王海燕[1]2009年在《靶向VEGF基因的siRNA和树突状细胞对乳腺癌MCF-7细胞作用的体外研究》文中提出目的血管新生和免疫受抑是肿瘤发生的重要生物学机制。肿瘤患者体内多存在免疫缺陷或功能受损,肿瘤细胞通过多种细胞和分子机制逃避机体的抗肿瘤免疫反应,其中树突状细胞(DC)分化异常和对T细胞刺激能力的下降是导致肿瘤免疫逃逸的重要因素。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的促血管新生因子,肿瘤细胞过量分泌的VEGF除了具有促血管新生活性外,还可通过抑制造血祖细胞来源的DC的分化而发挥免疫抑制作用。基于VEGF促血管新生活性和免疫抑制的双重作用,本研究拟应用siRNA阻断VEGF活性达到抗肿瘤血管新生的同时改善肿瘤免疫状态,同时应用体外诱导正常DC的联合抗瘤作用,观察这种联合是否能够增强体外抗瘤效果,为临床抗肿瘤血管新生联合DC免疫治疗提供实验依据。方法以MCF-7乳腺癌细胞为观察对象,体外设计合成靶向VEGF的siRNA,采用siRNA技术靶向抑制MCF-7细胞VEGF基因的表达,观察siRNA基因沉默效果及对靶细胞的影响;分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),在一定细胞因子组合下诱导、培养DC;模拟肿瘤体内环境,添加MCF-7乳腺癌细胞培养上清培养DC,观察MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响,探讨肿瘤机体内DC的免疫抑制状态;观察VEGF下调后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响的变化,探讨阻断VEGF活性对于改善DC功能的作用;进一步探讨靶向MCF-7细胞VEGF基因的siRNA和负载肿瘤抗原的DC二者联合对MCF-7细胞的抗瘤效果。结果设计合成的siRNA转染MCF-7细胞后VEGF mRNA和蛋白表达水平明显减低,同时抑制了靶细胞的增殖;在体外应用粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),白介素-4(IL-4)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)能有效培养人外周血单个核细胞来源的DC;MCF-7乳腺癌细胞培养上清能够明显抑制正常外周血单个核细胞诱导的树突状细胞的分化成熟及抗原提呈能力,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达明显降低(p＜0.01),DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显降低(p＜0.01);干扰VEGF基因后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对DCs的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达显着升高,DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显升高(p＜0.01);靶向VEGF基因的siRNA和DC联合应用可显着抑制肿瘤细胞生长,细胞几乎完全溶解,细胞杀伤率达99%。结论体外设计合成的双链siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞VEGF基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡;MCF-7乳腺癌细胞上清明显抑制外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞的分化、成熟及抗原提呈能力。下调VEGF后的MCF-7细胞上清对DCs的分化、成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用;应用siRNA联合负载肿瘤抗原DC能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长,为该课题进一步的体内实验和临床应用基因治疗联合免疫治疗提供理论基础。
俞志勇[2]2003年在《白血病细胞来源的树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应研究》文中指出研究目的： 免疫治疗是继手术治疗、放疗、化疗及生物治疗之后肿瘤治疗的又一新方法，其技术、方法日趋成熟，治疗过程的安全性逐步提高。但是如何进一步提高治疗效率、降低复发率及各种并发症，提高患者生存质量已成为肿瘤免疫治疗领域的一项重要研究内容。树突状细胞(Dendritic cell，DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，它具有强大的T细胞激活能力，并能活化初始型T细胞、刺激B淋巴细胞增殖成熟、刺激Th细胞及NK细胞活性。它不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体免疫组织的抗肿瘤效应。基于DC的抗肿瘤免疫治疗已在临床上逐步出现，并以其介导抗肿瘤效应的确实疗效及安全、有效性而为临床工作者称道。但如何进一步增强DC介导肿瘤抗原的特异性一直是人们关注的问题。研究从白血病细胞诱导分化发育而来的DC，利用其细胞本身带有的原始肿瘤细胞的特异性抗原来进一步提高CTL细胞的肿瘤杀伤效应，可以较好的解决这个问题，同时也为白血病的免疫治疗开辟了一个新的方向。 研究内容： 一、白血病细胞来源的DC诱导培养及鉴定 利用髓性白血病(包括慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒、单核细胞白血病)细胞诱导培养DC，观察其光镜、扫描电镜及透射电镜影像，DC的流式检测及免疫组织化学染色确定其特征性免疫表型，做DC染色体检测确定其肿瘤细胞来源，同时检测其分化效率并绘制生长曲线，最后进行DC冻存及解冻的性状对比研究。 二、DC介导的CTL的肿瘤杀伤效应研究 缓解期病人外周血CTL细胞培养、鉴定，DC与CTL、肿瘤细胞共同孵育后，军事医学科学院硕士学位论文加入LDH底物液、显色液，用酶联仪测定57Onm处的光密度值，来检测对肿瘤细胞的杀伤作用。结果: 所做的3例慢性粒细胞白血病(CML)患者的4份标本均观察到典型的DC光镜、扫描电镜及透射电镜影像，流式检测及免疫组织化学染色确定为DC特征性免疫表型，做Dc染色体检测确定为CML细胞来源，DC冻存后再次解冻，其形态、性状、活性基本没有改变。另外所作的2例A毗讯3、AML一麒细胞也均培养出了典型的DC。杀伤试验结果表明肿瘤细胞来源的DC能明确提高CTL细胞的肿瘤杀伤效应，并且随着DC加入比例的增加，其提高的CTL细胞的肿瘤杀伤效应也越强，统计学分析也充分证明了这一点。结论: 1.白血病细胞在多种细胞因子的作用下可以向DC转化。 2.白血病细胞来源的DC保留了其原始肿瘤细胞的特异性肿瘤抗原。 3.DC冻存对其形态、性状、活性改变不大，便于今后临床批量生产、使用。 4.白血病细胞来源的DC能够明确增强自体CTL细胞的肿瘤杀伤效应，且DC 数量与刺激作用有明确的正相关关系。
