王复标[1]2016年在《水稻早衰突变体(psf)叶片衰老形成与衰老速率调控的生理机制研究》文中认为叶片是水稻光合作用的主要器官,水稻生育后期功能叶提早衰老,会导致源器官向库器官的同化产物供应不足,严重影响水稻产量潜力的充分发挥,因此研究延缓水稻功能叶衰老的起始或者推迟叶片衰老的速率,对提高水稻产量和品质都具有重要意义。本研究利用叶片早衰突变体(premature senescence at filling stage,psf)与其野生型对照(浙恢7954)为材料,通过在水稻生育后期旗叶叶片衰老过程中的动态取样,并结合离体叶片的外源诱导(或抑制)衰老处理,对水稻叶片衰老过程的相关代谢生理变化进行了研究分析,并重点探讨了水稻叶片衰老过程与叶片器官中的光系统Ⅱ(PSⅡ)D1蛋白损伤、抗氧化保护酶系统及ABA激素调控代谢之间的生理联系,主要研究结果如下:1、对水稻叶片早衰与产量品质之间关系的研究结果表明,水稻生育后期旗叶早衰不仅会引起水稻结实率和千粒重的显着降低,而且会导致其稻米糙米率、精米率和整精米率的显着降低,尤其是整精米率下降明显。与此同时,水稻叶片早衰突变体psf的垩白粒率和垩白度显着高于其相同种植条件下的野生型对照,且叶片早衰程度越严重,稻米垩白米粒和垩白度的增幅越大。此外,水稻生育后期叶片早衰突变对稻米蒸煮食味品质也有一定影响。与野生对照相比,早衰突变体psf的直链淀粉含量有所降低,但稻米淀粉的糊化热焓(ΔH)明显上升,而DSC糊化温度则因播期变化而异,规律性不明显。水稻后期旗叶衰老对稻米营养品质的影响表现为,叶片早衰会导致稻米中的总蛋白、植酸和Zn含量的提升,但Zn的生物有效性明显降低。2、早衰突变体psf的叶片早衰症状及其衰老进程受光照因素的诱导,且与叶片中的内源ABA含量之间存在密切关系。与野生型相比,早衰突变体衰老叶片中ABA含量显着高于其野生型对照。遮光处理可以明显的减轻甚至抑制早衰突变体叶片早衰症状的发生,与此同时,遮光部位叶片的内源ABA含量也显着降低;对ABA诱导的叶片衰老与叶片光合生理功能之间的关系研究结果,ABA参与的叶片衰老速率变化与PSⅡ反应中心的光损伤和D1蛋白周转密切相关,随着叶片ABA含量的上升,调控D1蛋白生物合成基因以及PSⅡ光反应中心蛋白损伤修复关键基因(psbA、psbB、psbC和OsFtsH2)显着下调表达,从而导致衰老叶片中的D1蛋白合成减少进而影响PSII的损伤修复过程。其中,ABA对D1蛋白重新合成和光损伤D1蛋白修复的抑制是ABA调控叶片衰老的两个关键步骤。在ABA介导的叶片衰老过程中,OsFtsH2基因是调控D1蛋白周转和PSII损伤修复过程中最重要的基因之一,其主要负责对PSII损伤修复过程中光损伤D1蛋白的降解。3、对早衰突变体叶片衰老过程中的活性氧(ROS)产生与抗氧化保护酶活性的测定结果,早衰突变体psf叶片中的叶绿素含量和叶绿素a/b值要低于其野生型对照,但前者的ROS水平则显着高于后者,且在早衰突变体psf的叶片衰老过程,超氧阴离子(O2·-)和过氧化氢(H202)的显着提升时间比其叶绿素含量及叶绿素a/b显着下降时间要相对更早,表明ROS爆发是引起psf叶片衰老起始和加速的重要原因;对早衰突变体psf与野生型对照叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)活性的比较结果显示,早衰突变体psf叶片的SOD、CAT和APX活性低于其野生对照,但POD活性却表现出相反的变化趋势,早衰突变体psf叶片高于野生对照,且随着叶片衰老进程的加剧而上升,与叶片衰老过程中的O2·-产生速率呈显着正相关,表明在叶片衰老过程中POD可能主要是起氧化损伤作用,而不是起抗氧化保护酶的功能;在各种SOD的同工酶中,Mn-SOD对O2·-产生速率的上升表现的最为敏感,而Cu/Zn-SOD同工型在叶片衰老过程中表现相对稳定,揭示早衰突变体叶片衰老过程中的SOD活性降低可能主要源于Mn-SOD同工型的降低,从而使SOD抗氧化保护酶系统崩溃并最终导致叶片的加速衰老,而不同Cu/Zn-SOD同工型则是对不间亚细胞器中O2·-的清除发挥作用。4、早衰突变体psf的衰老症状显现及衰老进程与其叶片中的糖类物质含量也存在密切联系,早衰突变体psf旗叶中的可溶性糖、蔗糖和己糖(果糖+葡萄糖)含量均显着低于其野生型对照,且在叶片衰老过程中均呈大幅的下降趋势。这表明早衰突变体psf叶片的衰老与糖饥饿有关。离体叶片的糖饥饿处理试验结果表明,糖饥饿会诱发叶片衰老和加速叶片衰老的进程,且糖饥饿诱导的叶片衰老变化与叶片中的ABA含量有关,糖饥饿会引起叶片中ABA含量的显着上升,而外源糖供应处理离体叶片在显着延缓叶片衰老进程的同时,也抑制了叶片ABA含量的上升。对糖饥饿和外源蔗糖供应处理下ABA合成与分解代谢若干关键调控基因的转录表达检测结果,糖饥饿可引起ABA合成代谢关键基因(NCED1、NCED4和NCED5)下调表达,同时也抑制了对ABA分解起关键调控作用的相关基因(ABA8ox2和ABA8ox3)的转录表达,但这种抑制可以通过外源糖供应得到逆转,外源蔗糖处理不仅可以显着诱导NCED1、NCED4和NCED5的上调表达,而且也可以诱导对ABA分解起关键调控作用的ABA8ox2和ABA8ox3的上调表达。由于NCED1和ABA8ox3分别是调控ABA合成与分解代谢的两个重要功能基因,且在水稻叶片中呈特异性高表达,因此,糖饥饿诱导的叶片衰老过程中ABA含量的上升,可能主要是源于ABA分解代谢的下降,而非其合成代谢受糖饥饿诱导提高所导致。5、生长素在植物组织和器官的形成分化及植物与环境间的信号交流中起着重要的调控作用,但对生长素在叶片衰老中所起的调控作用,迄今尚存在一定争议。本文研究结果掲示,IAA的自由态和络合态转化对水稻叶片衰老进程有显着影响。在叶片衰老过程中,早衰突变体psf中的自由型IAA含量显着低于其野生型对照,且随着叶片衰老的加剧,两者间的差异幅度越大。与之相反,早衰突变体psf衰老旗叶中的络合型(态)IAA(IAA-ASP)却显着高于其野生型对照,且随其叶片衰老程度的加剧呈较明显上升趋势。进一步对水稻叶片衰老过程中IAA信号响应、IAA合成和IAA络合代谢途径几个关键基因转录表达量的检测结果表明,调控IAA共轭作用的关键基因GH3s在早衰突变体psf叶片衰老前期呈下调表达,但随叶片衰老程度的加剧呈上调表达。外源NAA处理试验证实,IAA信号可通过调控转录调控因子NACs的显着上调或下调表达,从而实现其对叶片衰老的调控。
骆叶[2]2007年在《小檗碱抑制肿瘤细胞Cyclin D1相关信号通路的研究》文中指出目前,肿瘤的发病率和死亡率在中国乃至世界仍居高不下,它不仅给患者本人及其家庭带来巨大的痛苦,同时也对整个社会的发展与进步造成极大的威胁。因此,寻求安全、有效、低毒的抗肿瘤药物一直受到国内外医药界专家学者的重视,而从天然化合物中开发此类药物也成为研究热点。所有癌细胞的一个特异性表型异常是细胞周期调控失调,细胞周期的调控与多种细胞内信号通路有关,阻断细胞内信号通路从而抑制细胞周期正调控相关蛋白表达是抑制肿瘤细胞异常增殖的关键。本研究在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制,为阐明小檗碱阻滞肿瘤细胞周期进展、抑制肿瘤细胞增殖的作用机理提供实验依据,并为小檗碱抗肿瘤的临床应用提供理论依据。第一部分:研究小檗碱对人高转移性肺癌PG细胞周期进展和Cyclin D1表达的影响。1.培养人高转移性肺癌PG细胞,采用MTT法检测小檗碱对PG细胞增殖的作用。与对照组相比,经不同浓度(10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml)的小檗碱处理24小时和48小时,PG细胞生长明显受到抑制。2.流式细胞仪检测小檗碱对PG细胞周期进展的影响,结果表明,小檗碱可使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少,与对照组相比有显着差异(P <0.01);小檗碱高低剂量组间有明显差异(P <0.05)。3.RT-PCR结果显示,经不同浓度小檗碱处理后24小时,PG细胞Cyclin D1的mRNA水平较对照组明显降低。小檗碱对PG细胞Cyclin D1的表达有抑制作用。第二部分:研究小檗碱对PG细胞Cyclin D1相关信号通路的作用。在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制。1.双荧光素酶报告基因结果显示,小檗碱对PG细胞AP-1, Wnt信号通路活性有明显抑制作用,而对NF-κB信号通路影响不明显。进一步实验表明,经PDB+Ionomysin处理的PG细胞AP-1信号通路被激活,小檗碱能有效抑制这种激活,其作用呈剂量依赖性。2. Western Blot检测表明,经不同浓度小檗碱处理后,PG细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun蛋白含量明显降低,降低的水平与小檗碱浓度相关。3. EMSA结果显示,不同浓度的小檗碱均能抑制PG细胞核提取物与带有野生型AP-1位点的寡核苷酸结合;经小檗碱处理后PG细胞核提取物与Cyclin D1上游启动子区带有AP-1位点的寡核苷酸结合减少。实验结果提示:1.小檗碱通过抑制周期进展关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,从而抑制PG细胞增殖。2.小檗碱对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对NF-κB通路活性影响不明显。小檗碱对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显着的抑制作用。3.小檗碱能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达。这是小檗碱抑制Cyclin D1表达、进而阻滞肿瘤细胞周期的机制之一。
