北京市第161中学
【摘 要】目的：考察几种酶制剂对山药病原线虫的防治效果。方法：以药剂处理10h内线虫死亡率为参考指标，优化酶制剂的种类、配比及浓度条件，采用冷冻显微技术探索其杀虫机理，并通过田间实验验证其杀虫效果。结果：单一酶和复合酶均有杀线虫效果，复合酶效果优于单一酶，以蛋白酶：纤维素酶4：1、浓度1%为佳，田间施用量为5kg/亩时，虫口基数减少82.3%。冷冻电子显微镜观测显示，复合酶制剂可破坏线虫体腔结构，导致线虫死亡。结论：本文开发的新型复合酶制剂表现出良好的山药线虫病防治效果。
【关键词】山药线虫；复合酶；防治；机理
山药（Dioscorea opposita Thunb.）是薯蓣科多年生藤本植物，地下部分具有调节免疫、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节脾胃等多种功效，是我国传统补益中药和保健菜肴。山药在我国栽培范围广，但山药线虫病发生频率大，山药线虫病田间发病率一般为30%-80%，重者达到100%，可导致山药减产20%-50%，甚至绝收。随着山药种植面积的扩大，山药线虫病的发生呈上升趋势，线虫病已成为山药种植的主要病害，制约着山药产业的发展[1]。长期以来，山药线虫防治以化学防治为主，但农药残留、环境污染等问题严重，并使线虫抗药性增强，药剂用量不断加大。本研究自主研发出一种新型复合酶药剂，于2016年11月至2017年10月在室内和大田进行的多次试验中表现出良好的杀线虫效果，应用冷冻显微技术初步探究了其杀线虫机理，对安全、高效、稳定、获取成本低廉的杀线虫剂的研发具有重要意义[2]。
一、仪器与材料
试剂：蛋白酶由枯草芽孢杆菌发酵而成，固体粉状，酶活力为5万u，纤维素酶为灰白色固体粉末状，酶活力为2.1万u，两者均由湖北如天生物工程有限公司提供，几丁质酶由中国林科院提供，固体粉末，酶活力为200个u。
仪器：CT14RD高速离心机、Thermo 超低温冰箱、Gatan 626 型冷冻转移装置、JEM-2010 型透射电子显微镜等。
材料：河南省温县山药种植区土壤中分离所得线虫。
二、实验方法
2.1 酶制剂处理条件优化：
试验用线虫均从山药种植土壤中分离得到，以药剂处理10h内线虫死亡率为参考指标，优化酶制剂的种类和配比及浓度条件。
2.1.1 抑制线虫特异酶的筛选
试验设置不同酶处理，分别为A：木瓜蛋白酶，B：纤维素酶[3，4]，C：几丁质酶，D：木瓜蛋白酶和纤维素酶，E：木瓜蛋白酶和几丁质酶，F：纤维素酶和几丁质酶，G：木瓜蛋白酶和纤维素酶以及H清水处理组，酶溶液浓度为1%，复合酶组各酶等比例混合，清水为对照，分别加入培养皿中，每个培养皿中线虫数为100条，分别观察记录5h和10h后线虫数量变化。
2.1.2复合酶最佳配比试验
设置木瓜蛋白酶：碱性纤维素酶共5个配比条件- A：1：0，B：4：1，C：3：1，D：2：1，E：0：1，总浓度为1%，每处理3次重复，以清水作为对照，分别加入培养皿中，每培养皿中线虫数为100条，分别记录处理后2h、5h和10h时培养皿中线虫的存活状况，考察酶制剂最佳配比条件。
2.1.3复合酶最佳浓度试验
取2.1.2所得最佳配比复合酶，设置4个浓度水平：1‰、5‰、1%和5%。以清水作为对照，每处理3次重复，分别记录处理2h、5h和10h后培养皿中线虫存活状况，计算死亡率。校正死亡率=（处理死亡线虫数-清水线虫死亡数）/100 ×100%。
2.2扫描电镜观察线虫表皮状态
电镜扫描预处理如下：
1. 用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制0.2mol的磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
2. 取10ml25%的戊二醛和50ml磷酸缓冲液至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度配成戊二醛固定液。
3. 取2.1.3中清水组、D处理和E处理样品各5ml，过滤（四层医用纱布）至试管中，加5ml戊二醛固定液即可，电镜扫描由青岛科创质量检测有限公司完成。
取3μL4mg/mL酶制剂处理后线虫样品和健康线虫样品悬液分别滴在R2/1微筛碳膜铜网上，滤纸吸去多余液滴，立即将铜网投入经液氮冷却的液态乙烷中快速冷冻5min，Gatan 626 型冷冻转移装置将样品转移到 JEM-2010 型透射电子显微镜中，-173℃条件下，低剂量曝光模式（MDS）寻找样品并观察。照片记录在Kodak SO-163型低剂量底片上，拍摄的放大倍数为 50000 倍，加速电压为200kV，电子剂量为15e-/?2?s，欠焦量范围1.80~2.46μm. 底片在 20℃条件下用D-19 显影液显影12 min，定影20 min[5，6]。
2.3 田间药效实验
试验小区的划分：试验共分16个小区，小区面积为5m2，小区之间设置宽度为1m的保护行。