邹湉[3]2007年在《慢性粒细胞白血病总RNA转染树突状细胞介导的抗慢性粒细胞白血病作用的体外研究》文中认为目的:探讨人慢性粒细胞白血病(CML)总RNA体外转染自体慢性粒细胞白血病-树突状细胞(CML-DC),并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫反应,为CML疫苗的临床研究提供理论依据。方法:利用10例CML患者骨髓单个核细胞(BMMNC),加入重组白介素-4(rhIL-4)、重组粒单细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组肿瘤坏死因子(rhTNF-α)等细胞因子联合培养诱导CML-DC。用Trizol法提取CML-BMMNC的总RNA,用CML-BMMNC制备肿瘤冻融抗原。于CML-DC培养第5天,将CML-DC分成4组,比较总RNA经脂质体转染的CML-DC,总RNA不经脂质体转染的CML-DC,CML肿瘤冻融抗原负载的CML-DC,未负载抗原的CML-DC共4组分别致敏T淋巴细胞产生的CTL杀伤活性,另设以IL-2培养的T淋巴细胞为空白对照组。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同方法产生的CTL杀伤CML细胞的作用;用倒置显微镜观察CML-DC诱导前后形态学变化;用流式细胞仪器检测CML-DC诱导前后CD1α、CD83表型变化;用染色体G显带技术及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其染色体核型及Bcr-abl融合基因的表达。结果:CML BMMNC诱导成CML-DC, CD1α、CD83表型诱导前均在5%以下,诱导培养成熟的CML-DC细胞CD1a、CD83阳性细胞分别占(20.15±3.36)%、(25.37±2.72)%较前均明显增高(P均<0.01)。诱导的CML-DC均存在Bcr-abl基因带和Ph1染色体,提示CML-DC为白血病源性。总RNA经脂质体转染CML-DC、总RNA不经脂质体转染CML-DC、CML肿瘤冻融抗原负载CML-DC、未负载抗原CML-DC分别致敏的CTL及IL-2培养的T淋巴细胞在效:靶比为20:1时的杀伤效率分别为74.67±3.54%、36.45±3.02%、51.07±3.67%、31.52±1.82%、10.62±3.17%。总RNA经脂质体转染的DC所诱导的CTL杀伤活性最强,与后四者杀伤活性有显着性差异(P<0.001)。未负载抗原的CML-DC所诱导的CTL与经IL-2培养的T细胞组相比,杀伤率明显增高(P<0.001)。结论:CML BMMNC经rhIL-4、rhGM-CSF、TNF-α联合培养诱导的CML-DC,CD1a、CD83均明显增高,此类DC既具有CML白血病源性,又具有DC细胞的特性,能诱导特异性CTL杀伤作用。此外,总RNA经脂质体转染的CML-DC诱导的CTL杀伤性对CML细胞的杀伤作用最强。
黄晖蓉[4]2006年在《乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究》文中认为目的 树突状细胞(Dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的专职性抗原呈递细胞(Antigen-presenting Cells,APC),是激发特异性免疫应答的中心环节和抗肿瘤免疫的重要载体。以DC为基础的肿瘤疫苗在部分恶性肿瘤的治疗中已显示出良好的效果。肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是临床肿瘤化疗失败的主要原因之一,大量研究证实肿瘤的生物治疗对机体而言更为安全,不像化疗、手术、放射等方法杀伤肿瘤的同时也大量杀伤了正常细胞。因此我们设想是否能将P-gp作为肿瘤免疫治疗的靶点,将其高表达的MDR肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,诱导产生P-gp特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应?以及产生的特异性CTL反应与药物敏感肿瘤细胞抗原致敏的DC所诱导的CTL反应有何不同?故此,本实验拟用人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,探讨其对杀瘤活性的影响。 方法 采集健康供者骨髓血,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,应用重组人粒/单细胞集落刺激因(rhGM-CSF,1000U/ml)、重组人白介素-4(rhIL-4,500U/ml)和重组人肿瘤坏死因子-a(rhTNF-a,100ng/ml)联合培养体系诱导骨髓单个核细胞产生DC,再以人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,以光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪(FACS)检测细胞免疫表型,MTT法检测DC诱导CTL增殖及体外效应细胞杀伤活性。 结果 骨髓单个核细胞(BMMNC)经体外扩增培养后,具有典型的树突状形态特征,流式细胞仪检测细胞表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR表达率均较培养前明显增高(P<0.01),经抗原负载的DC能有效地激发外周血单个核细胞(PBMNC)中CD8~+T细胞增殖(P<0.01)。MCF-7/ADR-DC及
陈绍倩[5]2007年在《白血病细胞来源exosomes诱导CTL的抗白血病作用》文中认为白血病是血液系统最常见的恶性疾病，近年来白血病的发病率呈逐渐上升的趋势。上世纪末期逐渐完善的诱导缓解化疗和支持对症治疗已可以使绝大多数的患者达到完全缓解(Complete Remission，CR)；白血病的治疗目前面临的主要问题是：有一小部分患者因原发耐药导致初次诱导缓解治疗无效不能达到完全缓解；初次诱导缓解治疗有效能达到完全缓解的病人则还面临着残留白血病细胞的继发耐药所导致的复发，这一问题是目前白血病临床治疗中，也是其它肿瘤临床治疗中所面临的最大难题；因此激发患者自体的免疫功能以杀灭白血病细胞／肿瘤细胞的肿瘤疫苗成为肿瘤治疗研究的热点。免疫治疗在肿瘤或白血病的治疗中一直处于辅助治疗的地位，至今没有特别有效的免疫治疗能应用于临床。研究显示肿瘤细胞、肿瘤细胞可溶性抗原、肿瘤细胞蛋白质或蛋白肽以及肿瘤细胞RNA／DNA都携带有肿瘤抗原和／或肿瘤相关抗原，可以作为肿瘤疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应；但其免疫原性往往比较弱，目前还难以真正应用于临床解决白血病或肿瘤治疗中所面临的问题。树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的唯一能激活初始型T细胞(naive T cells)并诱导特异性免疫应答的抗原呈递细胞，目前的研究结果提示激活的T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)介导的适应性免疫应答在机体抗白血病效应中起关健作用。用白血病抗原负载的树突状细胞作为“抗白血病治疗性疫苗”的效果已得到了验证，但是目前还有很多相关的诸如树突状细胞的来源和功能维持等问题没有解决，如树突状细胞疫苗需要大量的树突状细胞，功能难以保持，并且难以制定GMP(Good Manufacturing Practice)生产标准，不宜保存等客观问题制约着树突状细胞疫苗的研究和应用。L．Zitvogel和G．Raposo等研究小组的研究结果显示肿瘤抗原冲击后的树突状细胞来源exosomes(DEX)和树突状细胞一样能诱导明显的抗肿瘤免疫反应，产生有效的免疫保护和治疗作用，提示exosomes可能是更有潜能的肿瘤治疗型性疫苗。