缪嘉航（安徽中烟芜湖卷烟厂 安徽芜湖241000）
【摘要】通过PCR 的方式从拟南芥中扩增得到ICEI 目的基因，将ICEI 基因连接到pMD18T 载体中，再采用双酶切的技术将AtICEI 基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301 上构建pLC2015 植物表达载体，利用农杆菌介导的方式将Plc2015 载体转入烟草中，经过PCR 和抗寒性实验检测，结果表明ICEI 基因已成功转入烟草中，并具备一定的抗寒性。
【关键词】抗寒性；ICEI；转基因烟草【中图分类号】 Q812 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-9753（2016）3-0239-02Abstract: Amplify from arabidopsis thaliana by means of PCR to get the target gene of ICEI, connect the ICEI gene to the carrierof pMD18T, use the double enzyme digestion technology to connect AtICEI gene to the plant expression vector of pCAMBIA1301 inorder to build the plant expression vector of pLC2015, and transform the carrier of pLC2015 into tobacco by way of agrobacteriummediatedtransformation. After the detection of PCR and cold resistance experiment, the result shows that ICEI genes have beensuccessfully transferred into tobacco and are of certain cold resistance.Key words: cold resistance; ICEI; transgenic tobacco
温度能够对植物的生长、发育、繁殖产生强烈的影响。低温可能会使植物无法存活而拥有抗寒性的植物则能在低温环境中正常的存活。每年都有大量因低温死亡的农作物，对全球的经济造成了巨大的损失。植物冷驯化是指长期处于低温环境中的植物会发生一系列特异性的突变来顺应环境，增强植物的抗冻能力。目前，植物冷驯化的分子调控机制方面的研究已经取得了丰富的成果。转录因子CBF/DREB1（C repeat binding factor/dehydration responsive elementbinding protein）会在低温环境中加快表达速度，促进下游大部分基因的表达，在植物冷驯化过程中发挥着关键作用。ICE1（inducer ofCBF expression 1）是转录因子CBF 的上游转录调节因子，能够和CBF 中MYC 顺式作用元件相互结合激活CBF3 基因，进而激活大量的下游基因表达。
本研究采用农杆菌介导将拟南芥的ICE1 基因转入到烟草中，期望在不影响烟草正常生长、发育的基础上，增强烟草的抵御低温的能力，并利用转基因技术培育具有抗寒能力的烟草打下坚实的基础。
1 材料和方法1.1 材料将拟南芥（Arabidopsis Columbia ecotype）的种子洗净，浸泡于75% 的乙醇中消毒5min，再用无菌水冲洗5 次，接种于1/2MS 分化培养基中培养，设置温度为25℃，光照强度为4000lx，光照12放置于组培室培养。将烟草（Nicotiana tobacum）种子取出，浸泡于75% 乙醇中消毒5 分钟，在置于0.1% 的升汞中消毒15min，灭菌水淋洗5 次，接种于1/2MS 分化培养基中，设置温度为25℃，光照强度为4000lx，光照12 放置于组培室培养。
1.2 方法1.2.1 获取AtICE1 基因从出苗10d 左右的拟南芥叶片中提取总RNA，并作为模板， 以Olig（dT）18 为引物进行反转录，然后取适量反转录获得的cDNA 为模板以ICE1f：5 ′ - C C A T G G T C A C G T G G A T C A T A C C A G C A T A C -C C T G C T - 3 ′ ( N c o I 酶切位点) 和I C E 1 r :5 ′ -CCATGGGTCTTGACGGAAACAATGGT-3 ′ (AcvI 酶切位点) 为正反引物，使用TaqDNA 聚合酶进行PCR 反应，对PCR得到产物进行回收，经过纯化之后与pMD18 载体连接，然后进行测序。
