谢莉[1]2004年在《体外γ干扰素检测在结核分枝杆菌潜伏感染及结核病诊断中的临床意义》文中研究指明结核菌素皮肤试验(TST)作为分枝杆菌潜伏感染的诊断方法应用近一个世纪,但该方法用于结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)及结核病的诊断时则存在许多不足之处。近年来,体外γ干扰素(IFN-γ)检测方法对于LTBI及结核病的诊断价值引起了研究者的广泛关注。该方法即用分枝杆菌特异或非特异抗原在体外刺激受检者全血或外周血单
谢莉[2]2004年在《体外γ干扰素检测在结核分枝杆菌潜伏感染及结核病诊断中的临床意义》文中研究指明目的 探讨叁种结核分枝杆菌抗原刺激外周血单个核细胞(PBMC)后γ干扰素(IFN-γ)检测对于结核分枝杆菌潜伏感染及结核病的诊断意义，并与结核菌素皮试(TST)进行比较。对抗原刺激全血24小时后IFN-γ水平与抗原刺激PBMC 5天后IFN-γ水平进行比较。 方法 研究对象共分叁组，活动性结核组(57例)，健康对照组(27例)，肿瘤组(29例)，分别用结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)，早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretary antigenic target 6kDa protein ESAT-6)，38kDa抗原与PBMC共同培养5天，然后采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中IFN-γ的浓度，并分离细胞提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定IFN-γ mRNA的表达。部分标本同步进行全血+抗原和PBMC+抗原两种方法培养。 结果 在健康组中，TST与BCG接种史和排菌病人密切接触程度呈正相关关系(P值分别为0.047和0.041)，而以ESAT-6为抗原的IFN-γ水平在不同接触程度组中差异显著，在有无卡痕组差异不显著。抗原刺激后的IFN-γ浓度在结核组最高，肿瘤组最低。38kDa抗原刺激后的IFN-γ浓度对于结核病诊断的敏感性为64.9％，特异性为89.3％。仅有部分标本在RT-PCR后可见IFN-γ mRNA的表达，且其mRNA表达水平与上清液中IFN-γ浓度无显著相关关系。以PBMC为基础和以全血为基础的两种IFN-γ检测相关性良好(r=0.835，P(0.001)。 结论 ESAT-6刺激后的IFN-γ检测用于结核分枝杆菌潜伏感染的诊断可能优于TST。38kDa抗原刺激后的IFN-γ检测可用于结核病的辅助诊断。抗原刺激PBMC 5天后IFN-γ的转录和翻译水平不平行。全血+抗原培养方法有可能取代PBMC+抗原培养方法。
张舒[3]2011年在《卡介苗接种地区免疫功能不全患者潜伏性结核感染免疫学诊断及免疫学发病机制的实验研究》文中认为第一部分免疫介导炎性疾病人群中潜伏性结核感染的免疫学诊断研究目的：评价新型γ干扰素释放试验(TSPOT.TB技术)及传统结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST检测)在BCG接种地区免疫介导炎性疾病(immune mediated inflammatory diseases, IMID)患者中检测潜伏性结核感染的免疫诊断价值,探讨BCG高接种率地区该类特殊人群中潜伏性结核感染者的特异性抗结核细胞免疫应答反应。方法：同时应用TSPOT.TB检测及传统TST检测方法,对中国东部地区294例明确诊断的IMID患者及48例正常健康对照者进行潜伏性结核感染的筛查。比较不同亚组中各检测方法阳性率、危险因素关联性及抗原特异性宿主免疫应答反应差异。结果：IMID患者人群中TSPOT.TB阳性率为27.2%,TST阳性率为51.4%(硬结直径≥5 mm)或38.4%(硬结直径≥10 mm)。正常健康对照组中TSPOT.TB阳性率为20.8%,TST检测阳性率为64.6%(硬结直径≥5mm)或50.0%(硬结直径≥10 mm)。