周大炜[1]2003年在《药物-蛋白结合作用的HPCE和HPLC法研究》文中进行了进一步梳理本论文进行了平衡条件下测定药物-蛋白混合溶液中游离药物浓度的高效毛细管电泳和高效液相色谱分析方法研究。其目的是为新药研究和治疗药物监测中研究药物-蛋白结合作用提供简单、耐用、易操作和可行的方法。 一、药物-蛋白结合作用的高效毛细管电泳法 采用毛细管电泳-迎头分析法(CE-FA)，以67mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液为运行缓冲液，214nm下检测，测定了40μmol·L~(-1)人血清白蛋白与两个浓度水平的临床需监测药物达平衡后的混合液中药物的游离浓度。研究的药物包括：酮洛芬、茶碱、氯霉素、氧氟沙星、氯氮平和盐酸阿米替林，它们的化学结构、疏水性、生理pH条件下的电荷和电泳迁移行为各异。还应用此法研究了18-甲基炔诺酮对酮洛芬-人血清白蛋白结合作用的影响，结果发现18-甲基炔诺酮不能将酮洛芬从它的第一类结合位点上置换出来，而高浓度的18-甲基炔诺酮可将酮洛芬从它的第二类结合位点上置换出来。 采用毛细管电泳-迎头分析模式首次测定了人血清白蛋白溶液、人血浆、兔血清和血浆中游离氯氮平的浓度。试样不经处理直接进样至未涂层毛细管。将游离氯氮平与内源性杂质有效分离的最优运行缓冲液为含1mmol·L~(-1) EDTA和0.5mol·L~(-1)甘氨酸的67mmol·L~(-1)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。根据前沿峰的峰高直接测定游离氯氮平的浓度。方法与传统超滤法比较有很好的相关性。研究结果表明氯氮平与人血清白蛋白结合很少，但在人血浆、兔血清和血浆中有较强结合。此方法能够测定纳升级样品体积的多种平衡共存体系中游离药物的浓度，因而特别适合只能获得微少生物样品的蛋白结合作用研究。 采用亲和毛细管电泳法(ACE)，以20mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5mol·L~(-1)，EDTA 1mmol·L~(-1))为运行缓冲液，药物茶碱做运行缓冲液的添加剂，样品为含5％丙酮的30μmol·L~(-1)人血清白蛋白溶液，214nm下检测，测定了茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数，结果与文献值吻合得很好。采用毛细管电泳-配体分离法，测定了40μmol·L~(-1)人血清白蛋白与临床需监测药物达平衡后混合液中药物的游离浓度。毛细管两端施加的电压为负10kV，运行缓冲液为20mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5mol·L~(-1)，EDTA 1mmol·L~(-1))，其他条件同CE-FA法。测得的游离药物浓度与传统的超滤法吻合得很好。研究沈阳药科大学博士学位论文摘要旦旦旦口国里且鱼国旦口反旦且口口的药物包括:酮洛芬、盐酸丙米嗦、盐酸利多卡因、氯氮平和盐酸阿米替林。发现氯氮平和盐酸阿米替林几乎不与人血清白蛋白发生结合作用。 本论文详细、深入地讨论了上述叁种高效毛细管电泳模式的机理、优缺点及应用范围，由于不同模式得到的定性和定量信息的类型、应用条件和范围各异，通常根据被研究系统的本质来确定最优实验方法。 二、药物一蛋白结合作用的高效液相色谱法 采用高效液相色谱一迎头分析法，以67mmol.L一，印H7.4，I=0.17mol.L一‘)的等渗磷酸盐缓冲液为流动相，Pinkerton GFFn一55一80内表面反相柱(1 50‘4.6~，5娜)为固定相，214lun下检测，测定了系列浓度范围的酮洛芬、格列本脉和格列美脉与40脚ol.L一，人血清白蛋白结合作用的参数。通过非线性回归参数估算分别求得3个药物的结合参数。结果表明人血清白蛋白分子上3个药物的高低结合位点共存。采用超滤一高效液相色谱法测定了5个硫酞脉类药物与人血清白蛋白的结合作用，蛋白结合率由高到低的顺序为:格列美脉>格列本脉>格列齐特>格列哇酮>格列毗嚓。发现对于给定的系列非极性弱酸性化合物，蛋白结合率的高低与药物的疏水作用成正比。但毛细管电泳一迎头分析法的结果表明选定药物的疏水性和电泳迁移行为与其蛋白结合率的相关性不显着，影响药物一蛋白结合作用的因素有待深入研究。 叁、实验数据的后处理研究 首次根据非线性回归最小误差平方法运行SAS中的“玛克低特”(MarquardtMethod)迭代法自编程序进行了药物一蛋白结合参数的估算，详细讨论了算法的基本原理和应用中需注意的事项。发现算法的选择，优良初始值的确定和对结果的评估叁者决定了输出的结合参数是否为最优化值。
