袁旭[1]2001年在《叶绿体核糖体蛋白PSRP-1部分cDNA序列的克隆》文中提出在高等植物的叶绿体中，叶绿体核糖体合成了组成4种能量传递复合物的30种蛋白质、约20种核糖体蛋白及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶等含量丰富的蛋白质，在叶绿体的蛋白质代谢中具有重要地位。几种叶绿体特有的核糖体蛋白质(PSRP)被认为参与了叶绿体基因表达在翻译水平的调控。PSRP-1(S30／S22)是由核基因组编码的叶绿体核糖体特有的蛋白，组成叶绿体核糖体的30S小亚基。通过构建并筛选cDNA文库可以克隆编码PSRP-1的基因，从而进一步研究它在叶绿体核糖体组成、翻译起始及其在基因转录后调控中的功能。 利用CLONTECH公司的cDNA文库构建试剂盒(SMART~(TM) cDNA Library Construction Kit)构建了桂竹香、白菜型油菜、芥蓝、诸葛菜和羽衣甘蓝五种十字花科植物的cDNA文库。所构建的白菜型油菜cDNA文库滴度为1.02×10~6pfu／ml，重组率为82％；利用PCR方法扩增白菜型油菜cDNA文库的插入片段，其长度在500bp～1.5kb之间。桂竹香cDNA文库的滴度为5.72×10~5pfu／ml。在桂竹香平板上随机挑取了7个噬菌斑，分别用噬菌体感染E. coli BM25.8。将噬菌体DNA转变为质粒后，提取质粒，用SfiⅠ酶切检查插入片段，其中有4种质粒含有插入片段，长度在500bp～1.0kb之间。分别将五种植物的cDNA文库进行扩增，扩增后的cDNA文库保存在-70℃。 实验室保存的探针用地高辛系统标记后，进行原位杂交筛选cDNA文库。从桂竹香cDNA文库中经初筛得到12个阳性克隆。再经过第二次筛选，得到一个阳性克隆。将所得到的阳性克隆测序，发现其中的插入片段长506bp。利用BLASTn和BLASTp在GENEBANK数据库中寻找同源序列。该插入片段编码一段含有99个氨基酸残基的多肽，其核苷酸序列分别与菠菜Psrp-1基因的部分序列具有68％的一致性，与拟南芥中可能编码530蛋白的序列具有91%的一致性;由核普酸序列推导的蛋白质序列与菠菜PSRP一具有同源性。从桂竹香中克隆到的这一片段可能是编码桂竹香PSRP吸蛋白梭基端的部分cDNA序列。 利用地高辛标记的探针筛选白菜性油菜CDNA文库，没有得到与编码PSRP一1蛋白的cDNA序列具有同源性的克隆。
徐美玲[2]2011年在《参与拟南芥叶绿体蛋白周转的DEG蛋白酶（DEG2，DEG9）及核糖体蛋白PSRP-4的功能研究》文中指出叶绿体是真核生物光合作用的场所,光系统Ⅱ(PSⅡ)是定位于类囊体膜上的极为重要的色素蛋白复合物,它催化光驱动的水裂解并释放氧和质子。因此,PSⅡ对环境胁迫非常敏感,尤其反应中心的中D1蛋白质最易受环境的胁迫而破坏。被破坏的蛋白质随即被降解并由新合成的蛋白质替换。通过这种周转来保持胁迫条件下D1蛋白的稳定及PSⅡ的功能。已有研究表明,叶绿体内有200多种蛋白酶,然而这些蛋白酶中有哪些参与了D1蛋白的周转以及其作用的机制目前仍不清楚。其中,体外实验证明定位于叶绿体的类囊体膜上DEG2蛋白酶能够对光损伤D1蛋白的初步剪切。然而,在拟南芥deg2突变体中光损伤D1蛋白的降解未受影响。因此推测有其他蛋白酶的共同参与D1蛋白的剪切。通过序列比对,在DEG蛋白酶家族中Deg2与Deg9基因的同源性最高。因此本研究主要阐述这两个蛋白在D1周转过程中的协同作用机制。首先我们从SALK拟南芥突变体库中定购到Deg2和Deg9基因的T-DNA插入突变体,并通过杂交筛选到Deg2和Deg9基因缺失的。利用deg2deg9双突变体研究表明：在正常光照条件下,与对照野生型相比,deg2deg9双突变体Fv/Fm(PSⅡ最大光化学效率)没有明显区别,然而,在高光胁迫条件下,Fv/Fm在突变体中显着降低。同时,利用D1蛋白特异性抗体蛋白免疫印记实验证实,光损伤D1蛋白降解速度deg2deg9双突变体明显减慢,然而,其它的PSⅡ反应中心蛋白的水平在高光条件下则保持相对稳定。进一步利用双分子荧光互补技术(BIFC)证实了DEG2和DEG9两个蛋白酶在体内是相互作用的。从我们的研究结果可以推测DEG2和DEG9蛋白酶在PSⅡ反应中心D1蛋白的降解过程及保护其免受光抑制方面起到了特异性的作用。叶绿体蛋白由核基因和叶绿体基因共同编码完成,完整的叶绿体核糖体是由59个蛋白和23S、16S、5S/4.5S rRNA组成,尽管对核糖体蛋白结构和功能方面已经进行了大量研究,但是所涉及的核糖体蛋白,特别是细胞器核糖体蛋白仍比较少。叶绿体核糖体有6个质体特异蛋白(PSRP-1至6),其中PSRP-4为小的核糖体碱性蛋白,与大肠杆菌及光合细菌的核糖体均无同源性,可能在维持核糖体小亚基晶体结构方面有特殊作用。研究拟南芥中这些由核基因编码的特异蛋白以及它们的作用机制有助于我们进一步认识高等植物核糖体在叶绿体蛋白周转中的功能以及其可能的分子调控机理。在本研究中,我们采用RNAi技术构建了Psrp-4基因突变体。利用psrp-4突变体进行了初步研究,结果表明,在正常条件下和高光条件下,发现psrp-4突变体与野生型生长速度以及Fv/Fm无明显差异。蛋白免疫印记实验表明,D1蛋白周转也没有受到明显影响。
参考文献：
[1]. 叶绿体核糖体蛋白PSRP-1部分cDNA序列的克隆[D]. 袁旭. 四川大学. 2001
[2]. 参与拟南芥叶绿体蛋白周转的DEG蛋白酶（DEG2，DEG9）及核糖体蛋白PSRP-4的功能研究[D]. 徐美玲. 山东大学. 2011