三明市健康人群乙型肝炎病毒患者和丙型肝炎病论文_黄思晓

黄思晓 (福建省三明市第一医院检验科 福建三明 365000)

【摘要】 目的 了解三明市健康人群、乙型肝炎病毒(HBV)患者和丙型肝炎病毒(HCV)携带者输血传播病毒(TTV)的感染情况,探讨三明市人群所感染TTV的基因群别分布情况。方法 准备106名健康人群、64名HBV患者和36名HCV携带者的血浆。设计24对序列特异性引物,G1-G5群特异性巢式PCR,分别检测三组血浆中TTV的5 种基因群的DNA。结果 (1)使用群特异性PCR检测TTV,G4群TTV感染率最高,为52.0%,然后依次为G5:39.1%,G3: 32.7%,G1: 25.7%,G2: 8.4%。(2)TTV常常混合感染:检测出2种属于不同群TTV感染的实验标本为数不少(19.8%),有4份标本甚至检测出属于3种不同群TTV-DNA。HBV患者组,检测出2种属于不同群TTV的比率占56.3%,有5个实验对象和2个实验对象分别检测出3重(群)和4重(群) TTV感染。结论: 1-5群的TTV都可以在三个组别中被检测出,HBV组和HCV组各群TTV的感染率比健康人群组高。TTV易发生混合群感染,

【关键词】TTV HBV HCV  巢式PCR  基因序列

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2013)35-0047-01

目前TTV的检测方法主要依靠巢式PCR,因为TTV在血浆中滴度是很低的,巢式PCR可以提高其检测的特异性和灵敏度。但由于TTV的变异程度比较高,因此PCR检测时对引物选择是非常重要的。日本学者最早根据CloneN22基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增,检测TTV-DNA,结果发现该套引物检出率低。后来其他研究者发现在TTV非转录区(UTR)存在一些高度保守序列[1],根据这部分序列所设计的引物检测TTV-DNA,敏感性明显提高。但由于TTV不同群之间的变异程度相当大,因此设计不同的引物对TTV不同基因群别进行分群检测也是非常必要的。

1 材料与方法

1.1标本来源:随机选取在三明第一医院体检科抽血健康人106名和随机选取三明市第一医院住院的HBV患者64名和门诊就诊的HCV携带者32名。

1.2 DNA的抽提 采用高纯度病毒核酸提取试剂盒参照说明进行。

1.3 引物的设计 参照GenBank 中发表的各群TTV全部基因序列,进行核苷酸序列比对,合理设计出1-5群TTV引物。各套PCR体系引物的位置序列、极性和产物大小见表(1)

1.4 PCR反应条件和PCR 反应产物的检测1-5群TTV的检测采用巢式PCR(其中G4采用半巢式PCR)。各反应体系和反应条件有所不同,将1-5群巢式PCR的反应体系PCR 扩增体系和循环参数以及PCR 反应产物的检测按文献[2]。

2 结果

各组TTV 1-5各群感染率,在 TTV各群总感染率中,G4群TTV感染率最高,为52.0%(105/202),然后依次为G5: 39.1% (79/202),G3: 32.7%66/202(66/202),G1: 25.7% (52/202),G2: 8.4% (17/202)。三个组群TTV感染率高低和总感染率的高低排序是相同的。从三个组1-5群TTV平均感染率的比较上看,HBV患者和HCV携带者TTV各群平均感染率(45.0%和37.8%)比健康人群(23.8%)高(x2=27.32,p<0.01,x2=18.52,p<0.01)。HBV组TTV各群平均感染率和HCV组各群平均感染率相比较没有显著区别(x2=2.29,p>0.05)。

 

 

如实验所示,TTV常常混合感染。测出2种属于不同群TTV感染实验者也有不少(19.8%),4份标本甚至检测出了属于3种不同群TTV-DNA。HBV患者组中,检测出1种TTV-DNA 和2种属于不同群TTV-DNA,分别占29.7%和56.3%,5份标本和2份标本检测出3重(群)和4重(群) TTV的感染。HCV携带者组中,检测出1种TTV-DNA和2种属于不同群TTV-DNA,分别占28.1%和31.2%,9份标本和4份标本可以检测出3重(群)和4重(群) TTV的感染。

3 讨论

不同TTV分离株的基因序列变异性很强,相互之间差异性可高达到40%。根据相互之间基因序列差异度,TTV被分为五个基因群。本研究设计五种基因群的不同引物,用巢式(半巢式)PCR方法扩增TTV-DNA。第一轮PCR产物片段比较大,然后在第一轮产物基础上,进行第二轮扩增,其产物的片段相对第一轮较小。进行两轮PCR的原因是因为TTV在人体内的病毒量比较少,两次PCR可以提高核酸扩增的灵敏度,同时可以增加扩增的TTV-DNA特异性,便于更好区分不同群的TTV。

随着其他研究者对一些潜在新TTV基因的认识,我们会发现,作为一种DNA病毒来说,TTV基因序列的变异程度确实是相当大的。TA278是最早被发现的TTV基因分离株,由日本人于1997年鉴定的。而归属于第2群的病毒分离株 PMV和 KAV,是在欧洲鉴定认识的,归属于1群的 JA1 和归属于第3群的TUS01 是在美国被鉴定认识的。其中,在亚洲进行鉴定和研究TTV分离株是最多的,而在其他大洲,有关于TTV基因群和基因型别分布的数据相对较少。本研究的结果说明了1-5群TTV在三明市流行分布,在总共202份的标本中,第4群TTV的感染率最高,之后是5,3,1,2群。在健康人群组,HBV组,HCV组中,所有基因群都有被检测到。研究中发现,第2群TTV的感染率较低,这在以前其他人的研究中也有所证实。

大量研究表明在同一个体中,可以同时检测出几种属于不同群别的TTV分离株。2002年Peng等在17份日本和6份中国婴儿的标本中检测到了6种TTV基因克隆,发现1份日本和3份中国婴儿标本感染有两种属于不同基因群TTV,另外有1份标本感染有3种属于不同基因群TTV。本研究实验也表明相同结果,献血组有21份标本检测出2种属于不同基因群TTV,有4份标本检测出了3种属于不同群TTV。HBV组中,36份标本检测出2种属于不同群的TTV,有5份标本和2份标本可以检测出3重(群)和4重(群)TTV的感染。HCV组中,10份标本检测出2种属于不同群的TTV,有9份标本和4份标本可以检测出3重(群)和4重(群)的TTV的感染。

TTV与其他传染性病毒常常共感染。在共感染有其他病毒(如本研究中的HBV、HCV)实验对象的分群TTV检测中发现,双重甚至多重混合感染属于不同群TTV比正常人群(如健康人群)来的更频繁,比例更高。有研究者认为这很可能是由于HBV患者和HCV携带者免疫力下降,使其更容易感染上TTV。

TTV已经发现了有十多年,国内外的研究者做了大量工作,取得了很多的进展,但是关于TTV的许多问题仍然未能解决,例如动物模型的建立,TTV是否致病以及对致病机理的探索,简单且又准确的诊断指标等等,因此对于TTV的研究仍然有多值得探讨的问题。

参考文献

[1] 彭宜红,彭进.一种新的TTV 基因群全基因序列测定及基因结构分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003 ,23 (4):307-310.

[2] 吉建民.不同镁离子浓度对TTV 核酸检测的影响[J].实用医技杂志,2004 ,11(8):331-332

[3] 彭进,王清,胡烈谱.第.1、4、5 基因群感染检测分析[J].中国公共卫生,2005,21(5):564-566.

论文作者:黄思晓

论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿

论文发表时间:2014-3-6

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