潘婷婷[2]2017年在《HPCE法对体内及制剂中四种降糖药物的分析测定》文中进行了进一步梳理糖尿病的发病率日渐增加,降糖药物是调节血糖水平的主要治疗办法之一,因此对于降糖药物制剂的质量控制及体内药代动力学研究具有重要意义。本论文主要采用高效毛细管电泳法(HPCE)对体内及制剂中四种降糖药物进行分析。论文主要内容分为以下几部分:第一章:主要介绍药物制剂质量研究的内容、意义及其分析方法;体内药物分析的内容、特点、意义及其所用分析方法;降糖药物的研究概况等。第二章:建立了高效毛细管电泳法(HPCE)同时分析测定盐酸二甲双胍(Metformin hydrochloride,MET)、盐酸罗格列酮(Rosiglitazone hydrochloride,RLZ)、瑞格列奈(Repaglinide,RGN)和格列美脲(Glimepiride,GLM)等四种降糖药的方法,并对其六种不同制剂进行了含量测定。选定的实验条件为:石英毛细管色谱柱(50μm i.d.×61cm,有效长度50 cm),5 mmol/L、p H7的磷酸氢二钠溶液为运行缓冲液,检测波长为203 nm,运行电压为17 kv。该方法成功应用于六种降糖药制剂的含量测定,测得制剂中主药的标示量百分含量均不少于96.00%。该方法提供了良好的线性范围、精密度(日内精密度RSD≤0.99%,日间精密度RSD≤1.97%)、回收率(98.88%~102.50%),四种药物在7 min内实现基线分离。所建立的HPCE法可快速、准确地测定单一制剂和复方制剂中盐酸二甲双胍,罗格列酮,瑞格列奈,格列美脲四种降糖药物的含量。第叁章:实验室自制盐酸二甲双胍格列美脲复方片,采用HPCE和HPLC两种分析方法测定制剂中两种主药含量,并对两种方法的结果进行了比较。HPCE法测得MET与GLM的线性范围分别是12.5~3750μg/m L(n=8,R=0.9997)和1~200μg/m L(n=7,R=0.9983);两种药物的检测限(LOD)均为0.1μg/m L;日内精密度RSD≤1.22%,日间RSD≤1.66%;高、中、低叁种浓度的平均回收率为98.33%~100.61%;3批复方降糖片中MET和GLM的标示量百分含量分别不少于99.93%和99.00%;HPLC法测得MET与GLM的线性范围分别是1~100μg/m L(n=8,R=0.9971)和0.1~100μg/mL(n=10,R=0.9954);检测限(LOD)分别为0.1μg/mL和0.08μg/m L;日内精密度RSD≤0.42%,日间RSD≤0.62%;高、中、低叁种浓度的平均回收率为98.05%~100.67%;3批复方降糖片中MET和GLM标示量百分含量分别不少于99.07%和98.50%。与HPLC比较,HPCE法的精密度、重现性和LOD稍差于HPLC法,但HPCE法具有高分辨率与灵敏度,简便、绿色环保、成本低等优点。第四章:采用HPCE法对格列美脲(GLM)和盐酸二甲双胍(MET)兔体内药代动力学进行研究。分别随机单剂量口服给予新西兰兔市售格列美脲片、市售盐酸二甲双胍片和自制复方盐酸二甲双胍格列美脲片,测定药物在24h内的血药浓度,绘制药物的药-时曲线,并对药代动力学参数进行分析。分析检测条件为:石英毛细管色谱柱(75μm×61 cm,有效长度50 cm);35 mmol/L Tris缓冲液(pH为7.5);运行电压17 kV;紫外检测波长229 nm;温度为25℃。结果表明:建立的HPCE法用于研究叁种制剂的兔体内药代动力学专属性良好;样品前处理简单,血浆样品只需经甲醇沉蛋白离心后取上清液即可用于检测;高、中、低叁个浓度回收率(93.63%~108.16%)和方法的精密度(RSD≤3.29%)良好。市售格列美脲片中的GLM和盐酸二甲双胍片与自制复方盐酸二甲双胍格列美脲片中的MET分别在4、1和1.5 h达峰,Cmax分别为6.99、5.27和3.89μg/m L。HPCE方法的建立为四种降糖药在体内药代动力学的研究提供新思路,拓展了分析方法的选择性。
