抑制DF-1细胞IFN-β生成的主要功能域位于V蛋白的C端。V蛋白C端196位（C1）、221位（C6）和224位（C7）半胱氨酸残基对于V蛋白抑制DF-1细胞IFN-β是非必需的，而200位（C2）、212位（C3）、214位（C4）和217位（C5）是必需的关键残基。研究提示，NDV V蛋白C端的7个半胱氨酸残基在V蛋白抑制IFN-β生成中发挥不同的作用。对NDV V蛋白锌指结构进行模拟，结果表明NDV V蛋白C端结构域中的大锌指结构区域L2中的残基（C2、C3、C4和C5）对于V蛋白拮抗IFN-β必需的，而小锌指结构区域L1中的残基（C1、C6、C7）是非必需的。综上所述，本研究较为系统的阐明了不同宿主来源NDV基因组特征，病毒演化特点，遗传变异规律，为阐明病毒起源、流行特点及宿主特性改变的分子机制奠定了理论基础。同时对帮助NDV病毒逃避宿主干扰素的不同NDV毒株V蛋白的分子进化特性及其拮抗宿主干扰素功能差异进行系统的研究。本研究揭示了NDV V蛋白与病毒致病性的关系，为进一步探究NDV逃避干扰素机理， NDV V蛋白拮抗干扰素功能域及开发新城疫长效疫苗奠定了基础。
李建侠[6]2011年在《种鸭生殖系统新城疫病毒检测及鸭新城疫病毒垂直感染动物试验》文中提出鸭新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种急性、败血性传染病,该病可造成鸭的大量死亡,对养鸭业危害严重。加强对该病的诊断方法和传播方式的研究对预防和控制鸭新城疫的发生,保护和促进养鸭业的健康发展具有重要意义。本研究建立了两种新城疫病毒的检测方法,即鸭源新城疫病毒RT-PCR诊断方法和间接免疫荧光染色方法,并应用这两种方法对人工感染种鸭生殖系统新城疫病毒进行了检测,同时进行了鸭新城疫病毒垂直感染动物试验。本研究内容包括四部分：一、鸭源新城疫病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用根据GenBank中新城疫F基因序列设计、合成了1对引物扩增相对保守的727 bp的目的片段,建立了鸭源新城疫病毒病的RT-PCR诊断方法。该方法能从鸭源新城疫病毒SDFCH株扩增到727bp的特异性片段,而鸭瘟病毒、H9N2亚型流感病毒、鸭肝炎病毒扩增结果为阴性,敏感性试验最低检出量的cDNA浓度为3pg/μL。表明所建立的RT-PCR方法特异性强、敏感性高。应用该方法对山东不同地区20株疑似鸭新城疫病毒分离株进行检测,结果15份为阳性；对150份疑似新城疫病鸭的感染病变组织进行检测,结果125例为阳性。二、鸭源新城疫病毒间接免疫荧光染色检测方法的建立以抗新城疫病毒F蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗小鼠IgG为二抗,同时优化固定液、黏片剂、洗涤液、抗体稀释度及孵育时间、封片剂等试验条件并进行标本自发荧光对照、荧光抗体对照、吸收试验、替代试验等特异性试验,建立了间接免疫荧光染色方法。结果显示,感染NDV发病死亡鸭的输卵管不同部位、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胰腺、脑、心脏等组织切片IFA检测发出明亮的黄绿色荧光,呈阳性。正常健康对照组种鸭鸭脏器组织切片IFA检测未发出黄绿色荧光,呈阴性。对鸭瘟病毒、禽流感病毒、鸭疫里默氏杆菌、Ⅰ型鸭肝炎病毒感染致死鸭的病变组织检测均无黄绿色荧光,呈阴性。结果表明建立的间接免疫荧光染色检测方法特异性强。叁、人工感染种鸭生殖系统新城疫病毒的检测应用本实验室分离的一株经鸭胚传递的新城疫病毒SDFCH株,对42只无新城疫病毒感染的28周龄樱桃谷种鸭进行人工感染试验,试验分A、B、C 3组,A组母鸭攻毒组,B组公鸭攻毒组, C组为对照组。攻毒4 d后,每隔2 d每组各扑杀2只,采集母鸭卵巢、输卵管,公鸭采集睾丸、输精管。对上述组织进行病毒分离鉴定,并利用已建立的RT-PCR方法进行F基因的扩增与同源性分析,确定在上述组织器官中是否存在鸭源新城疫病毒SDFCH株。