却天石[3]2016年在《ZEB2通过miR-637靶向Akt1及HMGA1促进胶质瘤细胞生长、侵袭及迁移的分子机制》文中认为研究背景与目的胶质瘤是中枢神经系统的第一大肿瘤,多年以来的治疗手段都是以扩大切除加合理的放化疗为主。虽然近年来治疗手段不断进步,但是疗效的改善仍旧十分有限。文献报道术后应用替莫唑胺联合放疗的方法,与单独放疗相比患者的中位生存期仅从12.1个月提高到14.6个月,两年生存率从10.4%提高到26.5%。而近几年出现的新型靶向治疗药物,如靶向血管内皮生长因子(VEGF)药物贝伐单抗、抗整合素抑制剂Cilengitide等,对患者的总体预后也无改善。胶质瘤的难治性很重要的一个原因是其恶性程度高,呈现出浸润性生长并与周围脑组织分界不清。肿瘤的高度恶性表现为胶质瘤生长快,浸润性生长主要是胶质瘤细胞具有高侵袭性,能向周边脑组织浸润,从导致手术不能完全切除进而复发。因此,研究胶质瘤的高增殖、高侵袭性是一个重要的方向。E盒结合锌指蛋白2 (Zinc finger E-box Binding homeobox 2,简称ZEB2,又名Smad-Interacting Protein 1,即SIP1)属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白家族的成员,包含两个可以与5'-CACCT序列结合的锌指结构簇。故而ZEB2可以通过与5'-CACCT序列结合,从而作为转录因子与下游靶基因的启动子作用,发挥转录抑制功能。许多研究表明ZEB2在肿瘤的发生发展过程中发挥了核心的作用,ZEB2不但可以通过调控Cyclin D1、Rb等基因从而加速肿瘤细胞的增殖,同时也能影响上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)相关蛋白进而增强肿瘤的侵袭和转移能力。但是,ZEB2在胶质瘤中的报道较少,并且在肿瘤中对于ZEB2所参与的信号通路和详细分子机制的研究也较少。2010年Xia等的研究发现,ZEB2在胶质瘤细胞中表达上调,抑制其表达后可以显着抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,上调的ZEB2可以抑制E-Cadherin表达以及促进Fibronectin和Vimentin的表达。而宋烨等在Xia的结果基础上,采用荧光定量PCR、Western blot和免疫组化的方法证明了ZEB2在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织明显上调,且与胶质瘤的恶性程度呈正相关。随后,他们通过瞬时沉默ZEB2在胶质瘤细胞株U25 1、U87的表达而后进行了细胞功能实验。结果表明,干扰胶质瘤细胞中的ZEB2表达后,细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力显着下降,细胞周期G1期向S期转化障碍,以及早期凋亡及晚期凋亡的比例明显增多。进一步的Western blot结果也证实了上述结论。微小INA (microRNA,简称miRNA)是一类内源性非编码RNA,其生物学的主要作用是调控基因转录,而且以负性调控为主。近年来,许多研究发现微小分子非编码RNA(miRNAs)的表达改变与多种癌症的发生和发展密切相关,其中包括胶质瘤。许多miRNA通过靶向调控下游关键分子抑制其转录,从而对肿瘤的增殖、侵袭、迁移以及放化疗抵抗发挥抑制作用。越来越多地实验结果表明,miRNA作为癌症的候选标记物和治疗靶点具有潜在的价值。许多文献报道了ZEB2与部分miRNAs的作用密切相关。同时,ZEB2作为转录因子可以通过结合miRNAs上游启动子区域从而促进或抑制其转录。基于此,我们对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测。在检测到的80多个差异表达miRNAs中,我们采用荧光定量PCR对其中表达差异最明显且上调的miR-637进行了验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调。同时,通过NCBI数据库获取miR-637上游启动子区域序列以及将ZEB2结合的启动子5'-CACCT区域与miR-637上游的启动子区域进行比对,我们推测ZEB2作为转录因子可能通过直接结合miR-637的启动子区域进而抑制其转录表达。本文的主要内容是着重探讨了ZEB2在胶质瘤中是否能够通过靶向调控miR-637进而介导了细胞的增殖、侵袭和迁移,而miR-637又是如何进一步对胶质瘤细胞的功能进行调节,以及调控的具体分子机制。这为我们理解胶质瘤的快速增殖和高度侵袭提供了一定的理论基础,也为寻找胶质瘤潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。研究内容与方法1.ZEB2在胶质瘤细胞中功能和机制的进一步研究(1)设计并构建4个稳定干扰ZEB2慢病毒载体并进行细胞转染,运用荧光定量PCR和Western blot检测转染效率,选取干扰效率最高的片段进行后续实验；(2)运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,运用平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力；(3)运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测稳定干扰ZEB2可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)采用裸鼠皮下成瘤实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞的增殖；(5) Western Blot检测干扰ZEB2后细胞中增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移(1)采用miRNAs芯片检测干扰ZEB2表达的U251细胞中表达变化的miRNA,并用荧光定量PCR验证和寻找最有意义的miRNA进行后续研究；生物信息学分析ZEB2可以结合miR-637的启动子区域序列：(2)双荧光素酶报告基因检测ZEB2与miR-637启动子的结合并能抑制其转录；凝胶电泳迁移率实验检测体外条件下ZEB2是否能直接结合miR-637启动子区域；利用染色质免疫共沉淀技术在体内条件下进一步验证ZEB2与miR-637启动子区域的结合；(3)设计并构建miR-637稳定过表达慢病毒载体并用荧光定量PCR进行验证；(4)MTT实验、Edu实验、平板克隆实验和裸鼠皮下成瘤检测miR-637对胶质瘤细胞的增殖能力影响；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力的影响；(5)MTT实验、Edu实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的增殖；划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；3.MiR-637直接靶向调节Akt1及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能(1)生物信息学预测Akt1和HMGA1可能为miR-637的直接靶基因,并采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达miR-637可以下调Akt1和HMGA1的表达；(2)双荧光素酶报告基因验证miR-637可以靶向结合Akt1和HMGA1的3’-UTR区域进而抑制它们的表达；(3)Edu实验检测miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)Edu实验检测HMGA1促进胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证HMGA1促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(5)Edu实验检测miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；4.MiR-637靶向Akt1和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制(1) Western blot检测过表达miR-637后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(2) Western blot检测瞬时干扰Akt1后以及在过表达miR-637细胞中过表达Akt1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(3) Western