（金华职业技术学院医学院 浙江 金华 321007）
【摘要】目的：探讨CdCl2能否诱导WRL68细胞自噬。方法：采用形态学观察、透射电镜检测自噬小体、Westernblot检测 LC3B-I到LC3B-II转化。结果：WRL68细胞镉暴露后，形态学观察发现细胞形态良好，基本没有损伤；透射电镜观察到和对照组相比实验组细胞暴露8μM CdCl2 12h后出现了吞噬空泡，内质网肿胀，有脱颗粒现象，大量的次级溶酶体样结构也出现在细胞质中。用Western 蛋白印迹检测发现LC3B-II/I的表达增加。结论：低浓度镉能引起 WRL68细胞自噬。
【关键词】镉；WRL68；自噬
【中图分类号】R114 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）33-0181-03
镉（cadmium，Cd）作为一种普遍存在于环境中的有毒重金属，可以通过食物链或通过直接暴露的方式富集在人体中。发生在日本的“痛痛病”事件让人们深刻的意识到了镉污染对人身体健康造成的危害，而近年来发生的“镉大米”事件也引起了人们对镉污染的高度重视，镉污染正通过多种方式威胁着人类的健康， 所以人们非常关注镉污染的问题。镉是一种有潜在毒性的重金属，在进入人体后，首先在肝脏中与金属硫蛋白结合形成镉-硫蛋白，再经过血液输送到肾脏随尿液缓慢地排出。镉在肝脏中蓄积，可引起肝细胞凋亡、坏死，并进一步诱发肿瘤[1,2]。
细胞自噬普遍存在于真核细胞中，几乎所有的细胞都存在自噬现象[3]，是一种自我保护机制。细胞自噬是细胞将自身的一些细胞器和蛋白质包裹在特定的膜结构中被溶酶体降解，期间产生的能量和小分子可供细胞再次利用，从而维持细胞的内稳态。此外，自噬还可以通过降解一些毒性成分从而保护机体避免损伤，使其更好地适应环境。因此本研究旨在初步探讨低浓度镉（＜10μM）能否诱导肝细胞发生自噬。为进一步揭示镉毒性机制提供一定的理论依据。
1.材料与方法
1.1 细胞
WRL68 细胞来自本实验室保存。
1.2 试剂和仪器
流式细胞仪（BD公司）；CO2细胞培养箱（Heraeus公司）；倒置相差显微镜（Nikon公司）；DMSO（Amresco公司）；高糖DMEM（GIBCO公司）；CdCl2（Sigma公司）；LC3B兔抗人多克隆抗体（proteintech公司）；IgG-HRP羊抗兔多克隆抗体、β-actin（Bioworld公司）；胎牛、小牛血清（杭州四季青公司）
1.3 细胞形态观察
细胞接种于细胞培养板中，分为对照组和实验组，实验组加不同剂量CdCl2（4、8、10μm）处理12h，用尼康倒置相差显微镜观察细胞形态，并拍照记录。
1.4 透射电镜观察细胞超微结构
氯化镉处理细胞后，常规方法收集细胞，5%的戊二醛将样品固定。然后再将戊二醛吸出，让样品和琼脂融合形成琼脂块转移到小瓶中，PBS冲洗。锇酸固定后，梯度丙酮脱水，将样品用环氧树脂浸透、包埋和聚合做成半薄切片，染色并光学显微镜定位。之后用醋酸铀、柠檬酸铅将超薄切片进行染色。透射电镜下观察、拍照。
1.5 免疫印记（Western blot）检测自噬相关蛋白的表达
将WRL68细胞随机分成对照组和不同浓度（2、4、8、10μM）CdCl2暴露12h和8μm CdCl2暴露不同的时间实验组。将预冷细胞裂解液加到收集细胞中，超声后煮样，离心2min，-70℃保存；在90V下将50μg总蛋白进行SDS-PAGE（12%）电泳2h；再在24V条件下转印蛋白至PVDF膜上；然后用PBST封闭2h，洗膜；敷上一抗后置于4℃ 孵育过夜，再敷上二抗置于4℃孵育6h，曝光。
1.6 数据处理
用（x-±s）来表示各组实验数据；用Image J软件和 Sigmaplot做图；one-way?analysis?of?variance（ANOVA）对实验数据进行显著性分析。
2.结果与分析
2.1 细胞形态学观察
如图1所示，细胞暴露CdCl2（4、8、10μm）12h后，实验组细胞形态正常，细胞与细胞间膜界限较清晰，基本没有损伤，仅少许细胞有变圆迹象。
图1 WRL68细胞加Cd 12h后显微观察结果
2.2 透射电镜观察细胞超微结构
如图2所示，对照组形态基本完好，细胞核在细胞中央，为椭圆形，细胞器机构正常，如内质网等结构，核膜完整光滑，而在实验组细胞暴露8μm CdCl2 12h后出现了吞噬空泡，内质网肿胀，有脱颗粒现象，大量的次级溶酶体样结构也出现在细胞质中。从形态学角度表明了镉可能诱导了WRL68细胞产生自噬。
图2 透射电镜观察细胞超微结构
2.3 Western blot 检测自噬蛋白 LC3B-II/I 表达
由图 3-A/C所示，细胞暴露CdCl2不同浓度（0.5、2、4、8、10μm）12h后，自噬蛋白 LC3B-II/I表达逐渐增加；而WRL68 细胞暴露8μm镉不同时间后（4、8、12、18、24h），自噬蛋白LC3B-II/I的表达均上升。提示镉诱导了WRL68细胞的自噬，如图 3-B/D。
