周家喜[1]2001年在《马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒及其亲本驴强毒转录调控的比较研究》文中进行了进一步梳理本研究采取RT-PCR方法，以从马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒（DLA EIAV）疫苗培养物中提取的RNA作为模板，获得两种编码马传染性贫血病毒反式激活蛋白Tat的基因克隆，分别命名为Etat319和Etat312；然后通过序列比较选取保守克隆Etat319作为模板，再次扩增得到完整的tat基因，所得tat基因全长231bp，编码含76个氨基酸的蛋白。将获得的tat基因克隆到真核表达载体pcDNA3中，得到重组表达质粒tat-pcDNA3，转染实验表明它对EIAV LTR具有反式激活功能。 本研究在健康驴白细胞中比较了D-A EIAV、DLA EIAV及EIAV美国Wyoming株叁者之间长末端重复序列（LTR）启动报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）表达的活性差异，以及在EIAV Tat蛋白存在条件下叁者受激活时启动CAT表达的活性差异。结果表明在驴白细胞中，DLA EIAV LTR启动CAT表达的活性略高于D-A EIAV LTR；而与EIAV Wyoming株LTR比较，DLA EIAV与D-A EIAV二者LTR启动CAT表达的活性都较低。在共转染重组表达质粒tat-pcDNA3条件下，由于Tat蛋白的激活作用，D-A EIAV及DLA EIAV LTR的起始活性都得到提高，分别提高了4.8倍和6.0倍，而EIAV Wyoming株LTR活性仅提高了3.2倍。 为了验证中国EIAV（DLA EIAV与D-A EIAV）LTR中U3增强子区新发现的GATA基序在病毒转录中的作用，本研究采用PCR定点突变技术将该基序TGATAA突变为TTCGAA，然后转染稳定表达GATA转录因子的K562细胞，检测突变前后U3+R区域启动报告基因表达的差异。结果发现GATA转录因子结合基序突变以后，强弱毒U3+R区域启动报告基因表达的活性分别下降了43％和52％，表明GATA基序在中国EIAV转录过程中起正调控作用，这与在其它反转录病毒基因表达调控中观察到的作用是一致的。 此外，本研究还通过PCR定点突变技术将D-A EIAV TAR元件中的差异碱基按照强毒致弱过程中的改变进行了突变，即将D-A EIAV TAR中的碱基A突变为DLA EIAV相同的碱基G，同时将D-A EIAV TAR相邻区域+3位的碱基A定点突变为与DLA EIAV相同的T。检测结果表明突变前后无明显差异。提示可能由于碱基突变而引起的DLA EIAV TAR二级结构变化在细胞内无法产生，或者即使形成这种增加的小泡，但位于茎部末端，并不能为EIAV Tat蛋白所识别。
王柳[2]2001年在《马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。由于慢病毒给人类和动物的健康造成了严重的威胁，因此慢病毒的免疫预防，尤其是艾滋病的免疫预防成为研究的热点。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的动物模型。马传贫驴白细胞弱毒疫苗（DLA-EIAV）是将分离自辽宁省的EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强（称为驴强毒，DA-EIAV），然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。在这一过程中，EIAV L株由强毒变为弱毒，用此弱毒疫苗接种动物后不表现临床症状，但可诱导免疫保护。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制，为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，我们对马传贫驴白细胞弱毒及其亲本马强毒EIAV L株前病毒进行了全基因克隆和序列测定，比较分析了二者的前病毒基因组核苷酸序列，在此基础上构建了EIAV驴白细胞弱毒株的感染性分子克隆和叁株含有EIAV强/弱毒嵌合病毒基因组的重组质粒，并对EIAV弱毒株长末端重复序列（LTR）的启动子活性进行了初步研究。 本研究以DLA-EIAV感染细胞总DNA及其亲本强毒EIAVL株感染马外周血液白细胞中DNA为模板，应用PCR方法分段扩增出DLA-EIAV和L株的前病毒，并将各段扩增产物克隆后进行测序。