blot检测干扰HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(4) Western blot检测在过表达miR-637细胞中过表达HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析(1)荧光定量PCR检测45例胶质瘤样本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Aktl和HMGA1的mRNA表达水平；(2) Western blot检测7例胶质瘤组织和7例相对应的瘤旁正常脑组织中ZEB2、和HMGA1的蛋白表达水平；(3)免疫组化检钡ZEB2、Aktl和HMGA1在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的蛋白表达水平和表达定位：并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(4)原位杂交检测miR-637在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达水平和表达定位；并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(5)统计分析在胶质瘤临床样本中ZEB2与miR-637、miR-637与Akt1以及miR-637与HMGA1之间的表达相关性。结果1.ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移对4个ZEB2的干扰慢病毒载体进行筛选,结果显示U251中shZEB2的A片段干扰效率最高(19.4%),U87中C片段干扰效率最高(25.0%),故后续实验U251细胞采用A片段、U87采用C片段进行。随后运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验和裸鼠皮下成瘤实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力。MTT实验结果显示,与对照Mock组相比,shZEB2细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验显示干扰ZEB2表达后处于S期的细胞百分比显着降低(P均为0.001)；裸鼠皮下成瘤实验结果表明干扰U87细胞中ZEB2的表达后肿瘤体积和重量较对照组明显减小(P<0.001)；平板克隆实验结果表明干扰ZEB2表达后形成克隆数目明显减少(P均为0.001)。即ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖和克隆形成能力。进一步运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测ZEB2对胶质瘤细胞的侵袭和迁移的作用。划痕实验结果表明,shZEB2细胞组的划痕间隙随时间延长而减小(P<0.001)：Transwell和Boyden实验结果显示,与对照组相比,U251和U87干扰组的穿膜细胞数显着减少(P=0.001和0.003,P=0.002和0.001)。即ZEB2可以促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。采用Western blot检测了下调胶质瘤细胞U251和U87中的ZEB2蛋白表达后,与细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的变化情况。结果显示,干扰U251和U87中ZEB2的表达后,PI3K/Akt通路中的p-PI3K、Akt、p-Akt发生下调,与增殖相关的CCND1下调而p21上调,与侵袭和迁移相关的Vimenti、p-catenin、N-Cadherin下调。而其它蛋白女HMGA1、E2F1、PTEN、Bcl-2、NF-kappaB、Sox2等均有不同程度的上调和下调。2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测一共发现到了80多个差异表达miRNAs,其中上调的niRNAs有40多个,下调基因miRNAs有30多个。在差异表达miRNAs中,选取其中表达差异最明显且上调的miR-637并采用荧光定量PCR验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调(P=0.02和P=0.005)。随后的双荧光素酶报告基因结果表明,干扰ZEB2可以减少其与miR-637启动子的结合(P=0.002),上调ZEB2可以加强其与miR-637启动子的结合(P=0.004)。凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)结果显示过表达ZEB2促进其与miR-637启动子的结合。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)结果表明ZEB2作为转录因子可以直接结合miR-637启动子区域的0-300bp位点。构建稳定过表达miR-637慢病毒载体并转染细胞,荧光定量PCR验证表明miR-637在细胞中被稳定过表达超过400倍和350倍(P均小于0.001)。随后进行细胞功能实验。MTT结果显示较对照组相比,过表达miR-637的细胞存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验结果表明过表达miR-637后U251和U87细胞较对照组的S期细胞明显减少(P<0.05)；平板克隆形成实验表明在胶质瘤细胞U251和U87中上调miR-637的表达可以显着抑制细胞克隆形成的能力(P<0.05)；皮下成瘤实验表明过表达组肿瘤的体积和重量较对照组明显较小(1.36±0.32g vs.2.06+0.45g,P<0.05),且Ki-67表达阳性率明显较对照组高(P=0.002); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验结果均表明,过表达miR-637后抑制U251和U87的穿膜,而在过表达miR-637的细胞中加入miR-637抑制剂后穿膜细胞数显着回升(P均小于0.05)。以上结果说明miR-637在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移。进一步在稳定过表达ZEB2 (ZEB2 OE)的细胞中瞬时转染miR-637 mimics后采用MTT、Edu、Transwell、Boyden和划痕实验来检测细胞功能的变化。MTT的实验结果显示与对照ZEB2 OE组相比,ZEB2 OE+miR-637 OE细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；而Edu实验表明在ZEB2过表达的细胞中上调miR-637后,U251和U87处于S期细胞明显减少(P<0.05)；Transwell小室体外迁移实验和Boyden小室体外侵袭实验的结果说明在过表达ZEB2的U251和U87中过表达miR-637后,U251和U87的穿膜细胞数明显减少(P均小于0.05)。即说明miR-637对ZEB2促细胞增殖、侵袭和迁移的能力有拮抗作用3.MiR-637直接靶向调节Aktl及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能在3个miRNA靶基因预测网站上对miR-637可能的靶基因进行了预测,同时结合miR-637的Western blot结果,选取了Akt1和HMGA1这两个可能的靶基因。荧光定量PCR和Western blot结果表明,在胶质瘤细胞U251和U87中过表达miR-637促进Akt 1和HMGA1的表达下调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在存在靶基因3’-UTR区域的组中加入miR-637 mimics可以抑制载体荧光的表达,而加入inhibitors促进荧光强度上升。同时,突变靶基因的3’-UTR区域使得荧光强度不发生改变。即miR-637可以特异性结合靶基因Akt1和HMGA1的3’-UTR区域,通过抑制mRNA的表达从而对它们负性调控。随后采用Edu实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637可以通过影响Akt1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验表明过表达miR-637和瞬时干扰Akt1所产生的作用相同,均使得S期细胞较少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少(P<0.05)。而Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验显示,过表达miR-637和瞬时干扰Aktl所产生的作用相同,均使得穿膜细胞数减少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的穿膜细胞数减少。