陈祎招[1]2000年在《p16基因对胶质瘤细胞生长作用的实验研究》文中认为不受控增殖是肿瘤细胞的根本属性。随着现代分子生物学的发展，人们认识到肿瘤细胞增殖同正常分裂细胞一样，也按一系列有序步骤进行，称为细胞周期，而在这一周期的若干期相间存在着一些关卡，它们的调控异常则可直接导致细胞的恶性增殖，其中，周期蛋白依赖性激酶（CDK）是这些关卡转变控制中的核心，这一分子机制是决定细胞停止或继续增殖的关键。p16基因正是这一过程的一个重要调控分子，其主要作用是特异性的抑制细胞周期素D（cyclin D）-细胞周期素依赖性激酶（CDK）复合体，从而达到对细胞由G_1期到S期的调控。目前发现，在多种肿瘤中都有p16基因的缺失或突变，其中尤以脑胶质瘤中的缺失率最高，因此，探索p16基因与脑胶质瘤的关系将具有重大意义。 实验方法：采用脂质体及磷酸钙转染的方法将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞系U251，SWO，C6，采用Northern杂交及免疫组化检测p16基因的表达，分别观察p16基因长期稳定转染与短暂转染对胶质瘤细胞的作用，MTT法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪分析转染后细胞周期分布的变化，从p16基因长期稳定转染与短暂转染对胶质瘤细胞的不同作用入手来探索p16基因与胶质瘤细胞凋亡的关系。同时，运用MTT法分析稳定转染p16基因后胶质瘤细胞系对放疗及VM26，CDDP化疗敏感性的变化，流式细胞仪检测化疗药物作用后的胶质瘤细胞周期与凋亡的变化进而分析其可能的细胞生物学及分子生物学机制。 实验结果表明：（1）p16基因可以抑制胶质瘤细胞生长并诱导胶质瘤细胞的G_1期阻滞，使处于G_1期的胶质瘤细胞增加约10.1％-25.8％；（2）p16基因的短暂转染可以诱导胶质瘤细胞凋亡而长期稳定转染则无明显的凋亡诱导作用；（3）p16基因转染后，胶质瘤细胞的放疗敏感性增加，在8Mx射线，距离100cm，照射野20×15cm，吸收剂量8Gy，剂量率500cGy／inin的条件下，pl6基因转染组细胞的抑制率为对照组的 1石2．3倍：同时，胶质瘤细胞对＊＊26，＊＊＊P的化疗敏感性降低并可抑制VM26，CDDP诱导的胶质瘤细胞凋亡。 结论：pl6基因可诱导胶质瘤细胞的q期阻滞进而抑制胶质瘤细胞的恶性增殖；pl6基因可诱导胶质瘤细胞的凋亡但仅发生在pl6基因的短暂转染过程中，而pl6基因的长期稳定转染后无明显的凋亡诱导作用，胶质瘤细胞的遗传异质性与 pl6基因转染后的“自然选择”作用可能是其主要机制；pl6基因可以通过其诱导的胶质瘤细胞o期阻滞进而抑制VM26，CDDP诱导的细胞凋亡从而降低它们对VM26，CDDP的化疗敏感性，同时，pl6基因可以增加胶质瘤细胞的放疗敏感性，这些现象的分子生物学机制仍有赖于我们的进一步深入研究，
高宜录[2]2001年在《人胶质瘤细胞转染p16基因后生物学特性的观察》文中提出目前认为癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发病的分子机制之一，迄今为止，已发现100余种癌基因，但是抑癌基因为数较少，大多数抑癌基因（如Rb、p53、p16等）都是参与细胞周期的调控、维持细胞遗传稳定性和细胞正常增殖的重要基因，而且许多癌基因如cyclinD1、BcL2、c-myc、MDM2等以及病毒蛋白Sv40大T抗原等都是通过结合抑癌基因并进而干扰细胞周期的正常进展。进一步显示抑癌基因在肿瘤的发病机制中占有更为重要的地位。已有报道与胶质瘤发生发展相关的抑癌基因有Rb、p53、p16、PTEN等。在与胶质瘤相关的抑癌基因中，p16基因则有相当高的突变率，平均为85％，且以纯合缺失为主。体内、体外研究证实恢复p16基因缺失的肿瘤细胞的p16基因表达有明显的抑瘤作用，提示p16基因替代疗法有着潜在的应用前景。但对于p16基因转染后是通过何种机制抑制肿瘤细胞生长的尚未完全明了。目前认为肿瘤的发生是多基因的累积异常而致，对于转染p16基因有明显抑制生长效应的肿瘤细胞，是否还有其它抑癌基因表达异常？转染p16基因后，其它的抑癌基因表达是否会发生变化？阐明这些问题无论对p16基因替代治疗还是对肿瘤发病机制的研究都有着重要的意义。 胶质瘤多数是从一个分化成熟的细胞突变成未分化细胞，这种“返祖”现象发生的根本原因是癌基因激活和/或抑癌基因失活。目前实验已经证实癌细胞在诱导分化剂如RA、HMBA和SB等作用下可向正常细胞转化，其机制之一是调节癌基因和/或抑癌基因的表达而实现的。那么，在恢复肿瘤细胞缺失的抑癌基因的基础上，再辅以诱导分化剂是否可以得到更好的效果呢？地塞米松（Dex）是临床治疗胶质瘤的常用药物，它可以明显减轻瘤周水肿，近期报道对人成神经细胞瘤有 人胶质笆幻臼转染一6基因后主物学特性的观察 中文摘要 生长抑制和诱导分化作用，它是否对胶质瘤细胞也有促分化作用尚无 相关报道。 抑癌基因替代疗法在实验研究上取得了明显效果，但放疗和化疗 作为肿瘤辅助治疗也有着不可替代的作用。目前对… 基因有放射增 敏作用看法一致，而对胶质瘤细胞转染P16基因后与化疗药物敏感性 的关系尚无定论。 本研究将口 基因转染巾 功能缺失的人胶质瘤细胞系SHG个4， 探讨：＊）外源性… 基因对P16功能缺失的胶质瘤细胞增殖的影响。 Q）胶质瘤细胞转染P16基因后相关癌基因和抑癌基因表达变化。 Q）Dex对胶质瘤细胞有无诱导分化作用，恢复pl6基因功能，对诱导 分化剂的作用有无影响。