两组人群中的TST阳性率均显着高于TSPOT.TB阳性率(P值均<0.0001)。IMID患者中的TST阳性率低于正常健康对照者,而TSPOT.TB阳性率则高于正常健康对照者。与正常健康人群相比,IMID患者中的潜伏性结核感染更易被TST检测漏诊或误诊。在IMID患者中,BCG接种史和近期糖皮质激素治疗史均会对TST结果产生显着影响(OR值分别为2.05和0.56,P值均<0.05),但TSPOT.TB结果不受这些因素的影响。各人群亚组间的抗原特异性免疫应答反应差异也与检测阳性率差异及危险因素关联性一致。推测在BCG接种地区使用TST检测来初筛IMID患者人群中的潜伏性结核感染时,可能更适宜使用硬结直径≥10 mm作为TST阳性结果的Cut-off值。结论：在BCG高接种率地区的IMID患者人群中用TSPOT.TB检测诊断潜伏结核感染要比TST检测更为敏感和可靠,尤其对已接受免疫抑制剂治疗的IMID患者高危人群有着独特的应用价值。第二部分HIV阳性感染人群中潜伏性结核感染的免疫学诊断研究目的：调查中国西南地区HIV合并活动性结核感染和HIV合并潜伏性结核感染的疾病负担,评价新型γ干扰素释放试验(TSPOT.TB检测)及传统结核菌素皮试(TST检测)在BCG高接种率地区HIV阳性感染人群中用于检测活动性及潜伏性结核感染的免疫诊断价值。方法：采用TSPOT.TB检测技术共对中国西南地区100例明确诊断的HIV阳性感染者(其中32例为明确诊断的合并活动性结核病患者)血液标本进行结核分枝杆菌抗原特异性T细胞的检测,同时对所有病例进行TST检测。结果：100例HIV感染者中共有32例HIV合并活动性结核病者(HIV+ATB组),46例HIV合并潜伏性结核感染者(HIV+LTB组)和22例单纯HIV感染者(HIV+TB-组)。临床上无活动性结核感染证据的HIV阳性感染者中合并潜伏性结核的感染率高达67.6%。在TST结果为阴性的HIV感染者中,HIV+ATB患者和无活动性结核感染证据的HIV阳性感染者的TSPOT.TB检测阳性率分别为66.7%(16/24例)和47.5%(19/40例)。在CD4+T细胞计数<500/μl的HIV感染者中,HIV+ATB患者和无活动性结核感染证据的HIV阳性感染者的TSPOT.TB阳性率均显着高于TST阳性率(66.7%vs.23.8%,55.6%vs.22.2%以及44.4%vs.11.1%,69.2%vs.42.3%,P值均<0.0001)。在抗结核治疗小于1月及CD4+T细胞计数≥200/μl的HIV+ATB组患者中,TSPOT.TB阳性率高达85%以上但在抗结核治疗大于3月及CD4+T细胞计数<200/μl的HIV+ATB组患者中TSPOT.TB阳性率仅有33.3%。在无活动性结核感染证据的HIV阳性感染者中,TSPOT.TB检测阳性率不受CD4细胞计数水平影响(P>0.05);但TST检测在CD4<200/μl组中的阳性率远低于CD4≥200/μl组(11.11%vs.46.55%,P<0.05)。结论：我国无活动性结核感染临床证据的HIV感染人群中有较高的结核潜伏感染率。与传统TST检测相比,新型γ干扰素释放试验(TSPOT.TB检测)在BCG高接种率地区的HIV阳性感染者中诊断结核分枝杆菌感染要更加敏感和快速,在HIV合并潜伏性结核感染的早期快速诊断中有较大应用价值。TSPOT.TB检测不受CD4细胞计数水平影响,在中国HIV合并潜伏性结核感染者中可更有效地指导异烟肼预防性治疗及结核病防控。第叁部分HIV阳性感染人群中潜伏性结核进展为活动性结核的免疫学发病机制研究目的：评价HIV/AIDS合并潜伏性结核感染及合并活动性结核感染者中结核分枝杆菌肽类抗原特异性CD4+及CD8+T细胞免疫应答功能,以及非肽类抗原特异性Vγ2Vδ2+T细胞免疫应答功能,探讨BCG高接种率地区HIV感染人群中潜伏性结核进展为活动性结核的免疫学发病机制。方法：对云南省100例明确诊断的HIV/AIDS感染者按临床症状、胸片和TSPOT.TB检测结果分为HIV合并活动性结核感染(HIV+ATB)组、HIV合并潜伏性结核感染(HIV+LTB)组及HIV未合并结核感染(HIV+TB-)组。