（南京医科大学康达学院 江苏 连云港 222000）
南京医科大学康达学院科研发展基金重点项目(KD2016KYJJZD004)
摘要 目的：研究缺氧/复氧对H9c2细胞Hippo信号通路的影响。方法：建立H9c2细胞缺氧/复氧模型，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，MTT比色法检测细胞活性，MDA试剂盒检测细胞活性，荧光定量RT-PCR检测YAP的mRNA表达，蛋白免疫印迹检测MST、YAP的蛋白表达和磷酸化水平。结果：与Control组相比，H/R组细胞凋亡率显著升高，细胞活性明显降低，细胞MDA含量明显升高，YAP的mRNA和蛋白表达、MST蛋白表达没有显著差异，MST、YAP磷酸化水平明显升高。结论：缺氧/复氧不影响H9c2细胞Hippo信号通路中MST、YAP蛋白表达，影响其磷酸化水平。
关键词：缺氧/复氧；缺血在灌注损伤；Hippo信号通路
心肌缺血再灌注（ischaemia/reperfusion,l/R）损伤是缺血心肌恢复血液供应所引起的进一步损伤[1]，包括钙超载、严重的氧化应激、诱导心肌细胞凋亡以及增加心肌梗死面积等。随着医疗技术、科研的不断发展，人们对于I/R损伤的认识不断扩大，但是至今仍未有有效的治疗手段。
Hippo信号通路是近年来新发现的，具有调控细胞增殖凋亡作用的通路[2]。Hippo信号通路自发现后，便成为肿瘤研究领域的热点，包括肝癌、肠癌、肺癌、乳腺癌等等[3]。近年来，研究者们也不断发现，Hippo信号通路对心脏的发育、生长、再生以及心血管疾病的形成等过程发挥了重要的调控作用[4]。其中，涉及到的心血管疾病包括心肌梗死、心肌肥大及心脏重构等。本文以大鼠心肌细胞株H9c2细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型模拟心肌I/R损伤，研究Hippo信号通路在I/R损伤中的地位，探讨I/R损伤更完善的机制，为寻找对抗I/R损伤的新靶点提供思路。
1.材料和方法
1.1 细胞 H9c2（2-1），大鼠心肌细胞株，购自中国科学院细胞库。
1.2 主要试剂 DMEM（high glucose）、胎牛血清（美国Hyclone）；AnnexinV-FITC凋亡试剂盒（美国Life technologies公司）；MDA试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；ECL化学发光剂（美国Pierce）；鼠来源抗MST1多克隆体（美国BD Biosciences）；鼠来源抗p-MST1/2（Thr183/180）单克隆体、兔来源抗YAP单克隆抗体、兔来源抗p-YAP（Ser127）多克隆抗体、兔来源抗β-actin单克隆抗体、HRP偶联的兔二抗、HRP偶联的鼠二抗（美国Cell signaling Technology公司）；dNTP mixture （南京天为生物有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 H9c2细胞使用含5%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5％CO2、95%湿度的培养箱内培养细胞。细胞达到80%融合度时使用0.25%胰酶进行消化传代，选择对数生长期细胞用于实验。
1.3.2 缺氧复氧细胞模型建立 将细胞培养基更换为不含血清、并经100%氮气饱和处理的无糖DMEM（pH 6.4）后，立即将细胞移入密封的缺氧罐中，在37℃、100%氮气的缺氧环境下缺氧培养2h，然后再将培养基更换为含1%胎牛血清、并经95%空气/5%CO2 饱和处理的DMEM 后，立即放入二氧化碳培养箱中，在正常氧环境下继续培养1h。
1.3.3 细胞凋亡率检测 建立细胞缺氧/复氧（H/R）模型后，将细胞消化、离心，PBS洗涤后，根据AnnexinV-FITC凋亡试剂盒的步骤进行操作，最后使用流式细胞仪进行细胞凋亡测定。
1.3.4 细胞活性检测 采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）进行检测。取处于对数生长期的细胞接种到96孔板中，细胞贴壁后进行造模，每孔加入20ul MTT液，37℃孵育4h后，弃上清液，每孔加入DMSO 150ul震荡以终止反应，使用酶标仪在570nm波长处检测吸光度。
1.3.5 MDA含量检测 H9c2细胞造模后，消化离心得到细胞沉淀，使用细胞裂解液裂解细胞，1600g离心10min，取上清使用碧云天MDA试剂盒进行测定。
1.3.6 荧光定量RT-PCR 细胞经过造模后，使用Trizol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，之后于ABl7300 PCR仪器中进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为95℃10 min；95℃15 S，60℃1 min，共40个循环。其中YAP引物上游序列：5’-CCATAAGAACAAGACCACATAAT-3’，下游序列：5’-CCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3’; 内参β-actin引物上游序列：5’-CTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游序列：5’-TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-3’。
1.3.7 蛋白免疫印迹（Western-blot） 细胞造模后收集细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。然后加入SDS上样缓冲液，混匀加热后进行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量40ug。转膜封闭后，依次加入一抗、二抗孵育，最后采用化学发光法对蛋白表达浓度进行检测，选取β-actin为内参。条带强度以Quantity One软件进行相对定量。