曹坤[3]2016年在《款冬花化学成分分离分析和质量控制指标研究》文中提出款冬花为菊科款冬属植物——款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾,是一种常用中药,具有润肺下气,化痰止咳的功效,在历版《中国药典》中均有记载。款冬花是重庆的一种道地药材,具有良好的应用前景。国内外关于款冬花的基础研究主要集中于款冬酮、芦丁、槲皮素等几种常见的有效成分,现行的质量控制标准也只对款冬酮进行含量限定,质控指标单一,缺乏针对有效的质量控制指标和相应的质控方法,款冬花药材质量、用药的有效性和安全性难以保证。针对上述问题,本论文在总结近年来关于天然植物分离分析和质量控制的文献基础上,将提取分离、纯化和分析检测技术有机结合,根据款冬花中不同类型化学成分的性质和特点,提出了多指标、多参数质控体系,重点针对款冬花的标示成分(款冬酮)、有效成分(黄酮类、有机酸类等)、毒性成分(生物碱)和可综合利用成分(多糖)这四个方面,开展了多种化学成分的高效分析方法和技术的研究,最终提出了款冬花药材质量控制指标的新方案建议。本文的主要研究工作及结果如下:(1)对款冬花的化学成分、分离分析方法、药理活性等进行了系统的文献综述,结合近年来天然植物分离分析和质量控制的相关研究,提出了款冬花质量控制指标研究的总体方案。(2)根据款冬花中有效成分、毒性成分、可综合利用成分的性质和特点,采用溶剂提取法对款冬花中有效成分进行了提取,应用柱层析、制备薄层色谱等技术对款冬花甲醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏进行系统分离,分离并鉴定了8种化合物。采用酸水提取法制备了款冬花总生物碱,通过酸性染料比色法测定了款冬花酸提物和总生物碱中的生物碱含量。采用水提醇沉法制备了款冬花多糖,然后经分级醇沉获得叁种醇沉多糖即40%多糖(TPS-1)、60%多糖(TPS-2)、80%多糖(TPS-3),为款冬花有效成分、毒性成分、可综合利用成分的的分析提供了物质基础。(3)应用HPLC技术分析了款冬酮所处的萃取部位,研究了HSCCC溶剂体系的筛选方法,提出了高效分离的叁元两相溶剂体系,建立了款冬酮快速分离制备的技术路线,同时制备了14-acetoxy-7β-(3'-ethyl cis-crotonoyloxy)-lα-(2'-methylbutyryloxy)-notonipetranone,为标示成分的高效制备和质量控制研究奠定了基础。(4)采用胶束毛细管电泳模式对款冬花甲醇提取物中的款冬酮进行了检测,测得药材中款冬酮含量为1.66 mg·g-1;重点开展了黄酮类、有机酸类等多种有效成分的HPCE同时测定研究,优化了影响电泳分离的主要参数,获得了款冬花甲醇提取物的最优分离条件,实现了款冬花中多种成分的在线同时检测,识别了2,2-二甲基-6-乙酰基苯并二氢吡喃酮、芦丁、异阿魏酸、金丝桃苷、阿魏酸、绿原酸、异绿原酸、槲皮素、没食子酸、咖啡酸等10种有效成分,并测定了除没食子酸外其他9种有效成分的含量。(5)针对款冬花中毒性生物碱含量低、难以检测的问题,首先应用吡咯显色法开展了总生物碱中的RET-PAs的衍生化研究,实现了总生物碱中RET-PAs的定量测定;然后采用场放大进样-胶束扫集两步富集技术,优化了影响分离和富集效果的因素,建立了基于HPCE技术的款冬花PAs高效快速分析方法,实现了款冬花总生物碱中克氏千里光碱和千里光宁碱的高效定量检测。与常规MEKC相比,该富集方法灵敏度有了较大的提高,富集倍数为12倍和15倍,检测限达2.8μg·L-1和4.2μg·L-1。并通过UV和MS技术鉴定了总生物碱中其他两种主要化合物,咖啡酸甲酯和阿魏酸甲酯。该方法还被应用到款冬花酸性提取物的PAs检测中,实现了克氏千里光碱的有效检测。(6)针对款冬花多糖的综合利用需要,应用苯酚硫酸法和间羟基联苯比色法考察了款冬花多糖(TPS)及叁种醇沉多糖(TPS-1、TPS-2、TPS-3)的中性糖和酸性糖含量,通过红外对其构型进行了初步分析。结合多糖的多羟基结构,建立了PMP-CZE快速分析款冬花多糖中7种单糖的分析方法,优化了影响电泳分离的主要参数,确定了最优分析条件,实现了对款冬花多糖和叁种醇沉多糖的单糖组成的快速分离和定量分析,为款冬花多糖组分的质量控制提供了有效的方法。