应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)及细胞内细胞因子染色(ICS)技术检测各组病例经体外抗原刺激后外周血淋巴细胞中结核分枝杆菌PPD特异性IFNγ+CD4+和IFNγ+CD8+T细胞数量水平,以及磷酸化抗原HMBPP特异性IFNγ+Vγ2Vδ2+T细胞数量水平。结果：PPD特异性IFNγ+CD4+T细胞数量在HIV+ATB组及HIV+LTB组中均处于较低水平,且与外周血CD4+T细胞计数水平无关。但HIV+LTB组患者的PPD特异性IFNγ+CD8+T细胞数量水平要显着高于HIV+ATB组。另外,HIV+LTB组患者的HMBPP特异性IFNγ+Vγ2Vδ2+T细胞数量水平也远高于HIV+ATB组(P<0.0001),且这种显着性差异在CD4+T细胞<200/μl或≥200/μl的HIV+LTB亚组中均存在。在HIV合并潜伏性结核感染者中,HMBPP特异性IFNγ+Vγ2Vδ2+T细胞数量甚至是PPD特异性IFNγ+CD8+T细胞数量的7倍之多。结论：不同于HIV合并活动性结核感染者,在我国HIV合并潜伏性结核感染者的外周血淋巴细胞中可检测到显着增强的HMBPP特异性IFNγ+Vγ2Vδ2+T细胞及PPD特异性IFNγ+CD8+T细胞免疫应答反应。这种Vγ2Vδ2+T效应细胞及CD8+T效应细胞的特异性抗结核免疫应答功能可能与BCG高接种率地区HIV/AIDS合并结核感染人群中的潜伏性感染状态密切相关,推测这两类特殊T细胞亚群在数量和功能上的双重受损可能是HIV阳性感染者高危人群中潜伏性结核感染的重要免疫发病机制之一。
王本学[4]2017年在《GBP5、KLF2基因在潜伏结核感染人群中表达研究》文中指出目的:探讨GBP5和KLF2这两个目的基因在潜伏结核感染人群中的表达情况,并同时与它们在涂阳结核病患者及健康人群中表达情况进行比较。分析两种目的基因在叁组人群中相对表达量的差异,确定潜伏结核感染(LTBI)人群中将来有可能发展成为结核病患者的表达阈值。为LTBI高危人群的筛选找到合适的标志物,以便对这组人群进行精准的化学预防,控制结核病的发生。方法:在一家综合医院呼吸科和一家结核病专科医院两家单位,共收集180例受试者,分为叁组,以痰涂片是否找到结核分枝杆菌(MTB))和γ-干扰素释放试验QFT结果为标准,分别为涂阳结核病患者组60例,潜伏结核感染者组(QFT阳性)60例,健康人群组(QFT阴性)60例,对符合条件的受试者,每人抽取外周全血4ml,并给予肝素锂抗凝处理。然后在两小时内,置于离心机内,分离T淋巴细胞,提取RNA。然后通过反转录酶作用,合成c DNA。再以c DNA为模板,通过前期合成的引物引导,合成目的基因片段。对合成的目的基因片段采用RT-PCR技术,进行基因扩增,通过定时定量仪器,测得两种目的基因的CT值。用2-△△CT法,对目的基因进行差值校正,求得两种目的基因GBP5、KLF2在叁组受试者中的相对表达量。通过SPSS18.0统计分析软件对GBP5、KLF2在叁组人群的相对表达量数值进行统计学分析,观察差异是否有统计学意义。如果统计分析有效,则进一步进行均值的比较,并分别确定两种目的基因的表达阈值。同时对可能存在的其他情况进行分析比较。结果:1、叁组受试者中,GBP5相对表达量差异有统计学意义(p﹤0.05),GBP5相对表达量,在涂阳结核病患者组中表达最高,在潜伏结核感染人群组中次之,在健康人群组中表达最低。2、叁组受试者中,KLF2相对表达量差异有统计学意义(p﹤0.05),KLF2相对表达量,在涂阳结核病患者组中表达最高,在潜伏结核感染者中次之,在健康人群组组中表达最低。3、对于潜伏结核感染人群中远期进展为结核病可能性高的群体,上述两个目的基因表达阈值的界定:GBP5相对表达量在1.17~1.25范围内,未来发病风险高,是精准预防的对象。KLF2相对表达量在1.11~1.21范围内,未来发病风险高,是精准预防的对象。4、GBP5、KLF2可以区别潜伏结核感染与活动性结核病。结论:1、GBP5在叁组受试者中相对表达量不同,GBP5可以用来筛选潜伏结核感染人群中远期进展为结核病可能性高的群体。2、KLF2在叁组受试者中相对表达量不同,KLF2可以用来筛选潜伏结核感染人群远期进展为结核病可能性高的群体。GBP5、KLF2可以为LTBI高危人群精准化学预防提供诊断依据。3、GBP5、KLF2可以用于活动性结核病与潜伏结核感染的鉴别性诊断。4、GBP5、KLF2有望成为结核病基因诊断的目的基因。