Q）胶质瘤细胞转染口 基因后对常用化疗 药物敏感性的变化。 第一部分人厕瘤细胞转染P16基因后细胞增殖 及相踢因甜变化 为探讨外源性pl6基因对pl6基因缺失的胶质瘤细胞增殖的影响 及转染pl6基因后相关癌基因、抑癌基因表达的变化。用RT干CR和 免疫组化法证实人胶质瘤细胞系SHGA4有… 基因功能缺失。应用 分子克隆技术将人p16 CDNA克隆入哺乳动物基因表达载体pCDNA3的 Ballltll和 Xh。互位点之间，构建 p16基因表达载体 pCDNA3－pl6。月质 体介导法将其转染到 SHG叶4。经 G4筛选得到表达 PI6蛋白的阳性 克隆SHG－44－pl6细胞。阳性克隆经 PCR证实p16 CDNA己转入SHG－44 细胞，Western blot和免疫组化显示有 pl6蛋白表达。细胞生长曲 线显示SHG44下 16生长明显受到抑制，其抑制率达84．27％在软琼 脂上克隆形成能力下降约6倍。细胞周期分析表明处在Gl期细胞由 35．53％提高到61．35％。SHG－44－P16在裸鼠体内致瘤能力有所下降。 RT－PCR半定量分析SHG－44细胞转染P16 基因前后的皿、CDK4、P53 和PTEN基因表达量的变化，SHG叶4细胞转染P 16基因后CDK4表达量 下降，而p53表达量升高，Rb、PTEN表达无明显变化。野生型p16基 因转入P16基因功能缺失的肿瘤细胞，能恢复其抑制肿瘤细胞生长的 11 V 人胶质旧细胞转染p16某冈厄生物学特性的观紊 中文摘要 功能。这种抑制功能可能是通过P16蛋白下调CDK4表达、上调P53 表达而实现的。P53可能与P16起着协同作用。P16基因替代疗法在 胶质瘤治疗上有着潜在的应用前景。 第H部分人胶质瘤细胞转染P16基因 对诱导分化作用影响 为研究恢复扯 抑癌基因表达后，再加以诱导分化剂能否得到更 好的分化效果和 Dex对?
陈一招, 徐如祥, 邹琳[3]2000年在《p16基因对脑胶质瘤细胞作用的实验研究》文中研究表明目的 探索 p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及 p16基因在脑胶质瘤临床诊断、治疗中的应用前景。方法 采用脂质体转染的方法 ,将外源野生型 p16基因导入胶质瘤细胞株 U2 5 1、C6 ,筛选阳性克隆。同时以空载体质粒 p CDNA3为对照 ,免疫组化检测 p16基因表达 ,用MTT法测定瘤细胞生长曲线及对转染的瘤细胞在裸鼠体内形成瘤块的变化进行分析。结果 转染 p16基因的 U2 5 1、C6细胞有外源 p16基因的整合及表达 ,克隆形成率减少 ,生长速度明显减慢 ,瘤细胞在裸鼠中形成瘤块体积显著降低。结论 导入外源野生型 p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖。
梁朝辉[4]2012年在《p53诱导的蛋白磷酸酶1在脑胶质细胞瘤中表达及其对胶质瘤细胞株增殖作用的相关性研究》文中进行了进一步梳理脑胶质细胞瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，目前，对于胶质细胞瘤患者的治疗，虽然给予积极的手术、放、化疗等治疗措施，但患者预后仍较差。文献报道，WHO分级3级的胶质细胞瘤患者平均生存期约3-5年，多形性胶质母细胞瘤患者平均生存期尚不足1年，治疗策略的调整及寻找胶质细胞瘤治疗的新靶点，是我们当前亟待解决的难题。野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（the wild–type p53-inducedphosphatase1, Wip1）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2C(PP2C typeprotein phosphatase)家族中的一员,由PPM1D (protein phosphatasemagnesium-dependent1delta)基因编码,位于人染色体17q23/q24区域。2002年，Bulavin等通过实验表明，在野生型小鼠胚胎成纤维细胞转化中，Wip1与Ras, Myc和Neu1等原癌基因具有协同作用，证实它是一种新型原癌基因，并对其发挥致癌作用的可能机制进行探讨，发现主要与高表达Wip1能够促使其作用的下游靶蛋白ATM、chk1/chk2、p38MAPK-p53去磷酸化失活，导致肿瘤的发生。近年来，人们相继发现Wip1在乳腺癌，神经母细胞瘤，卵巢癌，髓母细胞瘤等肿瘤中存在高表达，并且已经发现高表达的Wip1与乳腺癌、胃癌及胰腺癌等肿瘤患者的预后差密切相关。目前，人们已经成功开展了以Wip1为靶点的基因治疗的动物体内外实验，并取得了较好的疗效。然而，针对Wip1在人脑胶质细胞瘤中的研究报道仅限于高级别胶质细胞瘤表达高于低级别胶质细胞瘤，针对不同级别、不同类型胶质细胞瘤组织中Wip1表达水平、Wip1表达与胶质细胞瘤患者预后的相关性及其对多形性胶质母细胞瘤细胞增殖作用等研究尚未见报道。基于上述研究背景，我们试图检测Wip1在不同级别、不同类型胶质细胞瘤组织中的表达，明确Wip1在胶质细胞瘤组织中的表达水平，进一步通过生存曲线分析观察Wip1表达与患者预后的相关性。研究表明，经紫外线照射的p53野生型Burkitt淋巴瘤细胞株能够诱导Wip1表达，而经紫外线照射的p53突变型Burkitt淋巴瘤细胞株却不能够诱导Wip1表达。