exosomes是一种直径在30-100nm范围有双层膜的囊泡小体，可由多种细胞分泌，并且携带有所有抗原呈递所需的物质分子，包括MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子CD86、CD80、以及黏附分子CD54、CD11c和CD1a-d；肿瘤细胞来源的exosomes(TEX)除携带有MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子等抗原呈递所需要的分子外，还携带有和细胞靶向相关的CD9分子以及肿瘤抗原运载系统热休克蛋白分子(蛋白分子伴娘，hot shock protein，HSPs)，同时也携带有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原和肿瘤相关抗原，能把肿瘤抗原转运给专职的抗原递呈细胞和效应细胞，从而激活体内的抗肿瘤免疫反应并放大这种免疫反应，产生对肿瘤的排斥效应。另外和DC疫苗相比exosomes还具有耐高温、可长期冷藏、定量分析和易于制定GMP生产标准等优点，因而被认为是新的抗原传送和呈递的载体，同时也是更有潜能的肿瘤治疗性疫苗。目前对exosomes的研究尚处于初始阶段，国内还未见在白血病方面的研究报道。而且根据文献报道，急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)细胞和慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)细胞可以直接诱导分化成树突状细胞，这些树突状细胞既具备了白血病细胞的特点，同时又具有树突状细胞的特点和功能，其外泌的exosomes也应该具有树突状细胞来源exosomes和肿瘤细胞来源exosomes的双重特性；而且和实体肿瘤相比，白血病细胞取材更为便捷，更方便研究和应用。基于此本课题研究了白血病细胞来源exosomes诱导的CTL的抗白血病作用。实验方法第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用1．K562细胞诱导分化树突状细胞(K562-DCs)的诱导和鉴定根据文献报道的方法，用含有重组人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhIL-4)及肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的RPMI-1640细胞营养液培养K562细胞诱导树突状细胞生成。在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化；流式细胞仪检测培养前后细胞表面CD34、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86和CD54等树突状细胞标志分子的表达；电镜下观察并摄像其典型形态。2．K562细胞和K562-DCs分泌exosomes的提取和鉴定收集对数生长期的K562细胞培养上清液和培养第12-14天的K562-DCs的培养上清液，根据文献报道的多步骤离心获取exosomes的方法，通过低速离心、高速离心去除细胞培养上清液中的细胞和细胞碎片等杂质，再把上清液经过100，000g超高速离心1小时，获取的沉淀即为exosomes。紫外分光光度仪对exosomes进行蛋白定量，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot检测所携带的标志性分子；电子显微镜下观察其形态特征。3．K562细胞来源exosomes诱导CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用用K562细胞来源exosomes(Kexo)刺激正常人外周血单个核细胞诱导分化的树突状细胞(MC-DCs)作为实验组，未刺激组做为对照组，然后分别诱导正常人T淋巴细胞产生CTL，MTT法检测两组CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用。4．不同K562细胞exosomes诱导CTL对K562细胞的杀伤作用分别用K562细胞源exosomes(Kexo)、K562-DCs源exosomes(DCexo)、热休克K562细胞源exosomes(Hexo)、K562细胞冻融抗原和K562细胞总RNA抗原冲击K562-DCs源exosomes(Rexo、Fexo)刺激正常人MC-DCs，并进一步诱导活化CTL效应细胞，MTT法检测CTL效应细胞对K562细胞的杀伤作用。5．不同K562细胞exosomes联合CPG佐剂诱导CTL对K562细胞的杀伤作用同上方法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)、K562-DC分泌exosomes(DCexo)和RNA抗原冲击K562-DC exosomes(Rexo)单独或联合CpG ODN佐剂后诱导CTL对K562细胞的杀伤活性。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF、CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达，首先采用免疫组化方法用CKLF单抗检测CKLF在K562细胞和K562-DC中的表达，再分别提取K562细胞和K562细胞总RNA抗原荷载K562-DCs后的RNA，根据CKLFSF8基因特异性引物，采用RT-PCR方法观察CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs及其分泌exosomes的影响用脂质体转染试剂把携带CKLFSF8基因片段的pcDNA3.1质粒转染到K562细胞和K562-DCs中，倒置显微镜下观察细胞生长，MTT法检测细胞增殖状态，免疫细胞化学法检测细胞表面EGFR(EGF受体)的表达，并提取相应细胞培养上清液中的exosomes，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot鉴定所携带exosomes的标志性分子，电子显微镜下观察其形态特征及其分泌的变化。第叁部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．CML患者原代白血病细胞来源exosomes诱导CTL对患者白血病细胞的杀伤作用CML患者抗凝外周血梯度离心获取原代白血病细胞并培养，同第一部分方法获取CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)，MTT法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)和Pexo诱导的患者CTL对患者原代白血病细胞的杀伤作用。2．不同方法获取的Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用同第一部分方法MTT法检测CML患者Pexo、CML患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PDCexo)和患者白血病细胞冻融抗原刺激白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PFexo)单独或联合CPG ODN佐剂诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用3．