根据国外发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列，推导出DLA-EIAV和L株全基因组核苷酸序列，经比较分析，DLA-EIAV株前病毒基因组全长8266个碱基，EIAV L株前病毒基因组共有8235bp。DLA-EIAV株与其亲本马强毒L株和驴强毒DA-EIAV株核苷酸序列相比，同源率分别为97.0%和97.5%。DLA-EIAV株和L株相比，长末端重复序列（LTR，由U3、R、U5组成）、编码囊膜糖蛋白的基因env及ORF S2的变异率很高，U3、R、U5、env及ORF S2核苷酸序列差异率分别达13.2%、7.5%、5.1%、2.7%和3.9%，env基因及ORF S2推导的氨基酸序列差异率分别为4.4%和8.8%。EIAV L株与国外已发表的一些相关毒株相比核苷酸序列差异很大，同源性只有79%，RTase的氨基酸同源率只有86%，Gag蛋白的的同源率只有79%，说明EIAV L株与国外已报道的几个EIAV毒株的亲缘关系较远。 通过对EIAV L株与DA-EIAV、DLA-EIAV及国外相关毒株的gp90推导的氨基酸序列进行比较，发现在同一毒株系列内，N-连接糖基化位点增多与病毒毒力具有正相关性。这一现象提示我们，DLA-EIAV株gp90 N-连接糖基化位点的减少可能是弱毒产生免疫保护的原因之一。 马传贝性贫血病驴白细跑弱耳及其亲本马强霉儿株）王 柳 基因组序列比较分析以及弱霉感染性分子克巨的构建2001年6月 DLA－EIAV与L株在前病毒U3增强子区的主要差别是，DLA－EIAV含有转录因子bHLH作用一致序列E－oX，而L株U3增强子区不存在这一基序。通过对DLA－EMV和L株比较发现二者TAR的二级结构不同，DLA－EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变，形成一个尿啼陡突起。由于病毒基因的表达受细胞转录因子和反式激活蛋白Tat的调控，驴白细胞弱毒增强子区卜七Ox的引入和病毒反式激活应答区TAR结构的改变，可能使弱毒的细胞嗜性改变和在体内复制能力下降，表现为毒力减弱。 将克隆的DLA－EDeV株各个片段顺次连接，获得了一个含有EMV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为EIAV－ps．2，经核昔酸序列分析，证明ps二含有EIAV前病毒的全基因。用EMV－ps．2转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ps二衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后，第4天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明EMV－ps二具有感染性，获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆。 为了进一步研究弱毒LTh和env基因的变异与毒力减弱及诱导免疫保护之间的关系，我们将 DLA－EL＼V感染性分子克隆的乙h用 EInV L株的 LTR替换，另外将DLA－EMV感染性分子克隆的gp90编码区用乙株的gp90编码区替换，并将EIAV L株的LTh和gp90编码区同时替换DLA－EMV株感染性分子克隆的相应片段，获得了叁株含有EIAV强溺毒嵌合病毒基因组的重组质粒。 将我国马传贫病毒弱毒株的长末端重复序列克隆于含CAT基因的载体中，获得重组质粒 pCAT七TR，用 pCAT－LTh分别转染驴胎皮肤细胞（FDD）、胶质母细胞瘤 （TJ－905）细胞、驴臼细胞及接种 EtaV弱毒的 FDD和驴白细胞，结果以 EIAV弱毒的LTR为启动于，CAT在这几种细胞中均获得了不同程度的表达，证实了我国EMV弱毒株的LTh在FDD、TJ－905及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能，并能被反式激活表达。 总之，本研究首次获得了我国DLA－EIAV和L株前病毒全基因克隆，确定了DLA－EIAV和 L株前病毒基因组核昔酸全序列，?
参考文献：
[1]. 马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒及其亲本驴强毒转录调控的比较研究[D]. 周家喜. 中国农业科学院. 2001
[2]. 马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建[D]. 王柳. 中国农业科学院. 2001