p53作为最初被发现的抑癌基因，乳腺癌肿瘤组织中存在Wip1表达与p53的表达呈负相关，p53表型不同的乳腺癌其Wip1表达差异性较大，并决定患者预后。因此，探讨p53与Wip1表达的相关性具有重要意义。检测不同p53表型的胶质瘤细胞株中Wip1表达情况对理解胶质细胞瘤恶性生物学特性尤为重要，我们拟通过不同的实验方法观察胶质瘤细胞株U87(p53-野生型)和U251(p53-突变型)中Wip1表达情况，筛选Wip1优势表达细胞株，为进行下步实验奠定基础。原癌基因的启动或高表达是肿瘤发生发展的重要原因，治疗策略是拮抗其表达，最常用的基因治疗手段是RNA干扰技术，探讨应用RNA干扰技术沉默Wip1基因对胶质细胞瘤细胞增殖功能的影响，从而实现肿瘤生长抑制的目的，以期为胶质细胞瘤的基因治疗奠定理论基础。本学位论文涉及的研究内容主要包括三部分：第一部分: Wip1在人脑胶质细胞瘤组织中表达及其临床意义目的：观察Wip1在不同级别、不同类型人脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织中的表达情况，探讨Wip1的表达水平与胶质细胞瘤病理级别、病理类型、肿瘤大小等临床特性及其与患者预后的相关性。方法：1标本采集收集河北医科大学第二医院神经外科2003年12月-2005年12月期间81例行手术切除取得的胶质细胞瘤组织及15例正常脑组织，正常脑组织取自颅脑外伤患者内减压术。所有标本经两名以上神经病理医师诊断确诊。81例患者中，男性48例，女性38例，术前对患者进行KPS评分，所有患者术前均无放、化疗和免疫治疗史；标本取材后，部分投至液氮中速冻；另一部分标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，行免疫组化染色。术后记录肿瘤病理级别、肿瘤大小及生长部位等临床特征。对所有入组患者给予手术、放疗及化疗三种综合治疗方法，自术后6个月~1年开始进行电话或信件随访。2采用免疫组织化学方法（SP法）分别检测胶质细胞瘤组织及正常脑组织中Wip1, p53和PCNA的表达情况。3分析Wip1表达与胶质细胞瘤患者年龄、性别、肿瘤病理级别、大小、位置、KPS评分、PCNA及p53表达的关系。通过单因素Log-rank（Kaplan-Meier）生存曲线分析Wip1表达与患者预后相关性，进一步行Cox回归模型分析高Wip1表达相对危险度。4逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chine reaction，RT-PCR）检测胶质细胞瘤组织及正常脑组织中Wip1mRNA的表达情况。5Western blot检测胶质细胞瘤组织中Wip1蛋白表达。结果：1免疫组织化学结果显示：Wip1蛋白在肿瘤细胞浆和细胞核着色，在恶性度较高的胶质细胞瘤血管壁上亦存在阳性物质着色。在胶质细胞瘤组织中的表达阳性率为55%(45/81)，15例正常脑组织中Wip1呈弱表达或阴性表达，高级别和低级别胶质细胞瘤组织阳性表达率分别为81.4%（35/43）和26%（10/38），胶质细胞瘤组织Wip1阳性表达高于正常脑组织，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），高级别胶质细胞瘤组Wip1表达高于低级别组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2RT-PCR结果显示Wip1mRNA在高级别、低级别及正常脑组织中相对表达量分别为0.28±0.03，0.25±0.04和0.08±0.01, Wip1在脑胶质细胞瘤组织中的表达高于正常脑组织，具有统计学差异（P＜0.05），但在高级别和低级别胶质细胞瘤之间Wip1mRNA表达无统计学差异（P＞0.05）。3Western blot结果显示Wip1在IV级胶质细胞瘤、III级胶质细胞瘤及II级胶质细胞瘤中的表达相对量分别为3.05±0.18，2.53±0.11和1.71±0.10，不同级别胶质细胞瘤组织之间Wip1的表达具有统计学差异（P＜0.05），并且随胶质细胞瘤病理级别的增高，Wip1表达有增高趋势；而不同类型、同级别的胶质细胞瘤组织中Wip1表达不具有统计学差异（P＞0.05）。4p53，PCNA在脑脑胶质细胞瘤中的表达及其与Wip1表达的相关性p53免疫组织化学结果显示，阳性表达位于细胞核，在高级别胶质细胞瘤中的阳性表达率为72%(31/43)，在低级别胶质细胞瘤中阳性表达率为50%，在正常脑组织中呈阴性表达。PCNA免疫组织化学结果显示，阳性表达位于细胞核，在胶质细胞瘤中的阳性表达率为89%(72/81)，并且随胶质细胞瘤病理级别的增高而表达增高，而在正常脑组织中呈阴性表达。5Wip1高表达与胶质细胞瘤患者的年龄、性别、肿瘤位于幕上/幕下无关（P＞0.05）。Wip1高表达与肿瘤大小、KPS评分、病理级别、PCNA及p53表达有关（P＜0.05）。Spearman秩相关分析检验得出PCNA免疫标记指数与Wip1表达密切相关(r=0.639，P＜0.001)。6单因素Log-rank生存曲线分析（Kaplan-Meier）显示WHO分级、肿瘤大小、KPS评分及Wip1表达与患者预后相关（P＜0.05）。