乔亚红[5]2013年在《抗原诱发的γ-干扰素释放试验在结核性胸膜炎诊断中的应用研究》文中提出研究背景与目的结核性胸膜炎是机体感染了结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, Mtb)而引起的胸膜变态反应性炎症,多发生于初次感染结核菌后2-12个月,初染者约有14%可发展为结核性胸膜炎。世界上大约有1/3的人,我国约有1/2的人感染过结核菌,结核性胸膜炎的发病率大约为1.25%,据此估算结核性胸膜炎发病人数约为160万,尤其青壮年是它的易感人群,39岁以下的病人占73%。结核性胸膜炎若延误诊断,则可造成胸膜增厚、粘连,严重者可引起肺功能下降而丧失劳动能力。应此,早期诊断并给予早期治疗是非常必要的。目前结核性胸膜炎的诊断主要依靠PPD皮内变态反应、胸腔积液的细菌学检查和胸膜病理学检查,PPD皮内变态反应与卡介苗接种、结核菌潜伏感染及非结核分枝杆菌感染不易区分,胸腔积液的细菌学检查在胸水中检查的阳性率极低,胸膜病理学检查有创伤性,患者依从性差。因此,目前急需要研究一些新的检查方法以提高对结核性胸膜炎的诊断水平。进入21世纪来,随着基因组学和免疫学研究的进一步深入,出现了在体外刺激T淋巴细胞分泌γ干扰素测定的方法。它的原理是：首先使结核杆菌抗原接触T淋巴细胞,然后再次使结核杆菌抗原接触致敏的T淋巴细胞,这些致敏的淋巴细胞则会释放出大量的γ-干扰素,较高的γ-干扰素释放水平,提示患者感染了结核分枝杆菌,这就是γ干扰素释放试验(Interferon-gamma Release Assay,IGRA),刺激T淋巴细胞产生γ干扰素的抗原有时易与机体接种过卡介苗和感染了非分支杆菌所产生的高的Y干扰素水平所相混淆,因此我们必须找到这样一种抗原,它是结核杆菌所特有的,而其他非结核分枝杆菌缺失,这样的试验结果才能在结核病中有较高的的诊断意义。近两年研究发现的早期分泌抗原靶6000(early secreting antigenic target-6,ESAT-6)就是这样的抗原,它可成功地避开接种卡介苗和非结核分枝杆菌的干扰,而使它的特异性大大提高。目前,大多数的研究是采集患者的血清来进行抗原诱发的γ干扰素释放试验,我们试图通过采集结核性胸膜炎患者的胸水进行抗原诱发的γ干扰素释放试验(IGRA),观察ESAT-6对结核性胸膜炎的诊断价值。方法研究对象分为两组：结核性胸膜炎组与恶性胸腔积液组。应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的方法检测两组患者血清及胸水中γ干扰素基础值水平及经ESAT-6抗原刺激后γ干扰素释放水平,并对数据进行对比分析,判断Y干扰素基础值及经ESAT-6抗原刺激后γ干扰素释放水平对结核性胸膜炎的诊断价值。结果1结核性胸膜炎组胸水中的Y干扰素基础值和经ESAT-6抗原刺激后Y干扰素释放水平均高于血中的γ干扰素基础值及经ESAT-6抗原刺激后γ干扰素释放水平,P<0.01,具有统计学意义。2结核性胸膜炎组胸水中的Y干扰素基础值和经ESAT-6抗原刺激后γ干扰素释放水平均高于恶性胸腔积液组,P<0.05,具有统计学意义。3结核性胸膜炎组血中检测γ干扰素基础值及经ESAT-6抗原刺激后γ干扰素释放水平均高于恶性胸腔积液组,但P>0.05,差异无显着性。结论1结核高感染率的背景下,血中γ干扰素释放试验(IGRA)对于鉴别胸腔积液是肿瘤还是结核意义不大。2在胸水中检测γ干扰素释放试验(IGRA)对结核性胸膜炎诊断的方法简变,特异性、灵敏性高,在临床上值得推广使用。