PFexo诱导同种异体CTL对患者白血病细胞的杀伤作用取患者治疗后正常自体和HLA完全相合同胞外周血单个核细胞诱导培养树突状细胞，诱导培养第5天分别加入终浓度为20ug／ml的PFexo继续培养48小时，再分别加入同源T淋巴细胞诱导CTL生成，MTT法检测对患者白血病细胞的杀伤作用。实验结果第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用1．K562细胞可诱导分化成树突状细胞我们的实验证实K562细胞经rhGM-CSF、rhIL-4和rh TNF-α诱导培养到12-14天时细胞呈典型的树突状细胞形态，透射电镜下可见到由细胞胞浆伸出的长短不一的绒毛样突起，在诱导培养后细胞表面CD34、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD11c、CD54、CD80、CD86和CD40等标志性分子的表达都明显发生改变，呈DC的特点。2．K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌exosomes从K562细胞培养上清液和K562-DCs培养上清液中都能分离到exosomes(Kexo，DCexo)，SDS-PAGE电泳分析显示二者有相似的蛋白带型。透射电子显微镜下呈50-90nm大小的膜颗粒。Western blot蛋白分析显示都携带有标志性蛋白分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80和CD40等分子。3．Kexo诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用我们的实验结果提示，Kexo刺激正常人树突状细胞并诱导T淋巴细胞特异性的对K562细胞的杀伤作用，同时对HL60细胞有一定的交叉杀伤作用。4．不同K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用不同方法处理K562细胞(诱导分化DCs、K562细胞热休克、K562细胞RNA和冻融抗原刺激K562-DCs)来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作比K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用强，而这四种exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用近似。5．CpG ODN佐剂能增强exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用。Exosomes能诱导有效的CTL对K562细胞的杀伤作用，联合应用CpG ODN Th1型免疫佐剂后，进一步增强了其杀伤作用。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DC中的表达CKLF和CKLFSF8在此两种细胞都有表达，并且在K562细胞RNA抗原荷载前后的K562-DC和K562细胞中的表达没有变化。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs的增殖和exosomes分泌的影响我们采用多种转染试剂转染K562-DC均未能达到满意的转染效果，应用能特异性结合树突状细胞受体的JetPEI-Man转染试剂也只是观察到很低的转染率，没有观察到转染对树突状细胞增殖和分泌exosomes的影响。CKLFSF8基因转染K562细胞后，转染率也很低，未能如期筛选出稳定表达的细胞株，并且导致K562细胞的逐渐死亡，但转染空质粒的细胞没有发现此现象，提示CKLFSF8基因转染导致K562细胞的死亡，进一步对多种其它肿瘤细胞的转染试验结果类似。MTT法测定显示转染后的K562细胞增殖受抑，斑点分析显示转染前后外泌的exosomes无明显变化。免疫组化方法检测转染前后K562细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，发现转染CKLFSF8基因后其表达明显下调，推测CKLFSF8基因转染K562细胞后其增殖受抑制的可能机制是EGFR表达下调导致K562细胞生长信号传导受抑最终导致细胞的死亡。第叁部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．Pexo诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用对CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用的研究显示：Pexo的免疫原性和Kexo有所不同，Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比Kexo诱导的更强。PDCexo和PFexo与Pexo相比有更强的免疫原性，联合CpG免疫佐剂可以进一步增强exosomes诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用。2．PFexo刺激同种异体树突状细胞诱导的CTL的抗白血病细胞作用患者原代白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体正常及HLA完全相合同胞的MC-DCs和淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，PFexo诱导的同胞CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比自体的更强。讨论白血病的治疗目前面临的最大难题是临床医师对耐药的患者没有有效的应对方法，这类患者很难达到长生存。由于白血病免疫治疗的效果还很有限，临床上免疫治疗一直是作为辅助治疗来进行的，但对免疫治疗的探索并没有停止过。近些年对树突状细胞的大量研究证明树突状细胞疫苗对恶性肿瘤的治疗作用是肯定的，但是树突状细胞作为肿瘤治疗性疫苗还存在诸如来源和功能维持等许多问题尚未解决，难以广泛应用。而近些年有关exosomes的研究结果则让我们看到了新的白血病免疫治疗的曙光，几组动物体内和临床实验结果都显示：肿瘤抗原荷载的树突状细胞来源的exosomes可以诱导产生比较好的对肿瘤的预防和治疗效果，而且exosomes更具备了耐高温、可长期冷藏和易于定量等优点，克服了树突状细胞疫苗的一些缺点，尽管目前对exosomes在体内的生理和病理生理作用还不甚明了，还需要进行大量的研究工作，但其作为无细胞治疗性疫苗的潜能是明显的。目前很少有关exosomes在白血病方面的研究报道，白血病细胞可以诱导分化成树突状细胞，具备了肿瘤细胞和树突状细胞的双重特点，并且白血病细胞取材更为便利，更利于研究和应用。基于此我们研究了白血病细胞来源exosomes诱导的杀伤白血病细胞的作用。我们的结果显示K562细胞可以诱导分化成树突状细胞，K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌的exosomes携带有MHC分子和共刺激分子等抗原呈递所必需的分子，体外能诱导T淋巴细胞产生对K562白血病细胞特异性的CTL杀伤作用和对HL60白血病细胞的交叉杀伤作用。进一步的试验发现K562细胞经过热休克处理、诱导分化成树突状细胞和冻融抗原或RNA抗原冲击K562-DCs后分泌的exosomes能更有效地诱导这种杀伤作用。联合应用CpG ODN佐剂能进一步促进这种杀伤作用。