同时用已建立间接免疫荧光染色方法检测输卵管内新城疫病毒及病毒在输卵管的分布情况。结果发现RT-PCR方法能在种鸭生殖系统各个组织中重新分离到新城疫病毒SDFCH株,输卵管子宫部和蛋白分泌部纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞内有阳性荧光信号存在。四、鸭源新城疫病毒垂直感染动物试验应用本实验室分离的一株经鸭胚传递的新城疫病毒SDFCH株,对68只无新城疫病毒感染的28周龄樱桃谷种鸭进行人工感染试验。攻毒采集母鸭卵巢、输卵管、未产出的种蛋,以及产出后及时消毒的种蛋,出壳后的雏鸭胎粪、脑、肺等。公鸭采集睾丸、输精管、精液。结果H.E.染色后病理组织学变化,表现为输卵管毛细血管出血,黏膜脱落,IFA检测固有层淋巴细胞浸润等输卵管纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞内有阳性信号存在,从母鸭及公鸭生殖系统各组织、胚蛋以及80%雏鸭中能分离和检测到新城疫病毒SDFCH株。结果显示,鸭源新城疫病毒能存在于母鸭输卵管粘膜上皮细胞及公鸭精液中,并随蛋白分泌、卵黄的形成、精液的排泄而进入种蛋中,发生垂直感染,可能是造成鸭胚死亡及1日龄雏鸭发生新城疫的重要原因,关于该病垂直传播的发生机制还有待于进一步研究。
刘成宏[7]2007年在《新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建、表达及对强弱毒株鉴定的研究》文中指出新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽类一种急性高度接触性传染病。NDV毒力强弱与F蛋白裂解位点区112～117位的氨基酸序列的组成有关,弱毒株在该区的氨基酸序列为G-R/K-Q-G-R-L,强毒株在该区的氨基酸序列为R-R-Q-K/R-R-F。本试验是根据氨基酸密码子的简并性以及大肠杆菌对密码子的偏爱性对FO蛋白裂解位点区核苷酸序列进行优化,把编码国内外普遍流行的NDV强毒株FO蛋白裂解位点区GRRQRRF、GRRQKRF和国内外新发现的变异新城疫强毒株FO蛋白裂解位点区RRRQKRF、GRRKKRF的核苷酸用Linker(GGGGS)相互串联构建基因Fe(F protein multiple epitope),然后进行2倍拷贝和4倍拷贝,成功构建了强毒株新城疫8个裂解位点区核苷酸相串联的原核表达载体pET-28a(+)/2Fe和16个裂解位点区核苷酸相串联的原核表达载体pET-28a(+)/4Fe,2Fe和4Fe蛋白在大肠杆菌原核表达系统中得到有效表达,经Western blotting鉴定,2Fe和4Fe蛋白与NDV强毒株F48E9阳性血清发生特异性反应而与NDV弱毒株V4的阳性血清不反应,以2Fe、4Fe蛋白分别单独免疫兔制备多抗,以此多抗建立了对NDV强弱毒株进行鉴别诊断的ELISA方法。本研究结果为进一步建立全面、快速、准确的NDV强弱毒株鉴别诊断的ELISA方法提供新的思路。
黄忍[8]2012年在《一株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及致病性研究》文中指出新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种急性、败血性传染病，该病可造成鸡的大量死亡，对养鸡业危害严重。加强对该病的诊断方法和致病性的研究对预防和控制鸡新城疫的发生，保护和促进养鸡业的健康发展具有重要意义。本研究内容包括两部分：一、新城疫病毒RT-PCR诊断方法的建立根据GenBank中新城疫F基因序列设计合成了1对引物扩增相对保守的550bp的目的片段，建立了新城疫病毒病的RT-PCR诊断方法。该方法能从新城疫病毒SD株扩增到550bp的特异性片段，而传染性法氏囊病毒、H9N2亚型流感病毒、鸡马利克病毒扩增结果为阴性，敏感性试验最低检出量的cDNA浓度为3pg/μL。表明所建立的RT-PCR方法特异性强、敏感性高。