以上结果表明,miR-637可以通过结合Akt1的3’-UTR区域抑制其表达,进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。采用细胞功能实验对HMGA1在胶质瘤中的功能进行了鉴定。Edu实验表明,干扰细胞HMGA1的表达后S期细胞数百分比显着降低(P< 0.001); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验表明,沉默U251细胞的HMGA1表达可以使穿膜细胞数显着降低(P=0.004和0.007,P=0.004和P=0.011)。之后细胞功能实验验证miR-637可以通过影响HMGA1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验、均表明,在过表达miR-637的U251中加入过表达HMGA1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少,4.MiR-637靶向Aktl和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制首先对过表达miR-637的细胞采用Western blot检测下游增殖相关蛋白、EMT相关蛋白等指标。结果表明,对miR-637进行过表达后细胞中PI3K/Akt信号通路的关键蛋白Akt1、磷酸化Akt (p-Akt)和磷酸化PI3K (p-PI3K)显着下调,Wnt通路的关键蛋白P-catenin也显着下调。同时,Foxol上调,而磷酸化Foxol (p-Foxol)下调。而且,与EMT相关的N-Cadherin无变化,及细胞周期相关的Cyclin D1、Cyclin E1、p15下调,而p27/Kip、p21上调。此外,hTERT上调,NF-kappaB下调。随后在稳定过表达miR-637的U251和U87细胞中加入过表达Akt1的质粒载体以及相应的对照空白质粒,与NC细胞、Lv-miR-637细胞、瞬时干扰Akt1细胞(siAkt1)共同进行Western blot检测。结果发现,瞬时干扰Akt1的表达,使得p-Akt1、β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达显着下调,而Foxol的表达上调。并且,在稳定过表达miR-637的细胞中过表达Akt1,可以使p-Akt1、 β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达明显回复,Foxol的表达明显下降。其次,运用Western blot对瞬时干扰HMGA1的细胞进行了EMT、细胞周期相关蛋白及信号通路的检测。干扰HMGA1的表达后,HMGA1蛋白水平下降明显,Akt和p-Akt以及p-P13K蛋白有下调。同时,间充质标志物N-Cadherin、β-catenin、 Vimentin显着下调。而细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1下调,但p15、p16、 CDK6上调。此外,c-Myc和NF-kappaB基因也显着下调。随后在稳定过表达miR-637的细胞中加入过表达HMGA1的质粒载体,与LEV细胞、Lv-miR-637细胞共同进行Western blot检测。结果可知,在过表达miR-637的细胞中回复HMGA1的表达可以使得Cyclin D1、β-catenin、NF-kappaB和Vimentin的表达回升,而p15表达水平则下降。5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析荧光定量PCR检测45例新鲜胶质瘤组织标本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的mRNA表达水平。结果显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织样本中ZEB2、Akt1、HMGA1的mRNA表达水平均上调(P<0.001)而miR-637表达水平显着下调(P<0.001)。而Western blot检测了7例胶质瘤组织和与其相对应的7例肿瘤旁正常脑组织中ZEB2和HMGA1的蛋白表达,结果显示,较对应的瘤旁正常脑组织相比,胶质瘤组织中ZEB2和HMGA1的蛋白水平均明显较高。随后,运用免疫组化和原位杂交检测ZEB2、iR-637、Akt1和HMGA1在70例胶质瘤石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达定位和表达水平。结果显示,在正常脑组织中,ZEB2的表达主要位于细胞核,少部分见于胞浆；Akt1在细胞核和细胞浆均有表达；HMGA1主要位于细胞核中,细胞浆有表达但相对较少。同时,叁者在胶质瘤组织中均为细胞核和细胞浆同时表达,且表达量明显较正常脑组织高。而miR-637在正常脑组织中主要表达于细胞浆中,核内罕见,在胶质瘤组织中表达于细胞浆和细胞核,且胶质瘤组织中miR-637的表达显着下调。此外,统计分析发现性别、年龄(≤≥50和<50)、组织类型与ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的表达均无明显关系,而与WHO分级存在显着相关性(ZEB2、Akt1、HMGA1为正相关,miR-637为负相关)。最后对ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1之间表达相关性进行了分析。结果表明,ZEB2和miR-637之间存在负相关关系(r=-0.358,P=0.002), miR-637与Aktl之间存在负相关关系(r=-0.345, P=0.003), miR-637与HMGA1之间存在负相关关系(r=-0.399,P=0.001)。结论ZEB2作为转录因子可以与miR-637上游启动子区域的位点结合并抑制其转录,进而减少miR-637与Akt1和HMGA1的3’-UTR区域靶向结合,从而分别通过上调CyclinD1和p-Foxo1并下调Foxo1.以及上调Cyclin D1并抑制p15来促进细胞周期的进展。同时,又分别通过上调p-Akt1、β-catenin以及上调β-catenin、 NF-kappaB和Vimentin的表达来促进细胞的侵袭和迁移。最后,ZEB2、Akt1和HMGA1在胶质瘤临床样本中高表达,且与WHO分级呈正相关；而miR-637在胶质瘤临床样本中低表达且与WHO分级呈负相关。同时,ZEB2与miR-637的表达以及miR-637与Akt1、HMGA1的表达相互之间
牛生洋[4]2016年在《中国野生刺葡萄（Vitis davidii）果皮颜色变异机理研究》文中研究指明果皮颜色是影响葡萄及葡萄酒品质的重要指标之一,也是果实成熟过程中最明显的变化之一。葡萄果实颜色取决于果皮中花色苷的组分及含量,花色苷的合成主要受调节基因和结构基因的控制。前人研究表明,调节基因Vvmyb A1的表达是决定葡萄着色的关键因素,白色葡萄由于Vvmyb A1在启动子区域被插入了逆转座子Gret1而不能表达,无法调控花色苷合成的结构基因UFGT表达,导致花色苷合成受阻。野生葡萄基本都为有色果实,但在野生刺葡萄中出现了白色果实株系,为解释其果实颜色变异的原因,本研究通过对白刺葡萄株系和收集到的40余份黑刺葡萄进行SSR标记,确定了和白刺葡萄遗传亲缘关系最近的黑刺葡萄,并以此为材料,以欧亚种品种‘白比诺’、‘黑比诺’及‘小白玫瑰’、‘小红玫瑰’为对照,对供试葡萄果实生长发育期间的花色苷、酚类、糖、酸等含量变化;Myb A1基因型差异;白刺葡萄与黑刺葡萄发育期间果皮转录组测序等方面做了研究,主要研究结果如下:(1)用筛选的94条SSR引物对42份来自不同地域的刺葡萄资源及4份欧亚种对照品种进行了SSR标记,聚类结果显示,刺葡萄与欧亚种亲缘关系较远,刺葡萄种群内明显分为叁个类群,与其地理分布基本吻合;与白刺葡萄株系遗传距离最近的黑色刺葡萄株系为湖南刺,其遗传相似系数超过0.9;白刺葡萄和湖南刺的形态学表型鉴定及SSR荧光标记毛细管电泳检测结果进一步证明白刺葡萄株系与湖南刺株系亲缘关系最近。(2)依据生长曲线选择了白刺葡萄和湖南刺以及对照葡萄品种5个典型的生长发育时期,通过HPLC-ESI-MS/MS、HPLC等技术对其果皮、果肉及种子等不同部位的花色苷含量、非花色苷酚类含量、糖积累变化、有机酸变化等指标进行了检测,并分析了其抗氧化能力变化,结果表明花色苷主要存在于果皮和种子中,而且在葡萄果实发育早期即可检测到,但果肉中检测不到花色苷;花色苷组分检测结果表明,果皮中含量最高的花色苷组分为锦葵色素葡萄糖苷(Mv G)和飞燕草素葡萄苷(Dp G),主成分分析也表明二者在决定果皮颜色时的贡献率最高,但Mv G在不同果皮颜色的葡萄中存在显着差异,而Dp G差异不显着;酚类物质、糖积累水平、有机酸含量及抗氧化能力分析结果显示,同种(品种)葡萄在不同果实颜色之间差异不明显,但不同品种之间差异较大,说明白刺葡萄果皮颜色变异与果皮中Mv G含量较低有关。(3)对刺葡萄及杂交后代的Myb A1基因型分析,结果表明白刺葡萄株系只有Myb A1a基因型,而湖南刺为Myb A1a及Myb A1c两种基因型,证明刺葡萄果实颜色变异的分子机制为Gret1的插入导致Myb A1基因不表达,最终无法合成花色苷所致。(4)以白刺葡萄及湖南刺为材料,通过转录组测序分析了两者在生长发育过程中果皮基因表达差异。结果表明两者之间虽然有差异基因,但差异基因在GO富集不显着,在KEGG富集主要集中在半胱氨酸代谢、细胞凋亡、氧化磷酸化等途径,与色素合成及转运并无直接联系,说明其颜色差异只是个别基因差异造成的,同时也证明了白刺葡萄和湖南刺遗传背景高度一致。花色苷生物合成相关结构基因及调节基因q-RT-PCR验证发现,不同颜色的葡萄只有果皮中的调节基因Myb A1及结构基因UFGT、CHS、F3'H、F3'5'H、GST及OMT表达有差异,种子和果肉并无明显差异;生长发育期花色苷含量变化与相关基因表达量变化的相关性分析表明,只有果皮中的Mv G与结构基因及调节基因均成正相关。