进一步行CoX回归模型分析显示Wip1高表达, KPS评分（KPS＜80），WHO分级(III~IV)相对危险度与对照组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：1Wip1在人脑胶质细胞瘤组织中表达高于正常人脑组织，Wip1表达随肿瘤病理级别的增高而表达增高，低级别胶质细胞瘤和高级别胶质细胞瘤中Wip1mRNA表达无统计学差异，但高级别胶质细胞瘤中Wip1蛋白表达要高于低级别胶质细胞瘤中Wip1蛋白表达，具有统计学差异，即胶质细胞瘤组织中Wip1mRNA和蛋白表达水平存在不一致，推测这一现象与Wip1蛋白转录后调控机制的存在及其半衰期长短有关。2Wip1高表达与胶质细胞瘤患者预后差密切相关。3Wip1与p53表达呈正相关，与Wip1是由p53诱导产生有关。Wip1与PCNA表达呈正相关，二者在胶质细胞瘤的恶性浸润性生长中可能起到协同作用。4Wip1表达与胶质瘤病理级别、大小、PCNA表达、p53表达及患者KPS评分有关。Wip1表达与患者年龄、性别和胶质瘤位于幕上/下无关。第二部分: Wip1在多形性胶质母细胞瘤细胞株中的表达目的：观察Wip1在p53表型不同的人多形性胶质母细胞瘤细胞株(U87和U251细胞)中的表达情况，筛选Wip1优势表达细胞株；同时检测p53Wip1，Wip1PCNA在胶质细胞瘤细胞株中共表达情况。方法：1免疫细胞荧光技术检测人多形性胶质母细胞瘤U87和U251细胞中Wip1表达。2免疫荧光技术检测p53/Wip1和Wip1/PCNA在U87和U251细胞中的共表达。3流式细胞技术检测Wip1在人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中的表达。4逆转录聚合酶链反应检测Wip1mRNA在人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中的表达。5Western blot检测不同p53表型的人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中Wip1蛋白表达。结果：1免疫细胞化学荧光染色显示，Wip1在p53野生型的U87胶质瘤细胞株中的表达高于p53突变型的胶质瘤细胞株U251中的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2免疫细胞荧光染色结果提示两种细胞株中均存在p53/Wip1、Wip1/PCNA共表达现象。3流式细胞技术检测到U87细胞株Wip1平均荧光强度（X-mode值）高于U251细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4RT-PCR和Western blot检测结果显示U87细胞Wip1mRNA和蛋白表达均高于U251细胞（P＜0.05）。结论：1筛选出的p53野生型胶质细胞瘤细胞株—U87细胞,为Wip1优势表达细胞株，对进一步开展以Wip1为靶点的基因治疗提供基础。2p53/Wip1在胶质细胞瘤细胞株存在共表达，与Wip1由p53诱导产生有关；PCNA/Wip1在胶质瘤细胞株中存在共表达，二者在胶质细胞瘤细胞的增殖过程中可能起到协同作用。第三部分Wip1对人多形性胶质母细胞瘤细胞株U87的增殖作用的相关性研究目的：构建Wip1RNA干扰慢病毒载体，并感染至胶质细胞瘤细胞株U87，探讨Wip1在人多形性胶质母细胞瘤细胞U87增殖中的作用。方法：1构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，建立稳定转染的Wip1-/-U87细胞。2逆转录聚合酶链反应检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞Wip1mRNA相对表达量变化。3Western blot检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞Wip1蛋白表达变化。4四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验检测U87细胞转染Wip1-shRNA慢病毒感染1天、2天、3天、4天、5天及7天后细胞增殖能力变化。5流式细胞技术（FCM）检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞周期变化。结果：1成功构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，并经阳性克隆测序证实。U87细胞Wip1mRNA和蛋白表达水平在转染慢病毒载体后均低于阴性转染组及空白对照组，以转染后3天表达水平最低，差异具有统计学意义（P＜0.05）,空白对照组及阴性转染组相比，二者差异无统计学差异(P＞0.05)。2MTT法检测结果提示Wip1-shRNA慢病毒转染组U87细胞生长增殖速度受到显著抑制,其中以转染后3天抑制效果最为明显,慢病毒转染组增殖率为20.15±6.22%,而阴性转染组及空白对照组增殖率分别为43.56±5.56%和48.37±6.13%，慢病毒转染组与空白转染组及阴性转染组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)；空白对照组及阴性转染组相比，二者之间差异无统计学差异(P＞0.05)。3流式细胞仪检测结果显示,慢病毒转染组与阴性转染组及空白对照组相比，转染后1天、2天、3天、4天细胞周期比例未见明显差异，但转染慢病毒载体组细胞于转染后第5天开始S期细胞出现增多, G2/M期细胞明显减少，于转染后第7天该现象最为明显(P＜0.05)。阴性转染组与空白对照组相比较，二者之间S期细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1成功构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，并经测序验证证实，建立了Wip1-/-稳定转染U87细胞株，所构建的慢病毒载体对U87细胞Wip1mRNA和蛋白的表达能够产生抑制作用。2转染Wip1shRNA慢病毒干扰载体，能够使U87细胞增殖受到明显抑制,Wip1基因对胶质瘤细胞的恶性增殖起重要作用。