1.3.8 统计分析 采用SPSS 13．0统计软件进行资料分析，各组数据资料以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 H/R对H9c2细胞的影响 与Control组相比，H/R组细胞凋亡率显著升高（2.80 1.34% vs. 45.56 4.15%，P<0.05，图1A），细胞活性明显降低（100 5.38% vs.57 6.89%，P<0.05,图1B），细胞MDA含量明显升高（3.67 0.59 vs. 9.12 1.08，P<0.05，图2A）。说明，H/R加重脂质氧化，降低细胞活性，诱导细胞凋亡，引起严重的细胞损伤。
2.2 H/R对Hippo信号通路mRNA表达的影响 为研究H/R对Hippo信号通路mRNA表达的影响，我们检测了Hippo信号通路的核心成分YAP(Yes-associated protein) mRNA表达水平，结果显示H/R组与Control组相比没有显著变化（图2B），说明H/R对于Hippo信号通路YAP mRNA表达没有影响。
2.3 H/R对Hippo信号通路蛋白表达的影响 通过蛋白免疫印迹实验，我们检测了MST1、YAP的蛋白表达以及磷酸化水平。如图3、图4所示，与Control组相比，H/R组的MST1、YAP蛋白表达水平没有明显差异，但p-MST及p-YAP水平明显高于Control组。说明H/R对MST1、YAP的蛋白表达没有影响，仅影响MST和YAP的磷酸化水平。
图1 A：细胞凋亡率 B：细胞活性
图2 A：细胞MDA含量 B：细胞YAP mRNA表达
图3 细胞MST蛋白表达以及磷酸化水平
图4 细胞YAP蛋白表达以及磷酸化水平
3讨论
目前，缺血性心脏病仍在全世界范围内有很高的发病率和病死率。临床上，最快速有效的治疗方法是及时恢复缺血区域的血供，而恢复血供会进一步引起心肌损伤，具体表现为心肌细胞死亡、心律失常、心脏功能障碍，最终导致心脏衰竭，这种由缺血后恢复血供（即再灌注）引起的损伤，称为缺血再灌注（ischaemia/reperfusion,l/R）损伤，患有急性心肌梗死的患者死亡率超过一半是由再灌注损伤引起的[5,6]，由此可见其严重性。本实验以大鼠心肌细胞株H9c2缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型模拟心肌I/R损伤，发现H/R严重增加细胞脂质氧化程度，明显降低细胞活性，诱导细胞凋亡，引起了严重的细胞损伤，说明I/R可以导致脂质氧化，促进心肌细胞凋亡，进而增加心肌梗死面积。
I/R损伤的严重性已经明确，但是至今仍没有有效的治疗手段来对抗。因此，研究者们把目光投向了内源性心肌保护机制，即心肌自身的再灌注损伤救助激酶（reperfusion injury salvage kinase,RISK）通路。1986 年Murry[7]等人提出的缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）和2003 年Zhao[8]等人提出的缺血后适应（ischemic postconditioning，IPostC）均能调动内源性心肌保护机制，降低梗死面积，起到心肌保护作用，而缺血预适应及后适应具体详细的作用机制尚不明确，因此在临床使用中受限，所以需要寻求新的更有效实时性更强的治疗靶点来对抗I/R损伤。
Hippo 信号通路是最先在果蝇细胞基因中发现的生长控制信号通路，具有抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用［2］。它是由一系列蛋白激酶和转录共激活因子所组成的激酶链，其中，MST(Mammalian Sterile20-like Kinase) 和YAP(Yes-associated protein)是通路的核心成分，也是近几年的研究热点。MST是一种广泛表达、高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。研究表明，MST在应激状态下（比如心肌梗死）发生磷酸化而被激活，在经过下游反应（比如YAP磷酸化）后促进细胞凋亡[9]。YAP 是一种多功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子，可以在胞浆和胞核之间穿梭，但在其受到上游信号分子调控，发生磷酸化后，被滞留在胞浆，从而失活，刺激基因转录、促进细胞增殖的功能受到抑制[10]。可见，MST和YAP与细胞增殖凋亡过程息息相关。为了研究I/R损伤对Hippo信号通路的影响，我们检测了MST和YAP的基因和蛋白表达以及磷酸化水平。结果显示H/R对MST和YAP的基因和蛋白表达没有影响，但是对其磷酸化水平有显著影响，磷酸化水平均明显升高。说明，H/R引起细胞发生氧化应激，激活MST，使其磷酸化水平升高，激活的MST再经过下游一系列反应使YAP发生磷酸化，从而使YAP被滞留在细胞浆内，无法进入细胞核刺激基因转录，最终促进细胞凋亡。
4. 参考文献
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[3] Ahmed AA, Mohamed AD, Gener M, et al. YAP and the Hippo pathway in pediatric cancer. Mol Cell Oncol.2017; 4(3):e1295127.
[4] Liang N, Zhang C, Dill P, et al. Regulation of YAP by mTOR and autophagy reveals a therapeutic target of tuberous sclerosis complex. J Exp Med. 2014; 211(11):2249-63.
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[10] Zhao B, Wei X, Li W, et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 2007;21:2747–2761.
作者简介：周露，女，汉族，江苏省南京医科大学康达学院基础医学部，教师
论文作者:周露
论文发表刊物:《世界复合医学》2017年第5期
论文发表时间:2017/9/5
标签：细胞论文; 磷酸化论文; 心肌论文; 蛋白论文; 损伤论文; 信号论文; 凋亡论文; 《世界复合医学》2017年第5期论文;