崔海鹏, 董建一, 李慧玲, 姚亮, 王福金[5]2014年在《Ras/MAPK/ERK通过协同NF-κB促进肝癌细胞中cyclinD1的表达》文中研究说明目的探讨Ras癌基因在体内诱导肝肿瘤发生过程中促进cyclin D1表达的分子机制。方法利用H-ras12V转基因雄鼠肝肿瘤组织、肿瘤周围组织以及非转基因雄鼠肝组织进行病理分析和总RNA及蛋白质的提取。应用qRT-PCR和Western blot方法检测cyclin D1的表达以及调控cyclin D1表达的相关信号通路激活状态。采用miRNA测序、生物信息学分析和qRT-PCR验证方法检测miR-5102基因的表达水平。结果与非转基因雄鼠肝组织和肿瘤周围组织相比,肿瘤组织中cyclin D1基因的mRNA和蛋白表达水平显着升高。与非转基因雄鼠肝组织和肿瘤周围组织相比,在肿瘤组织中MAPK信号转导通路中的ERK信号分子的蛋白表达水平和磷酸化水平都显着升高,在肿瘤组织中成高激活状态,NF-κB信号通路中的抑制因子IκB蛋白水平显着降低。miR-5102的表达水平没有显着变化。结论在Ras癌基因诱导的肝肿瘤发生过程中,主要通过激活MAPK/ERK和NF-κB信号通路促进cyclin D1的表达。
王青青[6]2016年在《生物钟基因Per2对人口腔鳞癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用》文中认为第一部分口腔鳞癌细胞株培养和口腔黏膜上皮细胞的原代培养目的:获得纯化的口腔黏膜上皮细胞,并对口腔黏膜上皮细胞是否纯化进行检测。方法:收集重庆医科大学附属口腔医院颌面外科对颌面整形患者手术中切除的口腔正常粘膜,于1.0u/ml dispaseⅡ中4℃消化过夜。显微镜下分离粘膜组织的上皮层,0.25%胰酶消化,用口腔角质细胞培养基OKM接种于鼠尾胶包被六孔板中。置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。4 d传一代,选取第2代细胞提取m RNA、蛋白,第3代细胞制作细胞爬片。取口腔粘膜上皮细胞细胞爬片进行角蛋白染色,一抗角蛋白抗体4℃过夜。二抗工作液常温孵1 h?显微镜下分别用×40,×100,×200观察,拍照?结果:口腔粘膜上皮细胞呈铺路石样,角蛋白染色结果表明阳性率100%,证实为纯化的上皮细胞.结论:无血清筛选和上皮分离结合的方法可以获得纯化的口腔黏膜上皮细胞。第二部分生物钟基因Per2在不同口腔鳞癌细胞株及正常口腔黏膜上皮细胞中的表达目的:检测Per2在不同口腔鳞癌细胞株及正常口腔黏膜上皮细胞中的表达,为进一步实验提供依据。方法:采用QPCR和WB来检测Per2在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中m RNA和蛋白的表达。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P<0.05认为有统计学意义.结果:Per2在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中m RNA和蛋白的表达:在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中Per2 m RNA的表达分别为2.41±0.21,1.00±0.12和0.9±0.17;Per2蛋白表达的灰度值比值分别为:2.87±0.26,1.11±0.13和0.98±0.32。结论:Tca8113和SCC15细胞中Per2 m RNA和蛋白表达量均显着低于上皮细胞(P<0.05),表明在OSCC中Per2低表达.第叁部分Per2干扰质粒的构建和验证目的:通过sh RNA的方法干扰Per2,并检测干扰后的Per2 m RNA和蛋白的表达,建立Per2干扰的细胞模型,为进一步的研究做准备。方法:Per2真核干扰质粒(p GPU6-Per2-sh RNA-I~III)和空载质粒(p GPU6-Control-sh RNA)购买自成都冷泉水生物技术有限公司.细胞转染采用Lipo2000(Invitrogen,USA)和OPI-MEM(Gibco,USA)介导,细胞转染后24-48 h提取RNA,48 h后提取蛋白。将实验分为5组:Per2-sh RNA-I、Per2-sh RNA-II和Per2-sh RNA-III组分别为转染p GPU6-Per2-sh RNA-I,p GPU6-Per2-sh RNA-II和p GPU6-Per2-sh RNA-III质粒的Tca8113细胞。Control-sh RNA组(对照组)为转染空载质粒的Tca8113细胞。Tca8113组(空白对照组)为未做任何处理的Tca8113细胞。采用QPCR和WB来检测Per2在各组中m RNA和蛋白的表达。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P<0.05认为有统计学意义.m RNA的表达分别为1.67±0.30、1.45±0.34、1.00±0.13、3.01±0.11和3.20±0.52。Per2蛋白表达的灰度值比值分别为1.52±0.11、1.22±0.15、0.87±0.21、3.18±0.52和3.21±0.42。Per2的m RNA和蛋白表达量在Tca8113和Control-sh RNA组中无明显差别(P>0.05),Per2-sh RNA-Ⅲ组显着低于Tca8113和Control-sh RNA组(P<0.05)。结论:Per2-sh RNA-Ⅲ组的Per2沉默效果最好,用于后续实验作为实验组。结果:Per2-sh RNA-Ⅰ~Ⅲ、Control-sh RNA和Tca8113组细胞中Per2第四部分Per2干扰后细胞的细胞周期分布.增殖和凋亡的变化及对细胞周期Cyclins-CDKs-CKIs网络的调控作用目的:本研究通过对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞内的Per2基因干扰,检测Per2干扰后细胞周期,增殖,凋亡的改变,并全面检测Cyclins-CDKsCKIs网络系统中各重要分子的改变情况,以进一步阐明Per2与癌症发生发展的关系.方法:将Per2真核干扰质粒转染入Tca8113细胞中,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化,QPCR检测Cyclin A2,Cyclin B1,C-myc,Cyclin D1,Cyclin E,P53,CDK1,CDK2,CDK4,CDK6,Rb1,E2F1,Wee1,cdc25,p16和p21的m RNA表达量的变化。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P<0.05认为有统计学意义.结果:与Tca8113和Control-sh RNA组相比,Per2-sh RNA-Ⅲ组中G1/G0期的细胞数显着降低(P<0.05),细胞增殖指数显着增高(P<0.05),而凋亡指数显着降低(P<0.05),Tca8113和Control-sh RNA组细胞的G1/G0期细胞数,增殖指数和凋亡指数无差异(P>0.05)。与Tca8113和Control-sh RNA组相比,Per2-sh RNA-Ⅲ组中p53,p16和p21 m RNA的表达水平显着降低(P<0.05),而Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6和E2F1 m RNA的表达水平显着增高(P<0.05),C-myc,Cyclin E,CDK1,CDK2,cdc25,Wee1和Rb1 m RNA的表达水平均无差异(P>0.05)?结论:Per2干扰后,Tca8113癌细胞中Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6,E2F1 m RNA的表达水平显着增高,而p53,p16,p21 m RNA的表达水平显着降低。细胞增殖水平显着增高,凋亡水平显着下降,细胞周期进程发生改变。本研究从转录水平证明了生物钟基因Per2对Cyclins-CDKs-CKIs细胞周期分子网络中的3方面及细胞周期G1/S检查点均有重要的调控作用,Per2是重要的抑癌基因。在此研究基础上,从蛋白质水平和蛋白翻译后修饰水平对Per2的深入研究有可能进一步明确昼夜节律与细胞周期两大周期活动之间的相互作用以及与癌变发生的关系,为癌症的治疗提供新的有效分子靶点。