涂艳阳[5]2006年在《小分子RNA靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中表达研究》文中认为【背景】 脑肿瘤是神经系统中常见的疾病之一，对人类神经系统的功能有很大的危害。在成人，恶性颅内肿瘤占全身恶性肿瘤的1.5％，居第十一位；在儿童，则占全身恶性肿瘤的7％。胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤之一，位于三大颅内肿瘤之首，其发病率占全部脑肿瘤40％以上。目前对于胶质瘤的治疗，尽管有手术、放化疗等多种的传统治疗手段，但恶性胶质瘤仍是高度致死性的肿瘤性疾病。据统计，罹患恶性胶质瘤(低度分化星形细胞瘤和胶质母细胞瘤)患者的2年存活率是5％，偏良性胶质瘤患者10年存活率是20％。 随着对胶质瘤发病机制的深入研究以及分子生物学技术的日新月异，分子靶向治疗有望成为一种新的具有广阔前景的肿瘤治疗手段。肿瘤的基因靶向治疗是目前肿瘤生物治疗研究的热点领域之一。肿瘤基因靶向治疗的策略包括肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的过继免疫治疗，这类TAA须高度选择性表达于肿瘤细胞而不表达或低表达于正常组织和细胞；采用反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides，ASON)等技术靶向抑制在肿瘤发生发展中有重要功能的相关基因，也成为肿瘤靶向治疗的新热点，如与肿瘤增殖凋亡以及细胞周期相关的调控基因c-myc，hTERT，CyclinD等，国内外已有广泛报道。
朱晓楠[6]2012年在《LRIG1对人脑胶质瘤细胞增殖及放疗敏感性的影响及其机制的研究》文中进行了进一步梳理目的：采用脂质体转染质粒的方法上调人脑胶质瘤细胞中LRIG1基因的表达,探讨LRIG1基因对人脑胶质瘤细胞细胞周期、凋亡率、DNA损伤修复、细胞增殖及放疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法：通过脂质体介导的方法转染含有LRIG1基因的质粒进入人脑胶质瘤U251细胞,得到高表达LRIG1的瞬时转染细胞。通过G418筛选并建立稳定表达LRIG1的细胞株。采用Western Blot及RT-PCR方法检测细胞中LRIG1、P27、Bax、 Bcl-2及Rad51基因或蛋白表达的变化。CCK-8法测定细胞生长抑制率。细胞染色后流式细胞仪测定其细胞周期分布及凋亡率。克隆形成实验检测细胞放疗敏感性。彗星分析试验检测细胞放疗前后DNA损伤的修复。结果：成功建立稳定表达LRIG1细胞株,荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光蛋白,其LRIG1蛋白表达量高于空载体对照组(P<0.05)。转染含LRIG1质粒后,人脑胶质瘤细胞LRIG1mRNA表达上调(P<0.05)。LRIG1基因显著抑制了人脑胶质瘤细胞的增殖,转染LRIG1基因72h后较未转染的U251细胞的细胞增殖抑制率为26.4%。LRIG1上调了细胞周期调控蛋白P27的表达(P<0.01),相对于对照组未转染细胞的处于GO/G1期的细胞比率(38.5±2.1)%, LRIG1高表达组处于GO/G1期的细胞比率增加到(61.2±3.1)%,差异具有统计学意义(P<0.01),从而LRIG1降低了细胞增殖指数。LRIG1上调了细胞中促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05),同时显著降低了凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达(P<0.01), LRIG1高表达组的细胞凋亡率为(16.6±0.8)%,与对照组未转染细胞的(8.8±0.3)%相比,凋亡率显著增高(P<0.01)。而克隆形成实验证明LRIG1显著增强了人脑胶质瘤细胞的放疗敏感性,其放射增敏比为1.448。而在放疗前及放疗后LRIG1均显著抑制了细胞中DNA损伤修复蛋白Rad51的表达,其差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.01),而彗星分析显示放射治疗后LRIG1抑制了人脑胶质瘤细胞的DNA损伤修复(P<0.05)。结论：实验成功建立了稳定表达LRIG1蛋白的人脑胶质瘤U251细胞系。LRIG1通过上调细胞周期调控蛋白P27的表达,上调处于GO/G1期的人脑胶质瘤细胞比率,从而抑制细胞生长。LRIG1通过调控凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2的表达,促进人脑胶质瘤细胞凋亡。LRIG1可降低人脑胶质瘤细胞放射治疗前后DNA损伤修复蛋白Rad51的表达,从而降低放疗前后细胞DNA损伤的修复,最终导致细胞死亡。因此,LRIG1能够抑制人脑胶质瘤细胞生长并增强其放疗敏感性,对人脑胶质瘤具有治疗作用,实验为LRIG1应用于人脑胶质瘤临床治疗提供了新的依据。
