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李连进 佟建洲 崔敬 王惠宾 保定市第一中心医院神经外二科 河北 保定 ０７１０００ 作者简介:李连进,(１９８０．１２－),研究生,主治医师,研究方向:脑血管脑创伤脑肿瘤. 通讯作者:佟建洲,保定市第一中心医院神经外二科主任
【摘要】 目的:研究分析NECL１在抑制神经胶质瘤细胞的侵袭、迁移以及诱导其分化过程中的影响.方法:在胶质瘤U２５１细胞系中,经过Transwell以及划痕实验等方法对神经黏附分子在恢复表达后对肿瘤细胞侵袭及迁移的影响进行观察,为证明神经黏附分子NECL１恢复表达后对肿瘤侵袭能力的影响进行细胞外金属蛋白酶活性的检测等.结果:在胶质瘤U２５１细胞系中,肿瘤细胞的侵袭及迁移在NECL１恢复表达后会遭到抑制,同时U２５１细胞中恢复表达后,具有向星形胶质细胞分化的趋势等.结论:在肿瘤细胞的迁移和侵袭中神经黏附分子NECL１具有不同程度的抑制作用,并可具有对神经胶质瘤U２５１细胞向星形胶质细胞方向分化的诱导作用. 【关键词】 神经黏附分子NECL１;抑制;神经胶质瘤细胞【Abstract】objective:tostudytheanalysisNECL１insuppressingtheinvasionofgliomacells,theeffectintheprocessofmigrationandinducingthedifferentiaＧtion．Methods:ingliomacelllineU２５１,afterTranswellandscratchtestmethodofneuraladhesionmoleculeexpressedinrecoveryafterthetumorcellinvasionandtoobservetheinfluenceofthemigration,toprovethattheneuraladhesionmoleculeNECL１recoveryexpressionoftumorinvasionabilityaftertheinfluenceofexＧtracellularproteaseactivityofmetaldetection．Results:ingliomacelllineU２５１,tumorcellinvasionandmigrationinNECL１expressionafterbeingsuppressed,afＧterUrecover２５１cellsexpressatthesametime,havetoastrocytesdifferentiationtrend,etc．Conclusions:intumorcellmigrationandinvasionofneuraladhesionmolec【uKleeyNwEorCdLs１】hasdifferentdegreeofinhibition,andcanbeonU２５１gliomacelldifferentiationtowardsastrocytesinducedeffect． neuraladhesionmoleculeNECL１;Inhibition;Gliomacells．【中图分类号】R４７【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０２７８－０１
神经胶质瘤是脑部多发肿瘤的一种疾病,该病的恶性程度及复发率均普遍较高,因胶质瘤具有较强的浸润性,依靠单独的外科手段对其无法做到根治,为诊断和治疗提供新的靶标及标记物,可对其发生、发展的分子机制进行探索[１].NECL蛋白家族成员之间在参与细胞粘附时可通过胞外区的免疫球蛋白样结构域发生同源、异源的相互作用进行,并且与肿瘤的生长、侵袭等具有一定的关系等[２].本_______次研究主要对神经黏附分子NECL１对神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭进行抑制并诱导其分化的影响进行研究性分析.
１ 资料与方法
１．１ 一般资料 选取DMEM 细胞培养基和胎牛血清;ECL试剂盒和硝酸纤维素膜;人神经胶质母细胞瘤细胞株U２５１;小鼠抗人神经胶质纤维酸性蛋白抗体;罗丹明标记的鬼笔环肽;NECL１重组腺病毒构建以及Transwell板和Matrigel.
１．２ 方法１．２．１ U２５１细胞病毒感染方法 在未处于对数生长期的U２５１细胞换无血清的培养基进行培养,向培养基中按照１０８pfu/ml的终病毒浓度加入病毒,然后把细胞放入孵箱,每次相隔１５min的时间对其进行轻微振荡１次.在１．５小时后将同无血清培养基等体积的有血清培养基向细胞内加入,在３小时后对细胞换全培养基,在２４小时后观察细胞荧光,如果样本感染效率比较低,可将上述操作过程重复进行１次感染.
１．２．２ 划痕伤害实验方法:在１２孔板中将细胞铺垫于其上面,为保证细胞超过８０％的感染效率,应在细胞处于对数生长期的时候按照上述方法应用在病毒感染的细胞中具有一定的效果,为保证细胞可完全脱落时,应在细胞生长到刚刚汇合时,对每个待检测的小孔中央使用２００μl的黄色移液头用力均匀的划出一道划痕.对细胞应用生理盐水进行清洗,并为细胞换全新的培养基,取当前的时间为０点,开始对划痕的宽度进行记录.