邓敏, 解瑞飞, 王惠[7]2016年在《FGFR-1、cyclinD1在乳腺癌中的表达及其临床意义》文中指出目的探讨成纤维生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR-1)及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用原位杂交及免疫组织化学S-P法检测乳腺癌、乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织中FGFR-1、cyclinD1 mRNA及蛋白水平的表达。结果在乳腺癌中,FGFR-1蛋白和FGFR-1基因的阳性率分别为70.0%(21/30)、70.0%(21/30),cyclinD1蛋白和cyclinD1基因的阳性率分别为66.7%(20/30)、76.7%(23/30),明显高于纤维腺瘤与正常乳腺组织(P<0.05),FGFR-1表达与cyclinD1表达一致。结论 FGFR-1的过表达在人类乳腺癌的发生、发展中起重要作用,其机制可能通过上调cyclinD1的表达发挥作用,FGFR-1、cyclinD1的过度表达可作为判断乳腺癌预后的重要指标。
王彦玲[8]2017年在《E2F1/TopoⅡβ信号途径在SH-SY5Y细胞神经元分化中的作用》文中研究指明在哺乳动物个体发育中,神经系统的发育是一个非常复杂的过程。其中,神经元分化对于神经系统的形成是非常重要的。神经元分化过程中,信号分子与细胞增殖、细胞周期、细胞分化紧密协调,调控神经细胞的发育与成熟。探讨神经元分化调控的分子机制对于神经发育、神经再生、神经系统退行性疾病,以及脑肿瘤的发生发展和治疗有重要意义。拓扑异构酶IIβ(Topoisomerase IIβ,Topo IIβ)是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。腺病毒E2转录结合因子-1(E2F1)是一个重要的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化进程中,发挥着重要作用。西洛他唑(cilostazol,CLZ)是抗血小板类药物,对神经元损伤有保护作用,而且最近有研究报道CLZ可干扰E2F1与其靶基因的结合,促进神经元分化,但其确切作用机制尚不明确。因此,本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,通过外源性上调E2F1的表达,检测细胞分化过程中E2F1和Topo IIβ的表达变化,进而探讨神经元分化的分子机制,为临床神经系统疾病的研究与治疗提供一些依据。本研究共分叁部分。第一部分E2F1对维甲酸诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响目的:研究转录因子E2F1转染SH-SY5Y细胞后,观察其对细胞生长状况的影响,以及与维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导神经元分化之间的关系。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO_2环境下培养,待细胞进入对数生长期后进行实验操作。2 E2F1质粒转染:E2F1过表达质粒用Lipofectamine 2000转染SH-SY5Y细胞,倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot观察转染效率。3诱导分化:E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,加入维甲酸(RA)10μmol/L诱导分化3d。4细胞生长状况检测:MTT检测转染前后细胞生长指数,并绘制生长曲线,倒置显微镜观察转染前后细胞分化形态。5细胞周期检测:收集各组细胞,流式细胞术检测G0/G1、S和G2/M期细胞百分比。6各组细胞神经元分化的鉴定:神经元突起生长的检测;MAP2表达的免疫荧光及蛋白印迹检测。7统计学方法:实验结果以x±s表示,单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为有显着性意义。结果:1 SH-SY5Y细胞呈贴壁、簇状生长,胞体小而圆,大多数为不规则形,少数呈梭形,有较短的神经突起。2倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot检测转染效率E2F1过表达质粒带有绿色荧光,Lipofectamine 2000转染E2F1过表达质粒进入SH-SY5Y细胞1d、2d、3d后,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,从而判断转染效率在80%以上。转染后提取E2F1总RNA及总蛋白,采用q RT-PCR以及Western blot技术检测,在E2F1过表达细胞中E2F1的m RNA及蛋白水平都有显着增高,与未转染组和空载体组相比,有显着性差异(P<0.05)。说明过表达E2F1质粒已经成功转染进入SH-SY5Y细胞。3细胞生长状况SH-SY5Y细胞转染E2F1过表达质粒后,MTT结果显示:与对照组(Con)相比,E2F1过表达组(over)细胞生长最快,二者有显着性差异(P<0.05)。转染后加入10μmol/L RA诱导分化,诱导组(Con+RA)与对照组(Con)相比,细胞生长速度明显降低,而E2F1过表达组加入RA后(over+RA),生长速度没有明显降低,与对照组没有显着性差异。4细胞分化形态学变化E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,加入或不加10μmol/L RA诱导分化,3 d后倒置显微镜下观察:RA未处理组中,过表达组(over)细胞形态与对照组(Con)相比,无明显区别;在RA处理组中,与未诱导组相比,RA诱导分化组细胞数目减少,胞体聚集生长,神经突起长度明显增长。对单个细胞平均神经突起长度测量,结果显示:Con+RA组与Con组相比,有显着性差异(P<0.05);而over+RA组的SH-SY5Y细胞突起长度增加不明显。5转染E2F1过表达质粒对细胞周期分布的影响E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,流式结果显示:E2F1过表达组(over)G0/G1期细胞比对照组(Con)减少了7.354%,S期增加了5.071%,与对照组(Con)相比,二者有显着性差异(P<0.05),而空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。转染后RA诱导细胞分化3 d,Con+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞明显增多,比Con组增加了23.597%,S期细胞明显降低,减少了28.410%,表明发生了G0/G1期阻滞(P<0.05);over+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞增加了8.224%,S期减少了9.942%(P<0.05)。提示RA可诱导细胞周期阻滞,过表达E2F1可促进细胞周期进程。6神经元分化的鉴定采用神经元分化标志分子,微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)鉴定神经元分化。免疫荧光染色结果表明,E2F1过表达组(over)与对照组(Con)相比,MAP2的表达较弱;10μmol/L RA处理SH-SY5Y细胞后,MAP2不仅在细胞质中的表达增加,而且在神经元的突起中表达也明显增加,Con+RA组与Con组细胞相比,有明显增加。而over+RA组MAP2表达量较低,与Con组相比,没有明显区别。Western blot检测MAP2表达,显示的结果与免疫荧光结果一致。结论:SH-SY5Y细胞经10μmol/L RA诱导可使细胞脱离细胞周期,并向神经元分化;E2F1过表达可促进SH-SY5Y细胞增殖,降低神经元分化;研究结果表明,细胞内E2F1水平可影响神经元分化,其具体机制尚需进一步研究。第二部分E2F1通过负调控Topo IIβ表达抑制SH-SY5Y细胞向神经元分化目的:检测E2F1和Topo IIβ表达对SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO_2培养箱内培养。2免疫荧光、q RT-PCR以及Western blot检测E2F1过表达质粒转染细胞后对Topo IIβ表达变化的影响。3 q RT-PCR和Western blot技术检测细胞周期相关蛋白p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA及蛋白表达变化的影响。4染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)检测E2F1在Topo IIβ基因启动子区的募集与结合。5统计学方法:同第一部分。结果:1转染E2F1过表达质粒对细胞中Topo IIβ表达变化的影响免疫荧光染色结果显示:Topo IIβ的表达在细胞核中,E2F1过表达组(over)与对照组(Con)相比,Topo IIβ的表达较弱,而空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。10μmol/L RA诱导SH-SY5Y细胞后,Con+RA,over C+RA组与Con组细胞相比,Topo IIβ表达明显增加,而over+RA组Topo IIβ表达量低于Con组。