药剂处理：每处理4个重复，各处理试剂用量为A：1kg/亩，B：1.5kg/亩，C：2.5kg/亩，D：5kg/亩。以未加药剂土壤为对照。
田间操作：按上述处理将药剂均匀撒在对应的小区内，用旋耕机旋耕两遍，确保药剂与土壤充分接触混匀后，喷灌6小时。
药效检查：分离各实验小区0-20cm土层线虫，记录活线虫数。
三、实验结果
1.酶制剂处理条件优化：
酶筛选实验结果如表1，各处理之间差异显著。A和E处理不同时间后活线虫数差异不显著，C、D处理中2h和5h、5h和10h差异显著，但2h和10h未达到显著，B处理在不同时间内线虫死亡率差异均显著，由此复合酶最佳配比为B，即蛋白酶：纤维素酶比例为4：1。
3.2 扫描电镜观察结果
扫描电镜图片显示，清水处理组线虫体壁完整，条纹清晰，而木瓜蛋白酶与纤维素酶处理后线虫表皮出现细长较浅的伤口，线虫表皮受到轻微损伤，表皮覆盖层被破坏，较清水处理组更光滑；木瓜蛋白酶和几丁质酶处理后线虫表皮出现大而深的裂口，组织损坏严重，表皮呈薄的纸片状，上粘附少量未脱落表皮组织，而大部分外表层已被溶解。
进一步观察发现，健康的线虫表皮表面光滑平整，复合酶处理后其破坏严重，最外层的角质膜穿孔现象明显，体壁破坏甚至形成连片的大孔，深度直达线虫体壁的最内层体肌，线虫体壁下皮层基本被水解完全呈现中空，线虫最内层体肌被水解成纸片状（图1白色部分），随着线虫体壁结构的破坏，线虫体腔内溶物流出，线虫死亡[7]。
3.3 田间药效实验
由表3可知，A处理的虫口基数降低了19.3%，B处理虫口基数降低了43.4%，C处理虫口基数降低了60.5%，D处理降低了82.3%，各处理间差异显著，且从A到D，随着药剂用量的增加，线虫的致死率逐渐升高。
四、结论
目前，田间线虫病的防治以化学防治为主，药剂用量大，存在农药残留、环境污染等问题，且易导致线虫抗药性，生物防治途径亟待开发。冀宇等以复合微生物菌群和其发酵活体为有效成份作为功能性复合微生物菌剂，对黄瓜根结线虫病的防效达到50%[8]，李维蛟等将林副产物粗木醋液用以番茄根结线虫病防治，效果可达50.5%，对线虫2龄幼虫的抑制效果达到75%[9]，路文雅发现白僵菌的发酵液对黄瓜根结线虫有较好防治效果，但低剂量施用时效果不明显[10]，本试验创新性的将生物酶应用于线虫防治研究，在田间施用量5kg/亩即可使虫口基数减少82.3%，远高于文献报道。试验首次将冷冻电子显微镜技术应用于植物病原线虫的防控机理研究，明确了酶制剂防治线虫机理的研究方向，加快了研究进度，并为线虫其他方面的研究奠定基础。
参考文献：
[1]黄文华，封文雅. 山药线虫病的研究进展[J]. 绿色科技，2017，（03）：154-156+159.
[2]高倩圆，胡飞龙，祝红红，刘满强，李辉信，胡锋. 蓖麻提取物对南方根结线虫的防治作用[J]. 应用生态学报，2011，22（11）：3033-3038.
[3]程笑笑，冯自力，冯鸿杰，等. 真菌源几丁质酶在植物抗真菌病害中的应用[J]. 植物保护，2017，43（3）：29-35.
[4]吕兴萍，杨薇红，马春娇. 纤维素酶提取灵芝多糖的单因素研究[J]. 科技信息，2013，（03）：295+308.
[5]Ménard J，Nussberger J，Juillerat L，et al. Determinants of angiotensin II generation during converting enzyme inhibition[J]. Hypertension，1990，16（5）：564-572.
[6]Rubinstein J L. Crvo-EM captures the dvnamics of ion channel opening[J].Cell，2017，168（3）：341-343.
[7]姚娟妮，成玉林，韩青梅，等. 小麦与两种病原菌互作的冷冻切片观察效果[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2017，45（12）：90-94.
[8]冀宇，武云鹏，王胤，王晓青，刘杏忠，刘建斌，向梅春. 功能型复合微生物菌剂防治黄瓜根结线虫的研究[J]. 中国生物防治学报，2016，32（04）：493-502.
[9]路文雅，张丽，关美娟，董建臻. 10种白僵菌菌株发酵液对植物线虫和昆虫病原线虫的生物活性[J]. 河南农业科学，2016，45（02）：82-86.
[10]李维蛟. 紫茎泽兰醋液杀线虫活性部位高效液相色谱—质谱分析[J]. 云南农业大学学报：自然科学，2016，V31（S1）：72-78.
论文作者:单思博
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年3月第5期
论文发表时间:2018/8/1
标签：线虫论文; 山药论文; 蛋白酶论文; 药剂论文; 培养皿论文; 表皮论文; 田间论文; 《中国医学人文》(学术版)2018年3月第5期论文;