采用DPPH法和CAA法分别从分子和细胞水平评价了粗多糖和叁种醇沉多糖的抗氧化活性。测定结果显示款冬花多糖和叁种醇沉多糖均具有抗氧化活性,其中TPS-2具有最强的抗氧化能力。结合酸性多糖的分子量、抗氧化活性及单糖组成信息,发现多糖的抗氧化活性与分子量、单糖组成有关。(7)基于上述研究,从标示成分、有效成分、毒性成分叁个方面,初步设计了款冬花药材中质量控制指标的分析检测提高方案。新方案将影响用药有效性和安全性的重要指标——有效成分,毒性成分纳入质量控制体系,应用HPCE技术较为系统的对这些质控指标进行了分析和含量限定,完善了现有的质控指标,为款冬花的质量控制标准的提升和进一步开发利用奠定了基础。
黄平[4]2008年在《黔产杜仲指纹图谱及有效成分含量测定的研究》文中进行了进一步梳理目的对黔产杜仲进行质量控制的研究,建立杜仲HPLC指纹图谱和HPCE指纹图谱分析方法,考察黔产杜仲质量的稳定性;探索建立杜仲质量控制的新方法;为杜仲质量标准的建立提供一定的实验依据。方法选取12批产贵州不同地理来源的杜仲药材进行研究,考察不同提取方法、料液比对提取杜仲药材中有效成分的影响,选取影响提取效率的叁个主要因素提取溶剂,提取时间,提取次数,采用正交设计实验对质量分析测定的前处理工艺进行优化。分别采用高效液相色谱仪和高效毛细管电泳仪对杜仲进行指纹图谱分析,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004年A版(国家药典委员会开发)对杜仲HPLC指纹图谱和HPCE指纹图谱进行评价,选取不少于10批具有代表性的杜仲药材,建立杜仲药材HPLC指纹图谱和HPCE指纹图谱的共有模式,分析不同地理来源的黔产杜仲药材的相似度,考察黔产杜仲的稳定性。在进行HPLC指纹图谱分析的同时建立杜仲药材有效成份含量测定的方法。采用内标法建立毛细管区带电泳测定杜仲药材中绿原酸含量的新方法。将具有代表性的杜仲药材按照2005版中国药典的盐制法进行盐制,对盐制品进行HPLC指纹图谱分析,建立盐制品HPLC指纹图谱共有模式,比较杜仲炮制前后HPLC指纹图谱共有模式的变化,从而反映杜仲炮制前后化学成分的变化。结果确定了对杜仲进行质量分析的前处理工艺为:5倍量60%乙醇对杜仲药材絮状粉末超声提取一次,提取时间为30min。建立了同时进行杜仲HPLC指纹图谱分析和指标成分含量测定的研究方法。12批黔产杜仲中有的2批HPLC指纹图谱相似度低于0.90,舍去后对剩下的10批杜仲药材及其盐制品进行相似度评价,杜仲药材相似度在0.904~0.989之间,盐制品相似度在0.904~0.999之间,并建立了10批杜仲药材及盐制品的HPLC指纹图谱共有模式,确定共有峰19个。杜仲药材松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸的含量分别为1.042～4.47mg·g-1,0.053～2.435mg·g-1。建立杜仲HPCE指纹图谱的研究方法和杜仲药材中绿原酸HPCE含量测定方法。10批黔产杜仲HPCE指纹图谱相似度在0.903~0.991之间。结论杜仲HPLC指纹图谱和HPCE指纹图谱分析方法操作简单,精密度高,重复性好,均都可用于杜仲质量的控制。黔产杜仲大部分质量稳定可控,少数产地杜仲质量存在差异有待进一步研究。HPCE分析方法简便,快速,分析成本低,在一定程度上弥补里高效液相色谱的不足,为杜仲质量控制提供了新的方法。
杨燕[5]2008年在《中药丹参和蒲黄的药代动力学研究》文中指出药物代谢研究在药物研究与开发上占举足轻重的地位,中药活性成分的代谢研究近几年也越来越引起人们的重视。本文采用CE和HPLC分析手段研究了中药丹参和蒲黄的药代动力学,取得了如下成果:一、建立兔血浆中丹参素的MEKC分析方法。采用高氯酸沉淀蛋白,乙酸乙酯萃取兔血浆中的丹参素,在MEKC优化条件下,对样品进行分析。该方法的线性范围为0.4～400μg/mL,LOD为0.08μg/mL,精密度的RSD为1.1～5.8%,平均回收率为84.95～104.20%。结果表明,所建立的MEKC方法线性范围宽,灵敏度高,准确性好,适合于丹参素的药代动力学研究。二、以丹参水提液给兔灌胃,采用MEKC方法研究丹参素在兔体内的药代动力学。