q RT-PCR以及Western blot检测的结果与免疫荧光结果一致。2 q RT-PCR检测p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA表达与对照组细胞相比,E2F1过表达组(over)的p27 m RNA表达量明显降低(P<0.05),而cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达高于对照组(P<0.05)。空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA组与Con组细胞相比,p27 m RNA表达明显增加(P<0.05),而over+RA组表达量低于Con组(P<0.05);对于cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达,Con+RA组低于Con组(P<0.05),而over+RA组高于Con组(P<0.05)。3 Western blot检测p27、cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达与Con相比,over中p27蛋白的表达量明显降低(P<0.05),而cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达高于Con(P<0.05),over C与Con相比没有显着性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA与Con细胞相比,p27蛋白表达明显增加(P<0.05),而over+RA组的表达量低于Con组(P<0.05);对于cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达,Con+RA组低于Con组(P<0.05),而over+RA组高于Con组(P<0.05)。4 E2F1在转录水平负反馈调节Topo IIβ的表达Ch IP检测显示,Topo IIβ基因启动子区有E2F1的结合位点,E2F1过表达组中,结合在Topo IIβ上的E2F1表达水平较对照组明显升高了(P<0.05)。RA诱导后,随着诱导分化时间的延长,特异性结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1逐渐减少,Con+RA组的表达量低于Con组(P<0.05),over+RA组高于Con组(P<0.05)。说明结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1与细胞的分化状态成反比,高表达的E2F1在RA诱导SH-SY5Y细胞分化过程中,通过抑制Topo IIβ的表达,抑制了细胞的分化。结论:RA诱导可降低SH-SY5Y细胞中E2F1的表达,诱导神经元分化,其作用与Topo IIβ的表达上调有关;细胞内E2F1水平增高可促进细胞周期相关蛋白的表达,抑制神经元分化;E2F1可作用于Topo IIβ基因启动子,在神经元分化进程中调控Topo IIβ表达;高表达的E2F1增强了其在Topo IIβ基因启动子区的募集,抑制Topo IIβ的表达,进而抑制神经元分化。第叁部分西洛他唑通过E2F1/Topo IIβ途径诱导神经元分化目的:探讨CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,Topo IIβ的表达变化,以及E2F1/Topo IIβ途径对神经元分化的影响及其机制。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清,100 U/m L青霉素,100μg/m L链霉素的DMEM培养基,置37℃、5%CO_2培养箱内培养。2 MTT检测CLZ对SH-SY5Y细胞的作用浓度。3细胞分化百分率检测:不同浓度的CLZ作用于人SH-SY5Y细胞,分别在0~5 d观察、测量各组细胞突起长度的变化。以单个细胞总突起长度大于100μm作为细胞分化标准,计算细胞分化百分率。4细胞分化形态学观察:30μmol/L CLZ作用于人SH-SY5Y细胞0~3d,观察CLZ处理前后细胞形态学变化,检测分化情况。5神经元分化的鉴定:免疫荧光及Western blot技术检测神经元分化标志蛋白MAP2的表达。6 Topo IIβ的表达:分别用免疫荧光、q RT-PCR技术以及Western blot检测Topo IIβ在CLZ处理前后的表达变化。7 q RT-PCR技术以及Western blot检测p27、E2F1、PCNA在m RNA和蛋白水平的表达变化。8 Ch IP检测E2F1在Topo IIβ以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因启动子区的结合。9统计学方法:同第一部分。结果:1 MTT结果显示:不同浓度的CLZ(10、20、50、100、200、400μmol/L)作用于SH-SY5Y细胞1、2、3、4、5 d后可抑制细胞的增殖,随着CLZ浓度的增加和培养时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增大,与对照组相比,具有统计学意义(P<0.05)。提示CLZ对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。应用半数抑制浓度(IC50)计算软件计算CLZ对SH-SY5Y细胞的IC50:第1~5 d分别为:167.472±6.289、76.334±2.549、36.629±3.148、31.382±2.148、28.146±1.485μmol/L。2细胞分化百分率CLZ诱导细胞向神经元分化过程中,10、20、50μmol/L CLZ在1~3 d细胞分化百分率逐渐增加,第3 d达到最高,结合MTT计算的CLZ对SH-SY5Y细胞第1~5 d的IC50结果,因此选用30μmol/L CLZ诱导细胞分化3 d,进行以下实验。3细胞分化形态学变化与对照组相比,CLZ诱导组细胞逐渐出现增殖速度下降,细胞数目减少,突起伸出,且突起数量和长度逐渐增加。诱导第3 d,细胞具有多个细长突起,且突起的长度明显增长,交织成网状,具备成熟神经元的形态特点,与对照组细胞相比有显着性差异(P<0.05)。4神经元分化的鉴定免疫荧光检测MAP2表达情况,结果显示:30μmol/L CLZ诱导细胞向神经元分化3 d后,突起长度明显增加,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。Western blot同样显示MAP2蛋白表达增高,与对照组细胞相比有显着性差异(P<0.05),说明30μmol/L CLZ可以诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。5 Topo IIβ的表达检测免疫荧光检测Topo IIβ表达情况,结果显示:CLZ诱导组细胞核染色明显加深,q RT-PCR、Western blot均显示Topo IIβ表达增高,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。6 p27、E2F1和PCNA的表达变化CLZ诱导细胞向神经元分化过程中p27在m RNA和蛋白水平均高于对照组细胞,有明显差异(P<0.05),而E2F1、PCNA均低于对照组细胞,有显着性差异(P<0.05),说明30μmol/L CLZ可以诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。7 CLZ影响E2F1在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的结合Ch IP检测显示,CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,结合在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的E2F1蛋白受到明显抑制(P<0.05)。提示:E2F1/Topo IIβ途径参与了CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,CLZ促进了Topo IIβ的转录表达,抑制了细胞的增殖,促进了细胞的分化。结论:本部分研究以E2F1正向调控的靶基因PCNA作为对照,探讨了CLZ对E2F1和Topo IIβ表达的影响。结果提示,CLZ可通过抑制E2F1与Topo IIβ基因结合作用,诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化;从而进一步证明E2F1/Topo IIβ信号途径参与了神经元的分化,并为有关神经发育的研究,相关药物开发及有关神经系统疾病的治疗,提供了新的分子靶点。