对患者自体原代白血病细胞来源exosome的研究显示，和K562细胞来源的exosomes相比，它诱导的对患者原代白血病细胞的杀伤作用更为明显。患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源的exosomes或白血病细胞冻融抗原冲击患者白血病细胞诱导分化树突状细胞源exosomes能诱导比原代白血病细胞来源exosomes更强的杀伤活性。联合CpG佐剂其诱导的杀伤作用进一步增强。患者白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体和HLA完全相合同胞的淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，同胞CTL的杀伤作用更强。提示这些白血病细胞源exosomes都是很好的备选exosomes治疗性疫苗的来源，在对其有了全面的了解和认识后，有望作为白血病治疗性疫苗用于白血病的临床治疗。为了观察趋化因子样细胞因子超家族成员8(CKLFSF8)对exosomes质和量的影响，以探寻更为有效的exosomes来源，我们进一步对CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs表达的研究未能达到预期目的，我们的研究发现，CKLF和CKLFSF8在K562细胞及其诱导分化树突状细胞中均有表达。把CKLFSF8基因转染到K562细胞没有如期筛选出稳定表达的细胞株，发现CKLFSF8基因转染抑制K562细胞生长，转染其它细胞如Eca109、HL60、BGC823后也观察到类似的结果，推测CKLFSF8在肿瘤细胞中的表达可能有更微妙的机制，通常的表达可能和细胞的生物活性有关，是细胞生长所必须的，不抑制细胞的生长；但过度表达则可能抑制细胞的生长。进一步用免疫组化分析细胞表面的EGFR的表达，发现CKLFSF8基因转染后EGFR的表达显着下降，推测可能是白血病细胞或肿瘤细胞增殖能力减低的原因。转染CKLFSF8基因后的K562细胞分泌的exosomes质和量无变化，推测可能与设定的检测指标有关，也可能还和其它因素有关，还有待深入的研究。结论：1．K562白血病细胞和慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞均可以诱导分化成树突状细胞，并且白血病细胞和白血病树突状细胞均分泌exosomes。2．白血病细胞和白血病树突状细胞分泌的exosomes携带有抗原呈递所需要的物质分子，并且有抗原呈递功能，可以诱导淋巴细胞活化产生对白血病细胞的特异性和交叉杀伤作用。CpG ODN免疫佐剂可以增强exosomes诱导的免疫应答的强度。3．CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs都有表达，K562细胞在CKLFSF8基因转染前后都能分泌具有抗原提呈功能的exosomes并刺激T细胞活化。转染后CKLFSF8在K562细胞的过表达使其细胞表面EGFR表达下调，并且直接抑制白血病细胞的生长。4．Exosomes有希望用于白血病的免疫治疗。
陈婷[6]2007年在《肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究》文中研究说明[背景和目的]生物治疗是继手术、放疗和化疗之后临床治疗恶性肿瘤的第四种治疗模式。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究，人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞(Cytotic T Lymphocyte，CTL)发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子，而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位(epitopes)，因此，寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。树突状细胞(Dendritic cells,DC)作为体内最强大的抗原提呈细胞，是免疫应答过程的始动者和调节者。负载CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于应用等优势而成为目前抗肿瘤治疗研究的一个热点。肝素酶(Heparanase，Hpa)是近年来新发现的一个肿瘤转移相关基因，在正常组织中仅低表达于淋巴细胞和骨髓等免疫组织，但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在，而且表达的水平与肿瘤的转移、TMN分期等临床预后不良指标明显相关，肝素酶已成为中晚期肿瘤治疗的一个良好靶位。那么肝素酶能否作为一种肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗?我们过去的研究表明，肝素酶全长基因负载的DC体外可以诱导肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有杀伤作用，而对肝素酶阳性但MHC不相匹配的胃癌细胞不具有杀伤效应，提示肝素酶氨基酸全长序列中一定存在能诱导特异性CTL反应的抗原表位。本研究的目的在于寻找存在于肝素酶全长序列中的能够有效激发机体抗肿瘤效应的CTL表位。鉴于HLA-A2．1是中国人群中最为常见的HLAⅠ类分子的型别，阳性率高达50％，因此鉴定肿瘤转移相关抗原Hpa的HLA-A2．1限制性CTL表位将会对中国人群中肝素酶表达阳性的恶性肿瘤提供免疫治疗的基础。[方法]1、采用超基序和量化基序相结合的方法对肝素酶的HLA-A2．1限制性CTL表位进行预测，并用分子模拟技术模拟表位肽与MHC分子结合的空间构象，分析结合参数以进一步提高预测的准确性，然后从结果中选取得分较高的5条肝素酶表位肽进行合成、纯化、分子量鉴定，利用T_2细胞的特点对合成的候选肽与HLA-A2．1分子的进行亲和力分析；采用标准~(51)Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，从而筛选出能够有效激活CTL反应的肝素酶抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离并得到人外周血单个核细胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α诱导扩增人成熟树突状细胞，并从形态学、细胞表面CD分子进行鉴定；用上述筛选的候选肽负载DC诱导产生特异性CTL，采用标准~(51)Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、U-2OS骨肉瘤细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、SW480结肠癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、MCF-7乳腺癌细胞(Hpa~-，HLA-A2．1~+)、HepG2肝癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~-)以及转染了肝素酶全长基因的MCF-7／Hpa乳腺癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)和转染了HLA-A2．1基因的HepG2／HLA-A2．