１．２．３ Transwell及Matrigel细胞侵袭实验方法:先在无血清培养基中对TrＧanswell小室平衡３０分钟,如若进行Matrigel试验,则应用３００μg/ml的MaＧtrigel胶包被小室,在３７℃的环境下放置３个小时,对小室应用无血清培养基进行漂洗３次,平衡３０分钟,对待检测细胞进行消化,全培养基与胰酶中和后吹打成单细胞悬液,采取低速离心方式进行收集细胞,将有血清上清进行去除,用无血清的培养基对细胞进行重新悬浮,使用血球计数板对细胞进行计数,然后再次用低速离心的方式对细胞进行收集,按照(１~２)×１０６细胞/ml 的浓度在无血清培养基中对细胞进行重新悬浮,对两组间的细胞浓度保持相同.
２ 结果
２．１ 经NECL１重组腺病毒感染后,U２５１细胞划痕伤害愈合速度减慢 在感染空载体腺病毒及NECL１重组腺病毒的单层汇合细胞中间划一划痕,持续测量对划痕两侧细胞间的距离,对两侧细胞对中间的愈合进展进行观察,显示神经黏附分子中重组腺病毒感染的U２５１细胞愈合速度与空载体腺病毒感染的细胞相比,NECL１重组腺病毒感染的U２５１细胞划痕愈合的速度较快.
２．２ 经NECL１重组腺病毒感染后U２５１细胞Transwell及Matrigel细胞侵袭能力降低．将感染有NECL１重组腺病毒以及空载体腺病毒的U２５１细胞通过无血清培养基的稀释后转入Transwell小孔中,用有１０％胎牛血清的培养基作为趋向剂进行试验,显示感染空载体腺病毒的细胞数明显多于感染NECL１重组腺病毒的细胞迁移到下室的数量. ２．３ 细胞外金属蛋白酶活性发生改变 在非变性SDS－PAGE胶中,基质金属蛋白酶９和基质金属蛋白酶２的相对分子质量分别为９２０００及７２０００,基质金属蛋白酶９ 和基质金属蛋白酶２ 经酶切后活性状态的相对分子质量为８３０００及６２０００．显示基质金属蛋白酶９和基质金属蛋白酶２无显著性差异(P＞０．０５).
３ 讨论
肿瘤细胞的侵袭是以较为复杂的信号传导、蛋白水解级联过程,肿瘤细胞通过移动、降解及黏附等从原发灶向周围组织进行侵袭.肿瘤细胞在最重要的一步中是突破细胞外基质和基膜.依靠细胞表面或分泌的蛋白酶降解细胞外基质及基膜可进行肿瘤细胞的侵袭[３].如今已知众多的细胞外蛋白酶种类均可参与到细胞侵袭,其中基质金属蛋白酶可导致细胞基膜及外基质的降解, 促进肿瘤的转移和侵袭等.其中基质金属蛋白酶９和基质金属蛋白酶２是基质金属蛋白酶家族中重要的一部分,其可对细胞基质中的明胶成分进行降解, 达到破坏细胞外基质的目的.据有关的研究资料显示,基质金属蛋白酶９和基质金属蛋白酶２作为潜在肿瘤的抑制因子NECL可能抑制神经胶质瘤的迁移和侵袭[４－６].NECL可能通过与细胞外基质蛋白发生相互作用,将基质金属蛋白酶的级联反应中的负调控机制进行激活,导致基质金属蛋白酶的天然抑制物基质金属蛋白酶组织抑制剂的表达增加.本次研究结果显示,在胶质瘤U２５１细胞系中,恢复NECL１ 表达后,肿瘤细胞的侵袭及迁移遭到抑制,NECL１恢复表达的U２５１细胞有向星形胶质细胞分化的趋势等. 综上所述,神经黏附分子NECL１对肿瘤细胞的迁移和侵袭具有不同程度的抑制,并可具有对神经胶质瘤U２５１细胞向星形胶质细胞方向分化的诱导作用. 参考文献[１] 阴彬,陈涛,高静等．神经黏附分子NECL１抑制神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭并诱导其分化[J]．中国医学科学院学报,２００９,３１(６):６６９－６７３,７９１[ －７９２． ２] 高静,陈涛,阴彬等．NECL１对神经胶质瘤细胞系T９８G 增殖的影响[J]． 中国医学科学院学报,２００８,３０(３):２８０－２８３,插２． [３] 金澎,张建富,孟庆海等．神经胶质瘤诱导骨髓基质干细胞定向迁移的初步研究[J]．中华神经医学杂志,２００８,７(９):８７４－８７７． [４] 张晋,金贵善,米蕊芳等．神经胶质瘤干细胞向内皮细胞分化的差异基因表达谱的分析[J]．中华神经外科杂志,２０１５,３１(３):２９９－３０３． [５] 李铁臣,朱延玲,宫磊等．神经胶质瘤中生长抑制因子基因的表达[J]．实用医学杂志,２００８,２４(９):１５０８－１５１０． [６] 林志雄,黄强．神经胶质瘤微生态系统研究[J]．中国肿瘤,２００５,１４(２):８２－８４．
论文作者:李连进 佟建洲 崔敬 王惠宾
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/3
标签：细胞论文; 基质论文; 蛋白酶论文; 神经论文; 培养基论文; 肿瘤论文; 血清论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;