1.2.2AtICE1 基因植物表达载体的构建对测序结果正确的pMD-AtICE1 重组质粒以及购买的pCAMBIA1301 植物表达载体进行双酶切，两种酶分别为NcoI和AcvI， 对酶切产物进行回收纯化， 将AtICE1 基因连接到pCAMBIA1301 载体上， 扩增质粒， 提取、经酶切鉴定、测序确定。即成功构建35S 启动子AtICEI 表达载体，并将其命名为pYC2015。
1.2.3 重组载体的转入烟草将含有Py2015 和pCAMBIA 两种载体采用点击法转入根癌农杆菌GV3101 中。取1cm2 烟草叶片与农杆菌充分混合10min，然后将侵染之后的烟草叶片接种于共培养培养基中，黑暗培养至能够肉眼观察到明显菌落时用灭菌水洗涤3-5 次，然后接种于分化培养基中（MS+0.5mg/L6-BA+25mg/LHyg+300mg/LCar）， 设定培养条件为25℃，光照24h，两周换一次培养基，等到幼苗生长到2.0cm时，切下不定芽接种于生根培养基（MS 固体培养基+Kna100mg/L+Cef500mg/L）中，设定条件为25℃、光照12h，之后再将幼苗进行炼苗，然后转入栽培钵中继续培养，收集T1 代种子。
1.2.4 转AtICEI 基因烟草分子鉴定采用PCR 的方式进行鉴定。提取转基因烟草的总DNA，然后以DS-ICE(5′ -CAGTTGTCCCCAAGATCAGCAA-3′ ) 为上游引物，DA-ICE(5 ′ -GGATCATACCAGCATAC-CCTGC-3 ′ )为下游引物进行PCR 扩增反应，将得到的PCR 产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2.5 转基因烟草的抗寒性检测将收集得到的T1 代种子室温种植，以转入PCAMBIA1301 载体的烟草作为对照，将两组幼苗置于2℃、1℃、0℃、-1℃环境中生长一段时间，然后再置于25℃环境中继续培养，观察培养结果。
2 结果与分析2.1 转抗寒基因AtICEI 烟草的获取本实验提取拟南芥叶片中的总RNA，通过RT-PCR 的方法克隆得到了ICEI 基因，经1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析，该片段大小在1500bp 左右。采用双酶切体系切除pCAMBIA1301 载体上GUS片段，将获得的AtICEI 基因连接到载体上，成功构建了AtICEI 植物表达载体pYC2015。再将获得的表达载体通过根癌农杆菌导入烟草叶片中，之后进行PCR 鉴定，结果表明在转基因烟草中扩增出了500bp 左右的基因片段，而在对照组中则没有出现扩增片段。将两组烟草的T1 种子进行种植，结果在幼苗中检测到了目的片段，而对照组中则没有检测到，表明AtICEI 基因已经成功转入烟草，并能够稳定遗传（图1）。
2.2 转基因烟草的抗寒性检测T1 代转基因烟草植株的抗寒性结果显示，对照组的植株存活率仅为16.7%（9/54），大多数的植株茎叶都受到不同程度的损伤，存活的植株也表现出生长萎靡的现象；转基因烟草植株均为70%（38/54）左右，而且存活的植株在一段时间之后逐渐恢复正常生长，表明AtICEI 基因已经成功转入烟草中。
3 讨论低温冻害是造成植物生长缓慢、农作物产量减少的重要原因，增强农作物的抗低温能力已经成为目前研究的重点问题。研究表明，温带植物经过低温之后能够显著提升其抗旱能力，在这个过程中，转录激活因子CBF 发挥着重要作用。植物的耐寒性实际上是由多个转录因子调控的，而且环境因素的改变也能造成植物抗寒性发生变化。大部分的植物基因组都含有抗寒能力的基因以及CBF 信号通路，但是在一般环境中表达量并不高。
转CBF 基因的植物在生长发育方面会受到影响，但是选择ICEI 基因作为目的基因转入植物则能够避免这一问题。ICEI 是CBF 信号通路中的调节因子，能够在低温环境中诱导拟南芥中CBF3 基因表达。ICEI 基因大量表达不仅不会对拟南芥的生长发育产生抑制，而且还能进一步提升拟南芥的抗寒性。
本研究从拟南芥中克隆的得到ICEI 基因，并成功构建了pLC2015 植物表达载体，利用根癌农杆菌介导的方式将植物表达载体转入烟草，通过PCR 的方法对转基因烟草进行检测，结果表明54 株转基因烟草为阳性克隆植株。转基因烟草抗寒性检测结果显示，成功转入ICEI 基因的烟草有明显的抗寒性，同时证明了ICEI 基因在烟草中成功表达。转入ICEI 基因提高烟草的抗寒性有明显的优势：首先，ICEI 基因不会对烟草的生长造成影响；其次通过ICEI基因调控CBF 通路，能够激活大量与生长代谢相关的基因表达，进而促进烟草的生长以及提高烟草的抗寒性。
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论文作者:缪嘉航
论文发表刊物:《中国医学人文》2016年第3期
论文发表时间:2016/6/1
标签：基因论文; 烟草论文; 拟南芥论文; 载体论文; 植物论文; 转基因论文; 转录论文; 《中国医学人文》2016年第3期论文;