药时曲线和药代动力学参数表明:血中丹参素浓度的经时变化符合二室开放模型,兔灌胃丹参水提液后46.9 min达到最大血药浓度,h_(1/2α)为46.9 min,t_(1/2β)为69.3min。叁、建立了兔血浆中槲皮素、山奈素和异鼠李素的RP-HPLC同时分析法。以叁氯乙酸为蛋白沉淀剂,水饱和正丁醇与乙酸乙酯的混和溶剂为最佳萃取剂。采用的色谱柱为C_(18)(4.6 mm×150mm,5μm),流动相为0.1%磷酸水溶液:乙腈=73:27。槲皮素、山奈素和异鼠李素的线性范围均为0.05～2.5μg/mL;LOD分别为0.03μg/mL、0.02μg/mL和0.02μg/mL;精密度和准确度均在±15%以内。该分析方法灵敏、准确,适合于蒲黄中黄酮类化合物的药代动力学研究。四、健康新西兰大白兔单剂量灌胃蒲黄的醇提水解液,以RP-HPLC法同时测定给药后不同时间点槲皮素、山奈素和异鼠李素的血药浓度,用DAS程序计算药动学参数。结果表明:叁个指标成分的药动学过程均符合二室开放模型。槲皮素、山奈素和异鼠李素的T_(max)分别为32.5,35.0和35.0 min;t_(1/2α)分别为41.67,16.16和29.73 min;V1/F分别为14.18,9.48和84.01 L/kg。五、针对蒲黄中槲皮素、山奈素和异鼠李素叁种黄酮类成分生物利用度低、溶解性差的问题,拟用环糊精包合作用提高其生物利用度。采用淌度移动法研究这叁种黄酮类化合物与环糊精的包合常数及包合反应的热力学参数,初步研究其包合过程的机理。
汪宇[6]2002年在《蛹虫草的人工培养及其核苷类化合物的研究》文中研究说明本文主要探讨了蛹虫草的人工培养条件和对其代谢产物—核苷类物质进行的提取、分离、结构鉴定、含量测定及生物活性的研究。 以菌丝的生长速度和产孢力为指标，筛选了蛹虫草斜面菌种培养基和较为合适的菌龄；以菌丝的发酵得率为指标，优化了人工培养蛹虫草液体培养基并考察了液体培养的外部条件；以子座干重为指标，优化了蛹虫草固体培养基。以人工培养蛹虫草子座为原料，分离得到腺苷、虫草素。 TLC实验证实固体培养蛹虫草子座、液体培养菌丝含有与野生蛹虫草子座、虫体相同的核苷类成分，如虫草素、腺苷等。HPCE法定量测定结果显示固体培养蛹虫草子座和液体培养蛹虫草菌丝中虫草素的含量可分别达野生子座的5.04和10.85倍。HPLC法测定固体培养蛹虫草白色和转黄菌皮中虫草素的含量分别为57.67mg／g和85.16mg／g。 初步药理实验显示：人工培养蛹虫草中总核苷在体内和体外对肝癌H_(22)细胞有一定的抑制作用。同时，可延长荷瘤鼠的生存时间、改善其生存质量、抑制癌灶向其他脏器的转移。
付英杰[7]2010年在《阿胶低肽及其制剂的研究》文中研究指明本文采用生物酶解法得到阿胶的药效物质。以药效学为指标,确定了口服用及注射用阿胶低肽的有效分子量及安全分子量范围,并考察了其量效关系；以低肽含量为指标,进行了单因素考察,在此基础之上,以正交实验设计优选了阿胶酶解工艺；以膜分离技术对酶解液进行了纯化,考察损失率以优化其精制工艺,并制成了口服用及注射用阿胶低肽冻干粉；以Sephadex、HPCE、HPLC等各种技术,对阿胶低肽冻干粉溶液进一步分离后,分别以SDS-PAGE、细胞培养法进行谱效关系的研究、以HPLC-MS法对其有效峰进行结构研究；最后对制剂进行了安全性检查、药效学研究及质量标准研究。以致敏活性为指标,通过实验确定了口服用低肽有效分子量范围为<5kD,注射用低肽安全及有效分子量范围为1kD-3kD。<5kD分子量范围的阿胶低肽,其剂量与药效在5mg·kg1-15mg-kg-1范围内呈正相关,1kD-3kD分子量范围的阿胶低肽,其剂量与药效在1mg·kgl-20mg·kg-1范围内呈正相关。阿胶低肽优选制备工艺为：口服用低肽的酶解工艺：酶解温度为42℃、胃蛋白酶酶解pH为2.0、胃蛋白酶酶量10万U·g-1、胃蛋白酶酶解时间为1.5小时、胰蛋白酶酶解pH为8.0、胰蛋白酶酶量为5千U·g-1、胰蛋白酶酶解时间为2.5小时；注射用阿胶低肽的酶解工艺：酶解温度为42℃、胃蛋白酶酶解pH为2.0、胃蛋白酶酶量10万U·g-1、胃蛋白酶酶解时间为2小时、胰蛋白酶酶解pH为8.0、胰蛋白酶酶量为5千U·g-1、胰蛋白酶酶解时间为3小时；超滤工艺：取50g阿胶粉制成阿胶低肽酶解液,稀释至1000mL,水浴预热至40℃,在柱压0.15±0.01MPa下分别经过截留分子量30kD、5kD(口服用)、3kD(注射用)的超滤膜超滤,并水洗一次。