蒋常文[7]2006年在《外源性IL-18基因对大鼠C6胶质瘤细胞生物学特性及化疗敏感性的影响》文中研究指明研究表明,癌基因扩增、抑癌基因失活及细胞周期调控基因表达异常与胶质瘤的发生、发展及胶质瘤的恶性程度和预后有关。近年来,随着分子生物学研究不断深入,在胶质瘤基因治疗方面取得了一定的进步,有的方法已经进入临床试验阶段或应用于临床,为胶质瘤的基因治疗提供了一条新途径。细胞因子是一类具有介导和调节免疫炎症反应等多种生物学活性的小分子可溶性蛋白质,通过自分泌或旁分泌方式作用于分泌细胞本身或其它细胞。它们主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞等细胞产生,一些肿瘤细胞也可产生某些细胞因子。细胞因子失调是免疫系统不能有效杀灭肿瘤细胞的重要原因之一。IL-18(interleukin-18)是新近发现的一种细胞因子,具有多种生物学活性,可激活T细胞、NK细胞,使Th1、NK细胞产生INF-γ。在T细胞或NK细胞存在的情况下,体内、外研究均证实IL-18有抗肿瘤作用。有研究报道在体外没有T细胞、NK细胞存在的情况下,IL-18也可诱导肿瘤细胞凋亡;在体内用抗NK细胞或INF-γ抗体消除其作用后,IL-18仍然具有抗肿瘤作用,但其确切作用机制尚未明了。为此,本课题研究外源性IL-18基因在体外对C6胶质瘤细胞生物学特性和化疗敏感性的影响。本研究分四部分。第一部分:外源性IL-18基因对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响目的:研究外源性IL-18基因对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭力、克隆形成率等生长特性的影响及其可能分子机制。方法:1细胞培养C6/IL-18细胞、C6/pLXSN细胞及亲代C6细胞均以RPMI1640培养基培养,内含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml。置饱和湿度、37℃、5% CO_2培养箱培养。
潘冬生[8]2009年在《重组腺病毒介导人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因治疗胶质瘤的实验研究》文中研究指明研究目的本研究旨在探讨腺病毒载体(AdV)介导的人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因对胶质瘤细胞的凋亡效应和免疫原性影响,以及动物在体实验中对胶质瘤的治疗效果,为进一步胶质瘤的联合基因治疗提供实验依据。研究方法确定适宜的AdV感染倍数(MOI),选用胶质瘤细胞系U251和U87为模型细胞,以携带人WT-p53、GM-CSF、B7-1的AdV(BB-102)转染U251和U87细胞后,以Western印迹杂交法检测WT-p53基因的表达,ELISA法检测GM-CSF基因的表达,流式细胞仪检测B7-1基因的表达。台盼蓝染色法观察细胞存活,绘制生长曲线。PI-Hoechst33342染色法检测凋亡效应。MLR反应观察其对胶质瘤细胞免疫原性的影响。并观察BB-102介导的目的基因体外修饰胶质瘤细胞激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。在体实验通过利用非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠重建人免疫系统和皮下移植人胶质瘤的模型,然后接种经BB-102基因修饰的胶质瘤瘤苗,激发淋巴细胞产生抗肿瘤免疫反应,从而对瘤苗的免疫保护作用进行评价。结果AdV能够有效转染胶质瘤细胞,转染效率与MOI在一定范围内呈正相关,适宜的MOI为200 pfu/cell。重组腺病毒BB-102能够有效地将其所携带的三种目的基因导入胶质瘤细胞并使其在细胞中高效表达,同时能抑制细胞增殖,诱导胶质瘤细胞凋亡,增强其免疫原性并可以激活淋巴细胞的CTL反应。应用HuPBL-NOD/SCID小鼠模型进行免疫保护实验,结果证明BB-102基因修饰的胶质瘤瘤苗可以明显抑制移植瘤生长,能够保护HuPBL-NOD/SCID小鼠抵抗胶质瘤细胞的攻击。结论重组腺病毒介导的人WT-p53、GM-CSF和B7-1基因体外修饰胶质瘤细胞可作为胶质瘤细胞瘤苗,有望应用于临床胶质瘤的辅助治疗。
王占祥[9]1998年在《脑胶质瘤动物模型的建立及外源性P21～（WAFI/CIP1）基因治疗胶质瘤的实验研究》文中提出脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤。长期以来，由于没有一种简单有效的肿瘤动物模型，使得对其发生、发展机制的研究受到极大影响。另外，在胶质瘤的治疗方面，尽管目前采用了手术、化疗、放疗等综合治疗措施，其治愈率仍很低，复发率、伤残率及死亡率仍很高。因而建立理想的胶质瘤动物模型及探索有效的胶质瘤治疗途径，对该肿瘤的研究有着极其重要意义。 本课题在前人研究的基础上，首先应用乙基-N-亚硝基脲和大鼠C_6胶质瘤细胞，探讨了化学药物诱发胶质瘤模型和细胞同种异植胶质瘤模型的可行性，同时研究了抑癌基因P21~(WAF1/CIP1)在胶质瘤组织中的表达，及其对胶质瘤细胞生长的影响，为P21~(WAF1/CIP1)基因治疗胶质瘤的临床应用研究奠定了理论基础。主要研究内容和结果如下： 第一部分 脑胶质瘤动物模型的建立 1．孕18-20天SD大鼠，通过尾静脉穿刺注入乙基-N-亚硝基脲(NNEU，50和70mg／kg)，结果86.49％(32／37)的子一代火鼠诱发产生神经系统肿瘤，其中约1／3肉眼可见，2／3为镜下所见：肿瘤大部分分布在脑(61.1％)和脊髓(25.0％)，小部分分布在外周神经(包括颅神经和脊神经)：肿瘤的病理类型主要是胶质瘤(77.8％)，其次是神经鞘瘤和脑膜瘤。肿瘤的形态特征：位于皮层下白质内，呈园形或类园形，灰白色胶胨状，边界清晰：光镜下可见肿
