（广西科技大学第一附属医院病理科 柳州 545002）
摘要：目的 探讨免疫组化病理技术质量控制问题分析与对策。有效的质量控制对免疫组化病理技术的综合检验效果具有积极的促进作用，因此在实际工作中，需要注重病理技术的每一个操作细节，不断总结质量控制中存在的问题，并根据问题制定相应的对策，最大限度的提高免疫组化检测结果的准确性和可靠性。
关键词：免疫组化；质量控制；病理技术；对策
免疫组化技术作为一种较为高效的鉴别技术，其创建和应用对病理诊断的发展起了极大的推动作用，已成为现代生物医学的一项重要方法，具有敏感性高、能提供抗原特异性表达和准确定位[1]，特别是在疾病诊断、肿瘤分类、预后判断、指导临床治疗等方面起着重要的作用[2]。随着该项技术的不断发展，临床病理的诊断水平也得到了有效的提高[1]。但病理技术每个环节及步骤均是有机组合的，存在的密切关联性，任何一个环节的质量没有把控好均会导致制片出现质量问题，影响最终的病理诊断准确性。因此，要求试验操作严格按照规范性要求认真执行，确保每个操作环节均符合质量控制标准的要求，最大限度的降低染色操作的随意性，保障免疫组化染色制片的质量水平[18]。在实际工作中要求对免疫组化质量标准进行严格控制，总结制片过程中存在的质量控制问题，根据问题提出针对性的解决对策[6]。旨在也为临床病理诊断准确性提供有效的依据。为准确临床病理诊断奠定坚定的理论及技术基础[3]。就目前情况来看，免疫组化病理技术存在的主要问题在组织的固定、脱水、切片、染色、诊断等方面。笔者现为探讨免疫组化病理技术质量控制问题分析与对策，将近年来关于免疫组化病理技术质量控制的相关研究进行总结与分析，现综述如下：
1.免疫组化病理技术
1.1免疫组化技术简介
免疫组化技术是通过抗原与抗体特异性结合的原理，采用显色剂显色达到标记细胞某种抗原物质效果，观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况来达到诊断目的。免疫组化具有实用、快速以及经济等优点，为临床病理诊断提供了有效的依据[4]。一般情况下采用光学显微镜能观察到有色物质。就目前而言，免疫组化技术组织标本大多采用10%中性福尔马林常规固定，最基本的切片方法是石蜡切片，不仅能够保存好组织形态，且能连续切片，满足各种染色对照观察，并可长期保存。
1.2免疫组化染色方法
免疫组化染色方法有：直接法和间接法。直接法具有简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低等优点，但敏感性低、试剂成本高、应用上有一定的局限性。间接法有PAP法、ABC法、SP法、EnVision法，目前最常用的是EnVision法，染色结果较为理想。具体操作方法：组织蜡块标本经4μm连续切片，60℃烤片60min，常规脱蜡至水，必要时进行抗原修复，修复液按试剂盒说明书选择[5]，自然冷却至室温，蒸馏水充分洗后PBS洗5min×2，3%过氧化氢水溶液室温孵育10min（消除内源性过氧化物酶的活性），蒸馏水冲洗，PBS漂洗5min×3，滴加一抗37℃孵育60min，PBS漂洗5min×3，滴EnVision复合物37℃孵育30min，PBS漂洗5min×3，DAB／AEC或BCIP-NBT显色5-10 min，自来水充分冲洗后，苏木素复染，必要时盐酸酒精分化数秒，常规脱水，环保封片剂封片，显微镜下观察染色结果。
2、存在的问题及对策
2.1组织的非特异性着色
2.1．1组织处理不当或制片质量不佳