口服用阿胶低肽无异常毒性,为实际无毒物质；注射用阿胶低肽无明显致敏性,无毒副作用,无热原反应。采用4种常见贫血模型(相当于临床上常见的长期中毒性、失血性、化疗性、放疗性贫血)；证实阿胶低肽对不同类型的贫血具有不同程度的改善作用；小鼠负重游泳实验和血清尿素氮及肝糖原测定表明,阿胶低肽具有一定的抗疲劳作用趋势；小鼠免疫增强实验表明,阿胶低肽可提高小鼠循环抗体血清溶血素水平、增强DNCB诱导小鼠DTH反应,从而对机体体液免疫、细胞免疫发挥作用；此外,对非特异性免疫巨噬系统也有一定的促进作用。通过澄清度、pH、密度及纯度检测可以检验口服用阿胶低肽的质量。通过检查可见异物、不溶性颗粒、pH、分子量范围、纯度(或低肽含量)及升血效价可以检验注射用阿胶低肽的质量。通过对阿胶低肽及其几个组分的Tricine-SDS-PAGE研究,确定了阿胶低肽成品制剂的分子量在2kD以下,可作为阿胶低肽定性鉴别的方法。稳定性实验表明,存储于西林瓶中的注射用阿胶低肽冻干粉可于4℃下存储2年。在完成阿胶低肽制剂的基础上,进一步研究了其成分及结构。首先用分子筛将阿胶低肽分成3个组分；然后将几个组分进一步纯化后进行了细胞培养,同时研究了其中肽含量较多的2号及3号峰的HPLC分析方法；从而得出2号峰是有效组分的结论；最后将2号峰进行HPLC-MS检测,通过SEQUEST和Mascot两种搜索引擎进行搜索,得出了2号峰中可能含有的肽碎片序列。
魏英勤[8]2003年在《中药复方血糖宁有效部位的研究》文中研究指明中药复方(又称方剂)是中医遣方用药的主要形式，中药复方化学的研究又是制约中药复方研究的“瓶颈”所在，弄清中药复方产生疗效的物质基础，对于新药的研制开发，中医理论方剂配伍内涵的科学阐明，对于生命科学的深层次认识，以及中医药现代化都具有重要意义。本文在中药复方研究的基础上，结合实践体会，认为有效部位是中药复方研究的核心问题，提出了“有效成分组是采用现代各种分离手段获得的能够保持原中药复方临床疗效的不可继续分割的分子集合体”的观点，并且认为有效部位的深入细致的研究，将为最终实现中医药理论从药味配伍向化学成分配伍的质的飞跃奠定基石。本课题选用主要由黄连、黄柏等药材组成的经临床验证疗效确切的中药复方血糖宁为研究对象，以降血糖效果为评价指标分离分析了血糖宁的有效部位。主要工作及成果如下： 建立了同时测定血糖宁复方原料药材、原方提取物中四种生物碱含量的RP-HPLC方法，并以四种生物碱、总碱和浸膏得率为指标采用正交设计优化了血糖宁的提取工艺。采用HPCE法比较了喷雾干燥法和烘干法对血糖宁原方提取物有效成分和性质的影响。 以大孔树脂洗脱液中生物碱的含量作指标，选择洗脱液乙醇浓度、洗脱液用量、洗脱液盐酸浓度叁个因素，用L_9(3~4)正交表优化了黄连提取液的大孔树脂洗脱条件。并以洗脱液中生物碱的含量作指标，考察了上样体积、上样量、上样流速、清洗溶剂对于黄连提取液吸附效率的影响。分离了血糖宁的大孔树脂洗脱部位并进一步进行了分离纯化与含量测定。 通过控制剂量、禁食时间等因素，使制作的四氧嘧啶糖尿病小鼠模型造模成功率可达100％，死亡率为0，糖尿病小鼠30日之内稳定。通过药理实验确认了中药复方血糖宁的有效部位，进行了血糖宁部位Ⅲ_2的主要药效学实验的研究，考察了影响血糖测定的因素，并测定了血糖宁部位Ⅲ_2的LD_(50)。 进行了血糖宁的质量标准研究，采用TLC对方中主要组成药味及制剂进行了定性鉴别，利用TLCS和HPLC对方中主要组成药味及制剂中的生物碱进行了含量测定，并并考察了其初步稳定性。 建立了血糖宁原料药材黄连、部位Ⅲ和部位Ⅲ_2的HPCE指纹图谱，并将其用于质量控制和评价。建立了血糖宁及其缺味药部位＊的Bayes法识别模型，该模型对血糖宁及其缺味药部位＊正确识别率为100％。进行了药动学方面的初步研究，建立了灌胃黄连煎剂的大鼠尿样中成分的eCE指纹图谱，发现黄连生物碱主要以原型药物排出，与文献结论一致。 本文分离并明确了中药复方血糖宁的有效部位，并对其进行了含量测定、药效、质量控制、指纹图谱等方面的研究，研究结果表明生物碱是中药复方血糖宁降血糖作用的主要物质基础。实验结果将形成中药新药的有关资料，从而产生较大的社会效益和可观的经济效益，同时也将为血糖宁有效成分组的全面揭示、为中医用药组方机理和规律的深层次认识提供素材和实验依据。