余水长[10]2014年在《胎盘羊膜间充质干细胞的生物学特性及细胞移植对胶质瘤生长抑制作用的实验研究》文中研究说明间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有自我更新和向中胚层来源细胞分化能力的多能干细胞。MSCs具有低免疫原性，细胞移植无免疫排斥反应，对肿瘤有靶向性和抑瘤性等，使其在肿瘤治疗和损伤修复等研究中成为热点。MSCs的来源取自成人骨髓最为常见，但取材时需要骨髓穿刺，且人骨髓中的MSCs含量极低，细胞数量和扩增、分化能力随年龄增长均显著下降，使其临床应用受到限制。近年来，从胎盘羊膜间质中获取羊膜间充质干细胞（amniotic mesenchymal stem cells,AMSCs）成为MSCs的新来源，具有材料供应丰富、取材方便、操作安全、污染机率少，细胞增殖能力强、扩增速度快等优势，为干细胞移植治疗开辟新的途径。人脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，侵袭性强，发病早期即向周围正常脑组织内呈指状浸润性生长，术后易复发，患者预后差，死亡率高。近年来研究表明，MSCs具有向人脑胶质瘤的特异性定向迁移能力，除了部分迁移到胶质瘤内，主要是呈“胶囊样”分布于脑胶质瘤体与正常脑实质的边界，并有部分细胞能“追踪”瘤体外散在的胶质瘤细胞，可成为胶质瘤基因治疗的理想载体。MSCs本身对于脑胶质瘤具有抑瘤效应。体内外研究表明MSCs可抑制胶质瘤细胞增殖，可能与诱导细胞凋亡、阻碍细胞周期等有关。但胎盘来源的AMSCs对人脑胶质瘤是否具有趋瘤和抑瘤效应，机制如何，有待进一步研究。本实验旨在建立有效的AMSCs体外培养扩增体系，经诱导分化探讨AMSCs的细胞生物学特性；通过体外实验，观察AMSCs定向迁移至胶质瘤病变区域的能力及对肿瘤细胞生长的作用；建立裸鼠人脑胶质瘤模型，瘤内注射AMSCs，观察移植后AMSCs的存活、迁移及对肿瘤生长的作用，初步探讨AMSCs在体内外趋瘤抑瘤效应的可能机制。第一部分AMSCs的分离培养和细胞生物学特性鉴定目的：建立有效的AMSCs体外培养扩增体系，通过诱导分化探讨AMSCs的细胞生物学特性。方法：取健康产妇正常剖宫产足月胎儿的新鲜胎盘组织，钝性分离羊膜层，取羊膜组织消化培养，倒置显微镜观察AMSCs的细胞形态；流式细胞仪检测细胞表型；采用特定诱导条件将AMSCs分别向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和神经组织方向诱导分化，采用特异性染色对诱导后细胞进行鉴定。RT-PCR法分析软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞及神经组织特异性基因在诱导前后AMSCs中的表达。结果：（1）倒置显微镜观察AMSCs均呈典型的成纤维细胞样贴壁生长，流式细胞仪分析显示，AMSCs高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。（2）AMSCs经成骨诱导后，细胞均由长梭形向立方形转变，von Kossa染色可见细胞呈集落生长并出现钙结节；经成软骨诱导2w后，AMSCs形态逐渐变得扁平，甲苯胺蓝染色可见细胞被染成蓝色；经成脂肪诱导2w后，细胞内有明显的脂滴出现，油红O染色阳性；经成神经诱导24h后，AMSCs呈神经胶质细胞样或/和神经元样改变，多数细胞呈现GFAP免疫荧光标记阳性。（3）RT-PCR结果显示：AMSCs向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞诱导后，表达PLIN（脂肪细胞）、ACAN（软骨细胞）和RUNX2（骨细胞）特异性基因；向神经组织诱导前AMSCs即表达nestin mRNA、GFAP mRNA、mushashi-1mRNA以及β-tubulin III mRNA，诱导2d，除了表达以上基因外，还有NF mRNA表达，诱导5d，仅Nestin mRNA的表达有所下降。结论：从人胎盘羊膜组织中经过特定的分离消化培养易于获得AMSCs，且增殖能力强和传代稳定。研究结果表明AMSCs具有MSCs干细胞标记及细胞生物学特性，具有多向分化能力。第二部分AMSCs对胶质瘤细胞生长抑制作用的体外研究目的：观察AMSCs向人脑胶质瘤的定向迁移能力及对肿瘤细胞生长的作用，初步探讨AMSCs体外趋瘤抑瘤效应的可能作用机制。方法：在Transwell培养下室分别接种不同密度的人脑胶质瘤细胞系U251细胞，观察接种于上室的AMSCs的定向迁移能力。