1肝癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)的免疫杀伤效应；采用HLA-A2．1单克隆抗体封闭上述靶细胞的HLA-A2．1位点，或以CD8单克隆抗体封闭效应细胞的CD8位点，再用肝素酶表位特异性CTL杀伤KATO-Ⅲ胃癌细胞，以研究筛选的肝素酶表位是否受HLA-A2．1限制以及CTL效应细胞的来源；采用标准~(51)Cr释放实验研究肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤活性，以确定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。3、将上述筛选的肝素酶候选表位负载C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓来源的DC(mDC)后，免疫小鼠叁次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，采用~(51)Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7／Hpa、HepG2、HepG2／HLA-A2．1细胞以及自体淋巴细胞和mDC的杀伤效应；ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。[结果]1、采用超基序和量化基序方法联合预测出5条得分最高肝素酶表位肽：Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)；T_2细胞亲和力分析发现预测的5条多肽均能与T_2细胞有效结合；采用标准~(51)Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，结果表明，Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞具有明显的杀伤效应，而Hpa(353-361)和Hpa(400-408)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的杀伤效应与阴性肽相同，提示Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可能是肝素酶特异性抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离HLA-A2．1阳性健康志愿者外周血中的单个核细胞(PBMC)，用重组人细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α联合诱导扩增，经形态学观察以及采用流式细胞术对细胞表面CD分子进行鉴定，成功制备了PBMC来源的成熟DC；采用标准~(51)Cr释放实验检测Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)表位负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对不同来源肿瘤细胞的免疫杀伤效应，结果表明，肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且HLA-A2．1阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶全长基因的MCF-7细胞(MCF-7／Hpa)和转染了HLA-A2．1全长基因的HepG2细胞(HepG2／HLA-A2．1)重新产生明显的免疫杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异、且受HLA-A2．1限制；用HLA-A2．1和CD8分子的单抗分别封闭靶细胞表面的HLA-A2．1位点和效应细胞表面的CD分子后再进行杀伤实验，结果表明肝素酶特异性CTL对封闭了HLA-A2．1的KATO-Ⅲ细胞无明显杀伤效应，封闭了CD8的效应细胞对KATO-Ⅲ细胞亦无明显杀伤效应，进一步提示这种杀伤效应是HLA-A2．1限制，CTL效应细胞来源于CD8阳性的T淋巴细胞；采用标准~(51)Cr释放实验验检测上述肝素酶抗原表位诱导的肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤效应，结果表明肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞无明显杀伤效应，提示肝素酶多肽疫苗的安全性(表1)；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力，结果表明，肝素酶抗原表位能促进效应细胞IFN-γ的分泌。3、用上述肝素酶表位肽负载C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓来源的DC(mDC)，然后免疫小鼠叁次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，以不同来源的多种肿瘤细胞作为靶细胞，用~(51)Cr释放法检测杀伤效应，实验结果表明，肝素酶表位特异性的CTL对肝素酶阳性且HLA-2阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对感染了肝素酶全长基因的重组腺病毒(rAd-Hpa)的MCF-7乳腺癌细胞(MCF-7／rAd-Hpa)和转染HLA-A2．1的HepG2／HLA-A2．1细胞亦重新产生明显的杀伤效应，对自体淋巴细胞和mDC亦无明显杀伤效应(表1)。ELISPOT技术检测肝素酶抗原表位能有效促进肝素酶特异性效应细胞分泌IFN-γ。[结论]1、采用超基序和量化基序法并通过体外杀伤实验从肝素酶的全长氨基酸序列中筛选出了3条HLA-A2．1限制的CTL表位，即Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)，以上肝素酶抗原表位与德国学者的报道不同。2、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可以诱导产生肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且HLA-A2．1相匹配的肿瘤细胞具有很强的免疫杀伤活性，对肝素酶阴性或HLA-A2．1阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶或HLA-A2．1的肿瘤细胞具有杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受HLA-A2．1限制，肝素酶特异性CTL主要来源于CD8阳性T淋巴细胞。3、从体外及动物实验二方面证实肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和／或DC无明显的免疫杀伤活性，提示肝素酶多肽疫苗临床应用的安全性。4、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)负载的DC可以促进效应细胞IFN-γ释放。以上研究表明，人肝素酶特异性抗原表位[Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)]不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应，而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环，这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点，为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。