图3 Western blot 检测自噬蛋白LC3B-II/I表达（n=3，mean±SEM；**P＜0.01 VS control，*P＜0.05 VS control）。
3.讨论
细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。当细胞受到自噬诱导因子诱导时，大量游离的双层膜结构会出现在胞浆中，形成的膜结构类似杯状。杯状分隔膜延伸后将被降解的胞浆成分以及可溶性蛋白包裹起来形成自噬小体[4]。自噬体的外膜与溶酶体膜结构融合，二者内容物合二为一，形成自噬-溶酶体，消化降解自噬体内容物，产物被运输至细胞浆中，供细胞重复再利用。
肝脏是镉进入体后最先积累和产生毒性的主要部位，可以导致一系列损伤。因此本研究对象是人肝细胞。本研究运用细胞形态学观察、透射电子显微镜技术、Western蛋白印迹等方法，共同验证 CdCl2（≤10μmol?L-1）诱导人肝细胞自噬。本研究将肝细胞用低浓度镉处理后，发现细胞形态良好，基本没有损伤；通过透射电镜观察到相对于对照组而言，实验组形成了自噬溶酶体和大量自噬空泡，细胞核固缩，内质网也出现了肿胀。通过Western蛋白印迹检测发现实验组自噬标志蛋白LC3B-II/I的表达也增加了，这暗示低浓度镉引起了细胞自噬的发生。
此外，Cui Q等[5]以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，发现自噬对细胞凋亡有促进作用。而Chargui A等[6]发现低浓度镉诱导了PCT细胞自噬发生，而基本没有凋亡，此外还发现细胞自噬对凋亡起到了抑制作用，使细胞耐受力加强。那么，自噬对细胞有什么作用呢，保护？损害？自噬与凋亡之间存在什么关系呢？这仍然需要进一步研究。因此后续研究将着重探讨低浓度镉处理肝细胞后自噬对凋亡的作用。这对于进一步探究镉致癌机理以及某些疾病的预防和预测提供重要的理论依据。
【参考文献】
[1] Hartwig A. 2013. Cadmium and cancer. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. Springer, p491-507.
[2] Rani A, Kumar A, Lal A, Pant M. 2014. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International journal of environmental health research 24:378-399.
[3] Murrow L, Debnath J. 2013. Autophagy as a stress response and quality control mechanism—implications for cell injury and human disease. Annual review of pathology 8:105.
[4] Sharara-Chami R I, Zhou Y, Ebert S, et al. Epinephrine deficiency results in intact glucose counter-regulation, severe hepatic steatosis and possible defective autophagy in fasting mice [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2012, 44(6):905-913.
[5] Cui Q, Tashiro S, Onodera S, et al. Autophagy preceded apoptosis in oridonin-treated human breast cancer MCF-7 cells [J].Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(5):859.
[6] Chargui A, Zekri S, Jacquillet G, et al. Cadmium-induced autophagy in rat kidney: an early biomarker of subtoxic exposure [J]. Toxicological Sciences, 2011, 121(1):31-42.
论文作者:王文倩,潘晓明
论文发表刊物:《医药前沿》2018年33期
论文发表时间:2018/12/10
标签：细胞论文; 实验组论文; 蛋白论文; 溶酶体论文; 诱导论文; 形态学论文; 内质网论文; 《医药前沿》2018年33期论文;