王明芳, 李卓夫, 王晓楠, 付连双, 孙莹璐[9]2015年在《低温下冬小麦品种间WRKY转录因子的表达特性》文中提出WRKY转录因子可以通过调控损伤、抗病、衰老等相关基因的表达,从而参与植物的多种生理生化及生长发育过程,在植物应对逆境胁迫过程中起到至关重要的作用。为了明确低温胁迫下WRKY基因表达特性与冬小麦抗寒性的关系,进而为选择和鉴定品种抗寒性提供参考,本研究以强抗寒品种东农冬麦1号(D1)及弱抗寒品种济麦22(J22)为试验材料,经不同低温处理后,通过实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)分析WRKY45、WRKY4、WRKY1、WRKY5和WRKY24五个基因的表达特性。结果表明,经低温冷冻处理后(-10℃2h及-10℃2h后再-12℃2h),D1中WRKY4、WRKY5和WRKY transcription factor 24的表达量均明显高于J22中的表达量;经低温驯化处理(10℃/4℃30d)后,D1中WRKY45表达量明显高于J22中的表达量。D1中,低温冷冻处理后WRKY1、WRKY5和WRKY transcription factor 24的表达量均显着高于低温驯化处理和常温下处理后的表达量;J22中,低温冷冻处理后WRKY45、WRKY4和WRKY transcription factor 24的表达量均显着高于低温驯化处理和常温下处理后的表达量。分析显示WRKY4、WRKY5和WRKY transcription factor 24属于冷冻应激反应型基因;其中WRKY5和WRKY transcription factor 24在不同低温处理下表达差异显着,对D1的强抗寒性起到重要调控作用。
司文涛[10]2017年在《microRNA-34a通过靶向调控Wnt/β-catenin通路中Wnt1蛋白抑制乳腺癌的进展》文中认为研究背景:乳腺癌(breast cancer,BC)是目前最为普遍爆发的恶性肿瘤之一,每年大约有叁十五万人死于乳腺癌,对女性的生命健康构成严重威胁。许多因素与乳腺癌的发生有潜在联系,包括年龄的增长、外用激素、超重、酗酒和吸烟等。近十年来乳腺癌的诊疗方法有了突飞猛进的发展,但由于它的高发性和高致死性等特点,至今仍然是女性健康的一大杀手。因此,人们更多地关注乳腺癌发生的分子机制,希望可以发现其病理发生和发展的机制所在。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度只有大约18-25个核苷酸大小的内源性非编码RNA。在大多数生物中,编码微小RNA的基因占到全基因组的1-3%,微小RNA虽然不直接参与编码蛋白质,但其常常在翻译后水平调节目标基因的表达。众所周知微小RNA可以同时调节许多目标mRNA表达,从而调控包括细胞增殖、分化等一系列细胞功能。之前文章报导显示,微小RNA可以作为新的抗癌治疗靶点。miR-34是一大类miRNA肿瘤抑制基因,因为在细胞周期和细胞存活的控制中其重要作用,其作为抗癌治疗药物已进入临床试验阶段。miR-34广泛存在于各种生物体内,其家族成员之间存在高度同源序列,在进化上十分保守。miR-34已被证明可以通过靶向调节与细胞周期阻滞和凋亡相关的一系列基因,对决定细胞命运起关键作用,在哺乳动物DNA损伤时,p53在转录水平上使miR-34上调。一系列实验表明miR-34家族成员是p53的直接靶点,他们的上调可以诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。除了失活的p53突变或病毒表达的p53抑制剂可以降低miR-34的表达量,miR-34编码基因本身可以在癌症中发生基因突变或表观遗传水平上的失活。由此看出,miR-34a的表达量下调或甲基化失活与肿瘤的发生密切相关。其中,microRNA-34a(miR-34a)是被研究得最为深入的抗癌基因之一,它位于1号染色体长臂的36号区域。除了抗癌以外,miR-34a还可以诱导细胞周期调控、凋亡、衰老、抑制上皮间质转化、抑制癌干细胞增殖等。更多证据显示miR-34a在乳腺癌患者体内可以靶向调控很多基因,包括Fra-1、LMTK3、Bcl-2、Notch。由此表明miR-34a与乳腺癌的发生发展相关,但具体机制尚未阐明,于是我们的研究试图探究此机制。第一部分 miR-34a在乳腺癌组织及细胞系中的表达情况目的:本部分通过大量实验,拟解决以下问题:miR-34a的表达在乳腺癌的组织及各细胞系中是否相对于正常乳腺细胞系有所不同?miR-34a在乳腺癌发生发展中是否受到抑制?材料与方法:我们从随机选取2014年3月到2015年8月期间在山东大学附属齐鲁医院接受手术的123例乳腺癌患者体内获得了其肿瘤组织和配对的非肿瘤正常组织,以及人类乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、人类胚胎肾细胞系HEK293T以及人类正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,利用定量RT-PCR及原位杂交的方法检测不同组织和细胞系中miR-34a的表达量。实验结果:原位杂交及定量PCR结果显示,与正常组织活细胞系相比,miR-34a在乳腺癌组织中的表达明显下调(P<0.05)。与MCF-10A正常乳腺细胞系相比,miR-34a在MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435乳腺癌细胞系中的表达量明显降低(P<0.05)。说明miR-34a很可能参与影响乳腺癌的发生和发展。实验结论:实验表明miR-34a与乳腺癌发生发展是负相关的,可以作为的一个抑制因素,调节其进展。第二部分miR-34a以Wnt1为直接靶点调节乳腺癌中Wnt/β-catenin通路目的了解miR-34a调节乳腺癌发生发展的下游调控靶点及通路是什么?材料与方法:接着我们用生物信息学方法预测出Wnt1是miR-34a的下游直接靶向基因,并且用双荧光素酶报告实验来证明这个结论。将Wnt1野生型的3'末端全长克隆到荧光素酶基因载体pMIR-REPORT的下游,将miR-34a与野生型Wnt1的3'末端共转染到293T细胞中,研究在miR-34a的刺激下是否能够导致荧光素酶活性。将野生型和突变型Wnt1的3'末端和miR-34a 一同转染人胚肾293T细胞,72小时后,以海肾荧光素酶活性作为内参,计算相对荧光素酶活性值。当转染miR-34a模拟物和抑制剂后,用定量RT-PCR及western blot实验检测MCF-7乳腺癌细胞中Wnt1和其他Wnt/β-catenin通路相关基因的表达量,进一步证实miR-34a可以抑制Wnt/β-catenin通路的激活。实验结果:野生型Wnt1与miR-34a共转染可以导致荧光素酶活性大幅度降低(P<0.05),即miR-34a可以导致Wnt1表达量下调;而miR-34a共转染不会引起Wnt突变体荧光素酶活性的降低。并且,MCF-7细胞中miR-34a表达量增加能导致Wnt1表达量的下调(P<0.05);而抑制miR-34a的表达后,Wnt1的表达水平均明显上升,miR-34a表达量上调使β-catenin大幅度表达量下调(P<0.05)。cyclin-D1在转染有miR-34a的MCF-7细胞系中的表达量也受到miR-34a增加的影响而明显下调(P<0.05)。抑制miR-34a的表达后,β-catenin、cyclin-D1的表达水平均明显上升。实验结论:这些结果说明,Wnt1是miR-34a的直接下游调控靶点,miR-34a过表达可以导致Wnt/β-catenin通路的失活。第叁部分miR-34a能够通过靶向调节Wnt1而抑制乳腺癌进展并且通过失活Wnt/β-catenin通路抑制肿瘤生长目的:探究miR-34a与乳腺癌发生发展的关系是如何通过下游信号通路体现的。材料与方法:转染后的MCF-7细胞的增殖、侵袭、迁移水平分别用MTT实验、划痕实验、transwell实验来检测,分析miR-34a在体外实验中对肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。并且,我们建立了乳腺癌异种移植模型,在小鼠体内注射miR-34a抑制剂,测量注射前后肿瘤的大小和重量,并利用定量PCR和western blot方法检测Wnt1、β-catenin、cyclin-D1表达量,来判断miR-34a对乳腺癌体内生长及Wnt/β-catenin通路活性的影响。实验结果:miR-34a过表达使细胞增殖速率明显下降;而当细胞转染miR-34a抑制剂后,增殖速率明显增加(P<0.05)。并且,若转染miR-34a抑制剂的MCF-7细胞同时转染Wnt1小干扰RNA(siRNA),使细胞内表达的Wrt1减少,乳腺癌细胞增殖将下降。划痕实验和穿孔实验结果表明,miR-34a过表达的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力比对照组均有所降低(P<0.05);当miR-34a抑制剂转染细胞后,迁移和侵袭能力有很大提高。另外同时转染miR-34a和Wnt1小干扰RNA的细胞,迁移和侵袭能力都受到明显抑制。用miR-34a抑制剂处理过的小鼠的肿瘤大小和重量都较大(P<0.05):肿瘤大小平均能达到834.3±159.6立方毫米;重量达到平均891.8±115.2 mg。另外,另外,转染miR-34a模拟物可以抑制肿瘤生长(P<0.05)。注射miR-34a抑制剂的小鼠体内异种移植物Wnt1、β-catenin、cyclin-D1表达量均明显增加(P<0.05)。实验结论:这些结果表明miR-34a在体内的下调与乳腺癌细胞增殖、迁移、侵染能力增强有关。体内实验表明miR-34a通过与Wnt/β-catenin信号通路相互作用而抑制乳腺癌肿瘤的体内生长。
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