谢建兴[7]2007年在《HL-60/VCR和HL-60细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究》文中认为目的:本实验研究探讨人急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia ,AML )多药耐药(multidrug resistance, MDR)HL-60/VCR细胞和敏感HL-60细胞来源的树突状细胞介导的抗白血病效应。方法:选用急性髓系白血病P-170糖蛋白( permeability-glycoprotein, P-gp, P-170)高表达的多药耐药HL-60/VCR细胞、敏感HL-60细胞在含细胞因子GM -CSF (100ng /ml)、IL -4 (100ng /ml)和TNF-α(100ng /ml)的RPM I 1640完全培养液中诱导分化成树突状细胞(Dendritic cell ,DC ),以倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型, M TT法测定经DC激活的CTL对白血病细胞的杀伤效应。结果: HL-60/VCR细胞和HL-60细胞经诱导培养后均出现典型的树突状形态特征,流式细胞仪检测细胞表面CDla, CD83表达率均较培养前明显增高(P<0.01),两种DC激活的CTL均可介导针对靶细胞HL-60/VCR和HL-60的细胞毒作用;在效靶比为20:1时,HL-60/VCR-DC及HL-60-DC激活的CTL对P-gp高表达的MDR HL -60 /VCR细胞的杀伤率分别为(47.38±5.00)%和(34.29±1.35)%,差异有统计学意义( P < 0. 01)。结论: P-gp高表达的MDR白血病细胞HL-60/VCR和敏感HL-60细胞经细胞因子联合培养体系(GM -CSF、IL -4和TN F-α)培养后,可诱导分化为成熟DC,且DC均保留了其原始肿瘤细胞的特异性肿瘤抗原,并能诱导CTL产生特异的抗白血病效应;特别是HL-60/VCR-DC激发的T细胞对P-gp高表达的MDR细胞株HL-60/VCR具有更强的杀伤活性,进一步证实P-gp靶点作为免疫治疗的广泛性。这为MDR恶性肿瘤免疫治疗奠定了基础。
孔德晓[8]2005年在《白血病的免疫调节及多药耐药逆转的初步研究》文中指出白血病是起源于血液系统的恶性肿瘤,属造血干细胞的恶性克隆性疾病。免疫学研究表明白血病的发生发展与机体免疫之间存在密切的关系,通过免疫治疗可彻底清除残留的白血病细胞,达到根治目的。 免疫反应的产生首先是由抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APC)捕获抗原,并由其加工、处理后将抗原信息递呈给T、B淋巴细胞,从而诱发一系列特异性免疫应答。因此,抗原递呈细胞效应的发挥是机体免疫反应的首要环节。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前所知的功能最强的,也是唯一能激活初始性T细胞的专职抗原递呈细胞,是机体免疫反应的始动者,在免疫应答的诱导中具有独特的地位。研究表明只有功能成熟的DC才能有效地发挥递呈抗原,激活机体免疫系统的作用。大量实验证实,联合应用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4能将白血病细胞诱导成为DC,但这些白血病源性DC一般存在功能缺陷,因此寻找高效低毒的药物促进白血病源性DC的成熟,在研究DC介导的抗白血病效应中具有重要意义。 白血病多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生是其难治和复发的主要原因,若能将耐药白血病细胞诱导成DC(我们称之为耐药白血病源性DC),然后应用高效低毒的药物促进其成熟,则可将此DC细胞自身携带的白血病特异性抗原递呈给机体的免疫系统,来杀伤白血病细胞,同时可间接起到逆转白血病多药耐药的作用。临床上HHT、rhIFNα-2b治疗慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)取得了较好的疗效,新近发现rhIFNα-2b、HHT能促进慢性粒细胞白血病源性DC的成熟。然而,rhIFNα-2b、HHT或两者合用能否促进耐药白血病源性DC的成熟,尚未见文献报道。 研究表明,含有CpG基序的寡核苷酸(CpG oligonucleotide,CpGODN)在体外可以通过上调MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和共刺激分子CD80和CD86的表达,刺激
訾富明[9]2008年在《抗原冲击树突状细胞介导CTL特异性抗白血病作用的体外研究》文中研究表明目的:研究白血病患者骨髓来源的单个核细胞体外诱导为树突状细胞的有效方法;观察不同途径来源的白血病抗原冲击树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性的抗白血病效应,为急性髓性白血病免疫治疗提供理论依据。方法:10例急性髓性白血病患者骨髓经淋巴细胞分离液分离单个核细胞,予重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、钙离子载体A23187联合培养6天诱导分化为树突状细胞;分别用弱酸洗脱法提取单个核细胞MHC-I类抗原肽以及用0.4%KCl低渗法提取的白血病抗原,冲击树突状细胞,形成负载抗原的AML-DC;抗原与树突状细胞共培养6天后与正常人外周血分离的、经IL-2培养的T细胞共同培养,生成特异的细胞毒性T淋巴细胞;采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)比较不同方法产生的CTL细胞对急性髓性白血病细胞的杀伤活性。用倒置显微镜观察AML-DC诱导前后形态学变化,用流式细胞仪检测急性髓性白血病细胞诱导前后CD_(1α)、CD_(83)表型变化以及刺激T细胞后其CD_(152)的表达。结果:白血病患者骨髓来源的单个核细胞经过100ng/ml GM-CSF、500ng/ml钙离子载体A23187成功诱导为树突状细胞,倒置显微镜下观察具有典型的树突状细胞形态;其CD_(1α)、CD_(83)表达诱导前分别为1.16±0.15%、7.28±0.21%,CD_(83)诱导后48h最高,达59.69±2.56%,较诱导前差别有统计学意义,以后逐渐降低,CD_(1α)则在96h达最高,较诱导前明显升高,有统计学意义;弱酸洗脱法获得的抗原肽冲击树突状细胞致敏T细胞后杀伤白血病细胞的能力最高,为76.65±12.62%,未负载抗原的树突状细胞致敏T细胞后杀伤白血病细胞的能力为29.63±5.49%,两者存在显着性差异(P<0.01),空白对照组最低,为10.27±2.84%。结论:急性髓性白血病患者来源的骨髓单个核细胞经GM-CSF、钙离子载体A23187能够成功诱导为树突状细胞;弱酸洗脱法获得的抗原肽冲击树突状细胞致敏T细胞能够获得更强的杀伤白血病细胞的能力。