二、新城疫病毒致病性研究在本研究中从山东省的发病鸡群中分离了1株病毒，经HA、HI试验和病毒回归试验确定所分离的毒株为新城疫病毒，命名为SD株。按常规方法测得SD株的生物学毒力指标MDT、ICPI和IVPI分别为47.4h、1.975和2.85，鸡胚半数致死量LD50为10-9.6。通过RT-PCR扩增出了SD株的F基因，通过分析其融合蛋白氨基酸序列发现，SD属于基因Ⅶ型，其多肽裂解位点为112-RRQKRF-117。表明SD株为NDVⅦ型强毒株。新城疫SD株与近几年国内外分离的基因Ⅶ型同源性较高，在93.5%-98.3%；与近几年分离的鹅源鸭源同源性也较高在95.2%-96.5%之间；而与经典强毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.8%、91.3%和83.3%、88.4%。
郭威[9]2015年在《环洞庭湖区新城疫病原监测及分子演化分析》文中研究指明新城疫(Newcastle disease, ND)的高致死性仍然是对世界各国养殖业的重大危害,随着发展中国家疫苗免疫为主的政策实施,疫苗得以广泛应用,新城疫的流行一定程度上得到控制,但其流行趋势却在发生改变：流行基因发生改变、宿主范围不但扩大、非典型性新城疫越来越普遍等。研究新城疫的分子流行病学,评估其流行特点和新城疫病毒的局部传播意义重大。为了解环洞庭湖地区新城疫的感染分布情况,本文通过对2013-2014年洞庭湖地区养禽场新城疫病原监测采样,采用鸡胚分离及血清学鉴定,分离到51株新城疫病毒,其中鸡源34株,鸭源2株,环境15株。选取不同时间、不同地点和宿主的16株代表毒株,采用R T-PCR方法扩增F基因和HN基因片段,并将扩增产物纯化后克隆于PMD18-T Easy Vector载体中进行测序,与Genbank中发表的参考序列进行遗传进化分析比对,结果表明1株NDV分离株属于Class Ⅱ基因Ⅱ型,F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112GRQGRL117,属于疫苗类毒株；其余15株均为Class I基因3型,F蛋白裂解位点的氨基酸序列为I12ERQERL117, Class I各分离毒株之间F蛋白同源性在97.8%以上HN蛋白同源性在98.2%以上,与参考毒株吉林野鸟毒株J36/13的遗传关系最近。对洞庭湖周边地区活禽市场分离到的48株NDV(34株为鸡源病毒,4株鸭源病毒,1株鸽源病毒,9株分离自环境样本)测序及遗传进化分析,结果分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两大类。其中Class Ⅰ毒株共41株,占样品分离率的3.66%,占总分离率的85.42%株,均为基因3型；Class Ⅱ毒株共7株,占样品分离率的0.62%,占总分离率的14.58%,包括基因Ⅰ型1株,基因Ⅱ型5株,基因Ⅵ型1株。据研究报道,Class Ⅰ这类弱毒株起初是来源于水禽,本文研究的Class Ⅰ毒株中的鸡源毒株占75.6%(31/41),鸭源毒株占2.4%(1/41),且均与野鸟毒株J36/13的同源性在97.4%以上,说明Class Ⅰ这类弱毒株存在水禽、家禽和野禽之间相互传播的可能。综合全文监测结果分析表明：环洞庭湖地区Class Ⅰ新城疫毒株在禽群中带毒率高,超过疫苗株和强毒株的带毒率；环境来源毒株多,存在一定的病毒污染扩散；主要流行毒株为Class Ⅰ基因3型,与野鸟毒株的遗传亲缘关系最近,分析可能来自同一毒株来源,所以,对洞庭湖区新城疫的病原监测及分子流行病学的研究工作还需高度重视。