将生长良好的P3代AMSCs培养上清转移到微型浓缩器中，离心制备上清浓缩蛋白，加入U251细胞培养基作用后，采用Transwell侵袭实验检测U251细胞侵袭力的变化，透射电镜观察U251细胞形态学变化，AnnexinV-FITC-PI双染法检测细胞早期凋亡情况，RT-PCR法分析肿瘤细胞Casepase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表达情况。结果：（1）Transwell迁移实验结果表明U251细胞可在体外共培养时增强AMSCs的定向迁移能力，且其效应与肿瘤细胞接种密度呈依赖性。（2）经AMSCs上清浓缩蛋白作用后，Transwell侵袭实验结果表明U251细胞侵袭力降低。（3）透射电镜下可见细胞核固缩，核内染色质密集、趋边凝聚明显，质膜脱落及凋亡小体等典型的凋亡形态特征。（4）Annexin V-FITC-PI双染结果显示：U251细胞在AMSCs上清浓缩蛋白作用24h时后的凋亡率为9.34±4.27％，而在48h后凋亡率为42.93±11.54％，二者之间有显著性差别(P<0.05)，提示细胞凋亡率随着作用时间的增加而升高。（5）RT-PCR检测结果表明：AMSCs上清浓缩蛋白作用24h后，U251细胞Casepase-3、Bax的mRNA表达水平明显高于对照组，在48h时进一步升高，实验组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；Bcl-2mRNA表达水平在24h和48h均低于对照组，实验组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论：胶质瘤微环境中分泌的各种趋化因子可增强AMSCs定向迁移能力，与接种的胶质瘤细胞密度呈依赖性。AMSCs可抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。AMSCs可在体外抑制胶质瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡，其机理可能是Bcl-2/Bax比值下降，激活caspase-3，最终导致胶质瘤细胞凋亡。第三部分AMSCs对胶质瘤生长抑制作用的体内研究目的：裸鼠瘤内注射AMSCs，观察AMSCs的存活、迁移以及移植对实体肿瘤的作用，初步探讨AMSCs趋瘤抑瘤的可能机制。方法：采用雄性裸鼠腋窝皮下注射U251细胞制作人脑胶质瘤模型，随机分为3组。对照组正常饲养，不予任何处理；PBS组瘤内注射0.2ml PBS缓冲液；AMSCs移植组瘤内注射BrdU标记的0.2ml AMSCs悬液，每天测量肿瘤大小。AMSCs移植14d后处死，取出肿瘤组织，HE染色观察肿瘤病理特征改变；免疫荧光染色观察AMSCs存活、迁移情况；透射电镜观察肿瘤细胞超微结构改变；RT-PCR法分析肿瘤组织Casepase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达情况。结果：（1）裸鼠皮下人脑胶质瘤造模成功率高，肿瘤接种3d后在腋窝皮下可见肿块，7d后皮下肿瘤可达5mm左右，肿瘤大小随时间的延长而增大。对照组和PBS组肿瘤的生长基本一致，AMSCs移植组肿瘤生长出现明显抑制，与对照组和PBS组相比有显著性差异（P<0.05），实验表明瘤内注射AMSCs可显著抑制裸鼠胶质瘤的生长。（2）光镜观察可见肿瘤细胞排列致密，毛细血管增生明显，部分可见坏死，周边可见肿瘤呈浸润性生长，侵入肌组织之间。病理性核分裂相多见，呈异型性。（3）免疫荧光染色显示瘤内有较多的BrdU阳性细胞。（4）透射电镜下可观察到肿瘤细胞核浆比高，核固缩、染色质趋边凝聚及凋亡小体等典型的凋亡形态特征。（5）RT-PCR检测结果表明AMSCs移植组肿瘤组织Casepase-3、Bax的mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)，Bcl-2mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)。结论：裸鼠胶质瘤模型瘤内移植AMSCs可在瘤内存活、迁移，通过诱导细胞凋亡等过程抑制胶质瘤的生长，对脑胶质瘤的临床治疗，可能成为更为有效的途径。
参考文献：
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[5]. 小分子RNA靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中表达研究[D]. 涂艳阳. 第一军医大学. 2006
[6]. LRIG1对人脑胶质瘤细胞增殖及放疗敏感性的影响及其机制的研究[D]. 朱晓楠. 武汉大学. 2012
[7]. 外源性IL-18基因对大鼠C6胶质瘤细胞生物学特性及化疗敏感性的影响[D]. 蒋常文. 河北医科大学. 2006
[8]. 重组腺病毒介导人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因治疗胶质瘤的实验研究[D]. 潘冬生. 第四军医大学. 2009
[9]. 脑胶质瘤动物模型的建立及外源性P21～（WAFI/CIP1）基因治疗胶质瘤的实验研究[D]. 王占祥. 第四军医大学. 1998
[10]. 胎盘羊膜间充质干细胞的生物学特性及细胞移植对胶质瘤生长抑制作用的实验研究[D]. 余水长. 苏州大学. 2014
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