王辉[10]2014年在《rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究》文中进行了进一步梳理树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是体内已知功能最强的抗原递呈细胞(antigenpresenting cell,APC)，在体内外唯一能直接激活初始型T细胞（na ve T cell），进行加工、处理和递呈到组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子上，并激活细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL），在抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。而肿瘤患者体内DCs存在数量和功能上的缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应，使机体无法对肿瘤抗原产生再次免疫应答。原发性肝癌（因主要是肝细胞肝癌，故称为hepatocellular carcinoma，HCC，简称“肝癌”）一种高度恶性的肿瘤，我国是肝癌高发的国家，每年的发生率占全世界的54%。肝癌的评价生存期一般不超过6个月，对放、化疗均不敏感，故现行治疗肝癌的方法主要还是以手术等局部治疗为主的综合治疗，尽管如此，目前我国肝癌患者总体的五年生存率仅在10％左右，中晚期肝癌的五年生存率更低。近年来，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤研究的新热点，其中以DCs为基础的肿瘤疫苗（简称DC瘤苗）在实验性肝癌免疫治疗中取得了良好效果。目前，国内外学者大多采用肿瘤细胞冻融裂解物、AFP多肽等负载DCs治疗肝癌，也都取得了一定的疗效，但因负载物单一、免疫原性低，其产生的免疫反应较低，疗效也有限，因此，探索新的负载物，构建新的高效DC瘤苗对肝癌的临床治疗有着重要的意义。HBV感染与HCC的发生密切相关，进一步的研究表明HBV X基因的编码蛋白HBx蛋白（HBxAg）在HCC的发生过程中起着重要的作用。HBxAg在肝癌组织中的阳性表达率达70%－80%,因此HBxAg可作为理想的抗原识别靶点，将HBxAg作为抗原负载DC，制备DC疫苗将可能成为肝癌生物免疫治疗的一个新的思路。热休克蛋白70（HSP70）家族是一类重要的应激蛋白，在肿瘤勉一中发挥免疫佐剂的功能，通过分子载体的作用将抗原肽呈递至APC表面，激活CD8+T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的，HSP70对开发肿瘤疫苗也有重要的意义。本研究采用以HBV病毒抗原多肽HBxAg作为靶抗原，利用rhHSP70结合多肽的生物学活性，体外制备rhHSP70-HBxAg复合物增强多肽的稳定性与抗原性，采用人体专职性抗原递呈细胞DCs作为rhHSP70-HBxAg复合物的承载体，增加疫苗的免疫原性，制备rhHSP70-HBxAg-DC活细胞瘤苗，并进一步研究该瘤苗对HBxAg表达阳性的肝癌细胞的杀伤效能。第一部分构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能目的：构建rhHSP70-HbxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能。方法：（1）采集HLA-A2+健康献血员外周血，经Ficoll分离获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），其中贴壁细胞经体外诱导产生DCs，每日观察DCs形态变化；（2）DCs生长第7日开始负载不同浓度的rhHSP70、HBxAg及rhHSP70-HBxAg复合物，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表达，ELISA检测细胞培养上清中IL-12的分泌，寻找出最适抗原负载浓度；（3）未贴壁细胞经尼龙毛柱分离获得T淋巴细胞，以最适抗原浓度体外构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并将T淋巴细胞与rhHSP70-HBxAg-DC共培养诱导效应细胞及特异性CTL细胞，CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。结果：（1）随着培养时间的延长，DCs出现拉长，呈细树枝状典型形态；（2）不同浓度的rhHSP70及HBxAg负载DCs后流式细胞仪检测DC表型的表达及ELISA检测IL-12的分泌显示两种抗原的最适浓度分别为rhHSP70:20μg/ml，HbxAg:5μg/ml；（3）负载抗原的DCs，高表达CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR，细胞因子IL-12的分泌也显着增加，其中rhHSP70-HBxAg组最高；（4）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可明显刺激T淋巴细胞的增殖。结论：外周血来源的DCs负载rhHSP70和（或）HBxAg后，可分化为成熟DCs，促进T淋巴细胞的增殖。第二部分rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究目的：研究rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能。方法：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导T淋巴细胞产生CTL细胞，体外杀伤靶细胞，LDH释放试验检测CTL细胞对不同处理组靶细胞的杀伤效能；（2）用转染了HBx基因的HepG2（HBx-HepG2）建立小鼠皮下移植瘤模型，将30只小鼠随机分为rhHSP70-HBxAg-DC组、未负载抗原的DC组、PBS组，每3日测量瘤体体积，比较各组对裸鼠移植瘤生长的抑制作用；（3）治疗后第28d处死小鼠，分离瘤体，行免疫组化检测瘤体HBx蛋白、AFP以及Bcl-2、PCNA、Fas、Bax、Caspase的表达。结果：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导的CTL细胞能有效杀伤HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞，其中对HBx-HepG2细胞的杀伤最明显，而对NK细胞敏感的K562细胞及正常肝细胞L02无明显杀伤作用，同时对被抗MHC-Ⅰ类复合物抗体处理过的HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞杀伤效能明显下降；（2）rhHSP70-HBxAg-DC组和对照组的移植瘤生长受到明显抑制，其中rhHSP70-HBxAg-DC组最明显；（3）免疫组化结果显示瘤体组织中有HBx蛋白、AFP的表达；Bcl-2、PCNA的表达较对照组下调，而凋亡相关基因Fas、Bax和Caspase较对照组表达上调。结论：rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可诱导产生特异性抗HBV相关肝癌细胞效应，有一定的临床应用前景。
参考文献：
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[10]. rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究[D]. 王辉. 苏州大学. 2014
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