九江市第一人民医院病理科 江西九江 332000
摘要：目的：研究尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I（AAVC-I）对人肝癌BEL7402细胞增殖作用的影响。方法：采用MTT法检测不同浓度的AAVC-I对BEL7402细胞的24h抑制率；用免疫组化的方法，检测bcl-2蛋白表达的变化。结果：MTT显示，BEL7402细胞增殖能被AAVC-I抑制，呈时间和剂量依赖性；免疫组化显示，随药物浓度增加，平均光密度值呈递减趋势，表明bcl-2蛋白表达相应下调。结论：尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I对人肺癌BEL7402细胞具有抑制作用，并诱导其凋亡，可能与bcl-2表达下调有关。
关键词：AAVC-I；BEL7402；细胞凋亡；bcl-2
[Abstract] Objective：To research the inhibitory and apoptosis effect of anti-tumor component I（AAVC-I）from Agkistrodon acutus venom on human liver cancer BEL7402 cells.Methods：The inhibition rate after 24h with different concentrations of AAVC-I on BEL7402 was detected by MTT method.The expression change of bcl-2 protein after AAVC-I treatment was detected by immunohistochemical staining method.Results：MTT showed that AAVC-I could inhibit the proliferation of BEL7402 in a time- and dose-dependent manner.The form of apoptosis in BEL7402 could be observed by ordinary microscope and fluorescent staining when treated with AAVC-I for 24h.Immunohistochemical staining showed that the mean light density have a trend of decrease in dose dependency，which indicate the expression of bcl-2 decrease accordingly.Conclusion：AAVC-I had a inhibitory effect on BEL7402 cell proliferation，apoptosis promoting effect as well，which maybe related to the decrease of bcl-2 expression.
[key words] AAVC-I；BEL7402；Apoptosis；bcl-2
蛇毒作为自然界丰富的药用资源，拥有广泛的药用前景，已经越来越受到人们重视 [1]。蛇毒成分复杂，使用具有一定的危险性，因此提取出低毒高效的组分是现阶段的研究重点。本实验室采用的是从尖吻蝮蛇毒中提取出的活性成分[2]（AAVC-I），以及人肝癌细胞BEL7402为例，研究AAVC-I对BEL7402的影响，为高效低毒的抗肿瘤药物的开发提供有利依据。
1材料和方法
1.1 主要试剂 AAVC-I（皖南医学院蛇毒研究所惠赠）；RPMI-1640培养基、PBS缓冲液（赛默飞世生物化学制品公司）；胎牛血清（杭州四季青）；0.25%胰酶+0.02EDTA（上海吉诺生物科技有限公司）；MTT、DMSO（Sigma）；青霉素-链霉素溶液（碧云天公司）；鼠抗人bcl-2单克隆抗体、免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）
1.2 MTT检测药物抑制率 取对数生长期BEL7402细胞，以 1×104/ml密度接种于96孔板中，每孔100μl，加入终浓度为1.25、2.5、5、10、20μg/ml的AAVC-I（用完全培养液配制），对照组加等量培养液，每组6个复孔。继续培养24h，去上清液，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，孵育4h，去上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，充分溶解后，置于酶标仪570nm处检测吸光度（A值）。抑制率=（1— 实验组A值/对照组A值）×100%
1.3 免疫组化法检测bcl-2表达 制细胞爬片，依次加入各浓度药物，对照组加等量培养液继续培养24h，去上清液，PBS洗3次，加固定液室温固定30-60min，PBS洗3次，加血清，室温封闭15min，不洗，加入鼠抗人bcl-2单克隆抗体（阴性对照组加PBS），37℃孵育1h，PBS洗3次，再加羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，水洗，分化，梯度酒精脱水，烘干，封片，拍照。计算各组平均光密度值。
1.4 统计学处理 以SPSS13.0分析，数据以x±s表示，组间差异用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，以P＜0.05认为有统计学意义。
2结果
2.1 AAVC-I对BEL7402抑制率 MTT结果显示（表1），随着AAVC-I浓度增加，对BEL7402的抑制作用逐渐增加（P小于0.05），显示AAVC-I对BEL7402的抑制呈时间剂量依赖性。
表1 AAVC-I对BEL740增殖抑制的作用（n=12，x±s）
#：与对照组比P＜0.05
3.讨论
迄今为止，恶性肿瘤仍是严重威胁人类健康的疾病之一，逐年上升的发病率及病死率已经令全世界人感到恐慌，即是谈癌色变！肝癌是我国常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位，仅次于肺癌[3]。有报道认为，白眉蝮蛇去整合素rAdinbitor通过竞争性地结合细胞表面的整合蛋白受体，阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，从而发挥抗肿瘤转移的作用。rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制BEL7402细胞在FN上的黏附，并促使已黏附的BEL7402细胞脱落，剂量依赖性抑制细胞增殖并诱导其凋亡。
细胞凋亡是生物体内普遍存在的现象，也是一种重要的生物学过程。在细胞凋亡过程中，bcl-2家族成员起着至关重要的作用[4]，bcl-2家族可以分为两大类，一类是抗凋亡的，另一类是促细胞死亡的，主要是bax、bak、bid等。bcl-2是细胞死亡的负调因子，在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽的外泄，降低胞内由线粒体巯基组成的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡的。本实验可发现，经AAVC-I处理后的BEL7402，bcl-2表达随药物浓度提高而减少，提示bcl-2的抗凋亡作用在诱导凋亡方面具有重要意义。关于其他机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 雷丹青，李映新，周先果．尖吻蝮蛇毒小分子多肽对人卵巢癌 A2780细胞增殖和黏附的影响［J］． 中国药理学通报，2007，23（11）：1514－1518．
[2] 张根葆，张毅，孔岩，等.五步蛇毒蛋白 C 激活剂的纯化与活性分析［J］.蛇志，2008，20（4）：249－251．
[3] 张洪新，刘燕，王执民，等.阿霉素加热化疗对抗人肝癌耐药细胞多药耐药性的实验研究[J].肿瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.
[4] Nourse J，Firpo E，Flanagan WM，et al.Interleukin-2-mediated elimination of the p27Kip1 cyclin-dependent kinase inhibitor prevented by rapamycin.Nature，1994，372：570-573.
论文作者:徐平,王洁,汤恒毅,李斌
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第29期
论文发表时间:2018/11/27
标签：细胞论文; 抑制论文; 蝮蛇论文; 凋亡论文; 蛇毒论文; 浓度论文; 肝癌论文; 《中国误诊学杂志》2018年第29期论文;