张爽[10]2011年在《新城疫病毒分离及免疫组化检测方法的建立》文中研究指明鸡新城疫(ND)是以感染禽类为主的一种多病型的高度接触性烈性传染病。由于该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成严重威胁,因此被世界动物卫生组织(OIE)规定为法定报告的疫病。不同种类的野鸟感染NDV一般具有不同的临床表现,在人工饲养条件下,多种鸟类可以感染NDV并发病。在我国ND对鹅、鸭等水禽的致病性已经发生了重大改变,其涉及的公共卫生问题也应受到高度关注。本研究采集吉林省某动物园发病大雁的病料,用SPF鸡胚分离、电镜形态观察,HA与HI进行病毒尿囊液的初步鉴定,并针对新城疫病毒F基因序列保守区设计一对引物,再用RT-PCR方法确定为新城疫病毒,命名为NDV JL/l/10.对该分离毒株的毒力进行测定,结果其ELD50、MDT、ICPI、和IVPI分别为10-7.25、58.5h、1.84、2.18从而在生物学特性方面证明了该毒株属于新城疫强毒型病毒。成功制备兔抗新城疫病毒血清,其抗体效价达到1：27。通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法及DEAE-52纤维素阴离子交换法相结合的方法纯化IgG抗体,经SDS-PAGE电泳后明显观察到50KD左右的条带,抗体纯度较高,特异性强。建立并完善SP免疫组织化学方法进行新城疫病毒在组织中的分布定位研究,优化免疫组化方法中的各种条件,通过反复试验确定以0.01M PH6.0柠檬酸缓冲液为抗原修复液,高温高压抗原修复方法。0.01M pH7.4PBS-T(含0.05%Tween-20)作洗涤液,含0.5%BSA的PBS-T (含0.05%的Tween-20)作抗体稀释液,一抗的最佳工作浓度分别为1：100,建立了稳定性强、敏感性高、可重复性高的免疫组织化学方法。大雁病理学变化包括肝脏、脾脏、肺脏、腺胃、小肠等在内的十多种器官的大体病变和组织学病变。大体病变显示腺胃、小肠、盲肠黏膜等有明显的出血；经过苏木精和伊红染色后观察组织学病变表现为肝脏、脾脏、胰腺和小肠有严重的坏死性病理变化,肾小球严重萎缩,各种上皮细胞及淋巴细胞显着的变性、坏死。应用建立并且优化完善的SP免疫组化方法,与组织病理学H.E.染色相比较,对病毒抗原在各种组织中的分布进行了检测。免疫组织化学检测表明,感染新城疫病毒的大雁组织在其呼吸系统、消化系统和免疫系统中均能见到阳性信号,其中以气管、肺脏、腺胃、胸腺、肠道、脾脏等器官的检出率较高。病毒抗原主要存在于各种上皮细胞以及肝细胞、网状细胞等的胞浆内。结合兔疫组化染色强度、病毒引起相应组织病变的严重程度进行比较发现,大雁源NDV可以在感染大雁的多种组织细胞中复制,导致广泛的组织损伤。本研究为野生水禽感染新城疫的发病机理、病毒抗原在感染动物机体内分布情况等基础性研究提供了相应的参考依据,从细胞水平揭示NDV对大雁的组织嗜性。
参考文献：
[1]. 鸡新城疫吉林强毒株的分离及其致病性的研究[D]. 李秀云. 吉林农业大学. 2002
[2]. 新城疫病毒F蛋白对其致病性影响的研究[D]. 李晓婷. 山东师范大学. 2013
[3]. 鹅源副粘病毒抗原变异及复合RT-PCR诊断方法研究[D]. 李志杰. 吉林大学. 2006
[4]. 新城疫病毒强弱毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及试剂盒的组装[D]. 王珂. 吉林大学. 2016
[5]. 不同宿主来源新城疫病毒全基因组特征及其V蛋白对DF-1细胞IFN-β生成的影响[D]. 陈胜利. 西北农林科技大学. 2013
[6]. 种鸭生殖系统新城疫病毒检测及鸭新城疫病毒垂直感染动物试验[D]. 李建侠. 山东农业大学. 2011
[7]. 新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建、表达及对强弱毒株鉴定的研究[D]. 刘成宏. 吉林大学. 2007
[8]. 一株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及致病性研究[D]. 黄忍. 山东农业大学. 2012
[9]. 环洞庭湖区新城疫病原监测及分子演化分析[D]. 郭威. 湖南农业大学. 2015
[10]. 新城疫病毒分离及免疫组化检测方法的建立[D]. 张爽. 吉林农业大学. 2011