郑海涛[9]2008年在《苦参碱对人白血病K562细胞表观遗传因素影响的机制研究》文中认为苦参碱是中药苦参的主要成分之一,我们前期研究发现苦参碱诱导了人白血病K562细胞分化和凋亡,但是分子机制尚不清楚。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一,在肿瘤的基因异常表达起着重要作用。文献报道RIZ1基因是一种抑癌基因,在K562细胞中由于RIZ1基因启动子高甲基化导致其表达低下。在本论文中我们分别采用RT-PCR和甲基化特异性PCR(MSP)技术研究了苦参碱作用K562细胞后,其RIZ1基因mRNA表达水平和RIZ1基因启动子甲基化情况。同时我们还运用毛细管电泳(HPCE)、高效液相(HPLC)和甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)技术检测了苦参碱对K562细胞基因组整体甲基化的影响。此外,利用RT-PCR技术还测定了RIZ1下游基因IGF-1 mRNA水平的表达情况。方法:1.以5-Aza CdR为去甲基化对照药物,分别用苦参碱、苦参提取液处理常规培养的白血病细胞K562株。根据实验观察的需要设置不同时间处理组。2.利用半定量RT-PCR方法检测了苦参碱作用K562细胞不同时间后RIZ1基因mRNA水平表达的变化,并同苦参提取液与DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza CdR分别诱导的RIZ1基因表达变化进行了比较。还利用RT-PCR检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA及IGF-1 mRNA表达的变化。3.运用MSP检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后RIZ1启动子甲基化状态。4.利用HPCE、HPLC、甲基化敏感性限制性内切酶法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后对基因组整体甲基化水平的影响。结果:1.通过实验发现RIZ1基因的mRNA在对照组K562细胞低表达,经苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,并呈时间依赖性;同样,5-Aza CdR作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达也明显增高。2.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因启动子发生去甲基化。3.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3BmRNA表达无明显变化。4.HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低,但无统计学意义。5.用酶切法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后对基因组整体甲基化水平无明显影响。6.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后IGF-1 mRNA表达无明显变化。结论:1.K562细胞抑癌基因RIZ1启动子是处于高甲基化状态,导致该基因低表达。苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,说明苦参碱抗白血病作用与诱导抑癌基因RIZ1表达有关。2.苦参碱诱导K562细胞抑癌基因RIZ1上调与中药苦参提取液作用一致,提示苦参碱是苦参抗肿瘤作用的主要活性成分。3.实验结果显示苦参碱、苦参提取液和5-Aza CdR处理K562细胞后RIZ1启动子发生去甲基化,提示RIZ1基因被诱导表达上调是RIZ1基因启动子去甲基化作用所致。4.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3BmRNA表达无明显变化,说明苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR未通过调控DNMTsmRNA转录水平而诱导DNA去甲基化。