实验组织处理得当是成功制片的关键，对免疫组化染色结果的影响尤其重要，主要包括固定、取材、脱水、浸蜡、烤片等环节。（1）组织固定环节：如果组织处理不良，那么在其后的任何阶段均难以补救。固定的目的是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性或内源性的反应，防止细胞自溶，以保持组织细胞的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，防止抗原丢失或弥散。因此，标本应尽可能保持新鲜并及时固定。手术标本离体后30分钟内，用10%中性缓冲福尔马林固定。固定时间为小标本6-12h，大标本12-24h，固定液的量为标本体积的10倍。（2）取材环节：首先是所选病变组织部位不当，选取的病变组织厚薄不均或出现变性及坏死的现象，不注重标本组织位置的记录及描述工作，导致出现标本记录出现错误等现象[10]；其次取材后未及时做好标本保存工作，使标本干涸、质变或者受到污染，无法保证制片的质量[11]；另外，取材器械过钝导致组织人为挤压变形，血清蛋白弥散并固定在组织内，引起非特异性背景染色。因此，要求免疫组化病理技术人员严格按照标本取样的相关要求进行取样，并选择符合要求的标本，取样后及时做好标本保存。一方面要求工作人员对标本的各指标进行详细的记录并做出正确的描述；另一方面取材时应使用锋利的取材刀或活检钳，尽量避免带有坏死组织，取材厚度为3-4cm。（3）脱水、浸蜡、烤片环节：组织脱水开始时即使用高浓度脱水剂，使组织表面变硬，脱水液难以进入组织内，造成组织脱水不彻底；浸蜡、包埋、烤片温度过高，引起免疫反应性减弱或破坏。因此，使用组织脱水剂时应按梯度进行脱水，浓度由低至高；组织浸蜡应使用54-56℃的石蜡浸蜡，同时浸蜡时间不能过长；烤片温度不超过60℃。（4）玻片处理及切片厚度环节：用于免疫组化的玻片一般采用L-多赖酸效果很好，切片3-4μm连续切片，太溥抗原减少，会导致抗体阳性表达的减弱，太厚在热修复过程中容易脱片。切片时保证切片刀锋利，组织切片完整、无刀痕、无皱褶、无气泡。
2.1.2试剂的原因
免疫组化的每一种试剂的质量稳定性均是临床病理诊断准确性的直接影响因素[15]。常见问题：抗体（包括一抗或连接抗体）浓度过高；使用错误的封闭血清；底物孵育时间过长。对策：新抗体测试时应有不同的稀释梯度，以便确定最佳的抗体稀释度；根据连接抗体来源的动物种系，正确选用封闭血清；不同的抗体显色时间相差较大，初次接触的新抗体应采用进行性显色，便于控制显色程度。
2.1.3内源性过氧化物酶的干扰
用HRP标记的检测试剂盒进行免疫组化检测时，未封闭内源性过氧化物酶。对策：用HRP标记的检测试剂盒，必须用0.3%甲醇或3%过氧化氢水溶液封闭内源性过氧化物酶。
2.1.4免疫组化操作不当
组织切片漂洗不干净；切片脱蜡不彻底。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆对策：抗体孵育结束后，漂洗时间应充足，也可在缓冲液中加入Tween20，增强其清洁能力；脱蜡时间应充足，每缸脱蜡液脱蜡切片数不超过300张片为佳。
2.2染色不足（假阴性）
2.2.1组织原因
标本未及时固定，造成抗原成分丢失或标本在甲醛溶液中固定时间过长。对策；对新鲜组织进行及时有效的固定是保持其原有细胞固有形态的有效途径，否则标本组织会受到水解酶的影响而导致组织发生自溶 [13]，要求试验标本离体后以最快的速度将其放置到固定液内，确保组织标本得到及时有效的固定[14]。对策：组织离体后及时固定，大肿物需切开固定。
2.2.2试剂的原因
常见问题：一抗与检测试剂盒不匹配；抗体浓度过低；一抗或连接抗体失效；抗体选用错误；不适合的缓冲液用于酶和底物色原试剂的制备。对策：根据一抗的动物种属，正确选择检测试剂盒；所有试剂用于临床检测前必须进行试剂的有效性检验、避免使用过期抗体、即用型抗体应放存4℃冰箱保存；认真阅读试剂说明书；根据不同的底物-色源选择合适的缓冲液。
2.2.3操作不当的原因