5.HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低,而用甲基化敏感性限制性内切酶法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后对基因组整体甲基化水平无明显影响,综合说明苦参碱、苦参提取液对K562细胞基因组DNA整体甲基化水平无明显作用。6.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因下游的IGF-1基因mRNA并没有随RIZ1表达上调而发生明显变化,其原因在本研究中尚不清楚。
黄必胜[10]2005年在《半夏的品质及抗肿瘤活性研究》文中指出目的:进行半夏的品质和抗肿瘤活性研究。 方法:在半夏品质研究方面,采用高效液相色谱(HPLC)测定半夏中琥珀酸的含量,采用高效毛细管电泳(HPCE)测定半夏苯甲酸的含量,采用紫外分光光度法测定蛋白质总含量。采用等电聚焦(IEF)和SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离半夏中蛋白质,采用随机扩增多态DNA技术(RAPD)进行半夏DNA分子鉴别和遗传多样性研究,在半夏抗肿瘤活性方面,采用MTT法测定半夏不同提取物及半夏蛋白对体外培养肿瘤细胞系Bel-7402细胞和HT-29细胞生长的抑制作用,并采用流式细胞术测定其对肿瘤细胞凋亡的影响。 结果:建立了用HPLC法进行半夏等药材的琥珀酸含量测定方法,利用该方法测定样品,所选择的包谱条件对琥珀酸的分离较好,其它组分不干扰琥珀酸的测定,色谱峰图形对称,基线平直。稳定性、重现性、精密度均较好。但不同产地的半夏以及同一产地的不同采收期以及同一采收期的大粒与小粒的含量有较大的差异性。不同地区半夏样品的琥珀酸含量差别较大。建立了应用HPCE方法进行半夏药材的苯甲酸含量测定方法。由于苯甲酸紫外吸收强,该方法样品和试课目用量少,分离效率高,稳定性和重现性较高,不同地区半夏苯甲酸含量在0.014～1.568%。紫外吸收法可以测定半夏总蛋白的含量。SDS-PAGE结果显示不同产地半夏具有相似的图谱,半夏与其类似品图谱差异较大,能够起到鉴定作用。并用SDS-PAGE电泳法建立了半夏蛋白特征谱带的分子量测定方法。建立了应用IEF技术分离和鉴别半夏蛋白的方法,多次实验显示:IEF图谱具有较好的稳定性和重现性,为目前半夏蛋白质鉴别较好的方法,它可以区别半夏及其类似品,还可以鉴别某些炮制品,如清半夏、姜半夏等。IEF技术不仅能够较好地分离半夏蛋白质,还可以对各种半夏蛋白质特征谱带的等电点(PI)进行定量分析。运用RAPD技术对半夏遗传多样性进行了研究,分析结果显示,半夏野生转裁培对其遗传多样性影响较小,野生半夏物种水平上的多态性比裁培品种高出2个百分点,钟祥野生半夏多态位点数最高,遗传信息最丰富,质量最优。 Bel-7402细胞和HT-29细胞的MTT和流式细胞测定凋亡结果提示,半夏、掌叶半夏的有机酸部位和乙酸乙酯部位有较好的体外抗肿瘤细胞增殖和诱导肿
参考文献：
[1]. 药物-蛋白结合作用的HPCE和HPLC法研究[D]. 周大炜. 沈阳药科大学. 2003
[2]. HPCE法对体内及制剂中四种降糖药物的分析测定[D]. 潘婷婷. 河北大学. 2017
[3]. 款冬花化学成分分离分析和质量控制指标研究[D]. 曹坤. 重庆大学. 2016
[4]. 黔产杜仲指纹图谱及有效成分含量测定的研究[D]. 黄平. 贵阳中医学院. 2008
[5]. 中药丹参和蒲黄的药代动力学研究[D]. 杨燕. 西北大学. 2008
[6]. 蛹虫草的人工培养及其核苷类化合物的研究[D]. 汪宇. 沈阳药科大学. 2002
[7]. 阿胶低肽及其制剂的研究[D]. 付英杰. 山东中医药大学. 2010
[8]. 中药复方血糖宁有效部位的研究[D]. 魏英勤. 山东中医药大学. 2003
[9]. 苦参碱对人白血病K562细胞表观遗传因素影响的机制研究[D]. 郑海涛. 汕头大学. 2008
[10]. 半夏的品质及抗肿瘤活性研究[D]. 黄必胜. 湖北中医学院. 2005
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