常见问题：未进行抗原修复或热抗原修复未达到所需的最佳温度；抗原修复液选择不当；未设立阳性或阴性对照；抗体孵育时间过短；滴加抗体前，组织切片上残留过多的稀释液，造成抗体过度稀释；ACE显色的切片，不恰当的用无水乙醇脱水。对策：恰当的进行抗原修复，通常使用高压锅热抗原修复，喷气后2分钟关火，自然冷却；抗原修复液首选柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），对于比较难于表达的抗体多选择Tris和EDTA缓冲修复液；设立阳性或阴性对照，免疫组化抗原的阳性与阴性对照实验的设立，目的是有效检验免疫组化染色结果，提高免疫组化染色结果可信性最直接有效的手段，同时也是操作者自我保护的一种方式[17]；根据多次预实验确定最佳抗体孵育时间；滴加抗体前将组织切片上的缓冲液甩干；ACE显色的阳性产物不用乙醇脱水。
3、免疫组化染色的质量控制
质量控制是监控全过程，排除不同操作者或不同实验室之间的误差，维持标准化现状的一个管理过程。这个过程是通过一个反馈环路进行的。质量控制的环路：（1）确定控制对象。（2）规定控制对象的标准。（3）制定或选择控制方法和手段。（4）实际执行情况。（5）比较实际执行情况与制定的标准之间的差距，并找出原因。（6）采取措施，解决差距。
3.1免疫组化染色质量控制
免疫组化质量控制是对免疫组化检测全过程（从临床医师手术切除标本至免疫组化报告的发出）的检查和监测，是在标准化的基础上建立的。免疫组化病理技术质量控制问题还是当前病理学界研究者亟待探讨并值得深入研究的一个重要课题[2]。制度化、规范化操作是实现标准化操作的前提条件[14，15]，有效的质量控制能保证免疫组化染色结果达到预期的最佳效果。分为室内质量控制和室间质量评价。
3．1．1室内质量控制
（1）全员参与，操作人员必须具备相关的免疫组化知识。病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，提高免疫组化诊断水平，确保免疫组化诊断的准确性。病理技术人员是免疫组化实验成功的关键，操作人员必须要有高度的责任心，丰富的免疫组化理论知识及熟练的染色技术，清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。新技术人员必须经过专门的培训才能上岗。（2）高质量的试剂和可靠的实验方法是每个实验室的必备条件。由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件（包括是否需要抗原修复、抗原修复的方法、修复液的PH值、抗体的最佳孵育时间和温度、一抗最佳的稀释度等），并将其整理成SOP文件，严格按照SOP文件所规定的执行。所有新试剂（包括新批号）必须经过试剂的有效性验证才能用于日常外检，选择一抗及检测试剂盒还应考虑一抗与检测试剂盒的匹配，标记酶与显色剂的匹配。（3）合理设立对照，要求每次检测必须设有阳、阴性对照组。（4）全自动免疫组化染色仪的应用：全自动免疫组化染色仪从切片的预处理到苏木素复染，全过程在仪器上完成，每张切片均有独立的温度控制器，从真正意义上做到个性化处理，能更好地优化每种抗体的实验条件，对免疫组化染色质量起着重要作用。但是，相同抗体不同实验室之间的染色程序可能存在一定的差异，因此，每种抗体的染色条件必须经过测试，从中挑选最佳的染色条件，并整理成SOP文件，作为该抗体的常规染色程序，这才能从真正意义上做到质量控制。（5）负责免疫组化检测的技术员必须对所有的免疫组化染色切片进行初筛，染色结果正常，切片才能送交医师，发现染色异常应及时查找原因，并立即制定改进措施。
3．2．2室间质量评价：
由病理质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的检测结果，并发现室内控制不易发现的问题，了解各实验室之间染色结果的差异，帮助找出原因及提出改进措施，使染色结果更具可比性。
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论文作者:龚广
论文发表刊物:《航空军医》2018年9期
论文发表时间:2018/7/30
标签：免疫论文; 病理论文; 抗体论文; 组织论文; 切片论文; 抗原论文; 质量控制论文; 《航空军医》2018年9期论文;