周乐亮[6]2013年在《T-SPOT.TB联合细胞因子INF-γ、IL-10等检测在结核病诊断中的应用》文中研究说明目的：评价结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)联合血浆细胞因子INF-γ、IL-10等检测对活动性结核病与非活动性结核病的鉴别诊断价值以及结核病中Th1型/Th2型细胞因子变化特点。方法：前瞻性纳入中南大学湘雅叁医院2012年10月至2013年2月疑诊结核感染的住院或门诊患者75例以及24例行健康体检的医务工作者,分别行外周血T-SPOT.TB检测,采集血浆标本冻存以及收集完整的临床资料。在研究终点(2013年5月)对所有纳入对象进行诊断评估,将最终符合入组标准的研究对象,分为叁组即活动性结核组(设为A组),非活动性结核组(设为B组)和健康对照组(设为C组)。分别检测叁组血浆INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10浓度,并比较两组之间的浓度差异,以及比较A组与B组T-SPOT.TB结果阳性者各孔斑点数大小,均以P<0.05为差异有统计学意义。如果某细胞因子或某斑点数在A组与B组之间有显着差异,则通过ROC曲线分析,判断其诊断价值大小,当约登指数最大时,此时该细胞因子浓度或斑点数目为鉴别两者的最佳临界值,并算出其诊断灵敏度,特异度以及阳性似然比、阴性似然比。结果：根据诊断与入组标准,最终纳入研究对象72例,分别是A组32例,B组(包括陈旧性结核16例,结核潜伏感染者4例)20例,C组20例。血浆INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10在A组中浓度分别是115.94±14.01,452.95±209.90,260.70±95.73,152.86±37.11,在B组中浓度分别是89.79±4.25,499.78±197.15,260.46±134.33,86.68±15.71,在C组中浓度分别是90.79±3.88,510.10±103.03,204.98±108.81,64.51±9.66。A组与B组相比,INF-γ及IL-10在两组之间均有显着差异,P<0.05；IL-2及IL-4在两组之间均无显着差异,P>0.05。B组与C组相比,INF-γ及IL-2在两组之间均无显着差异,P>0.05；IL-4及IL-10在两组之间均有显着差异,P<0.05。A组与B组T-SPOT.TB结果阳性者A孔、B孔及A+B孔斑点数中位数分别是,23与19,74.5与25,115.5与49,A孔及A+B孔斑点数之和在两组之间均无显着差异,P>0.05；B孔斑点数在两组之间有显着差异,P<0.05。在A组与B组之间,通过对两组B孔斑点数、血浆INF-γ及IL-10浓度做ROC曲线分析,得出AUC分别是0.69,0.95,0.98,以B孔斑点数74.5个,INF-γ浓度94.38pg/ml,IL-10浓度109.82pg/m1分别为临界值,鉴别活动性结核与非活动性结核灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比分别是：50.0%,93.8%,93.8%；89.5%,85.0%,90.0%；4.76,6.25,9.38；0.56,0.07,0.07。结论：1.Th1型/Th2型细胞因子的动态失衡在结核发生发展中起重要作用,可能当Th2型细胞因子占主导地位时促进了结核的发生发展。2.T-SPOT.TB联合血浆INF-γ、IL-10浓度检测可对结核作出精确诊断,有较高的诊断价值。疑诊结核感染患者可先行T-SPOT.TB检测,当结果阳性时,再测定血浆INF-γ或IL-10的浓度,有助于区分活动性结核与非活动性结核,其中IL-10的阳性似然比更高,更有助于活动性结核病的诊断。3.活动性结核患者与非活动性结核患者,当T-SPOT.TB结果阳性时,仅B孔斑点数在两者之间有显着差异,但尚不足以凭借B孔斑点数较好区分活动性结核与非活动性结核。图12幅,表3个,参考文献46篇。
肖松生, 杨倩婷, 蔡雄茂, 张明霞, 朱秀云[7]2008年在《外周血IFN-γ的检测在结核分枝杆菌潜伏感染诊断中的价值》文中认为目的探讨利用酶联免疫斑点(Elispot)法检测外周血结核抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)应答反应在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值。方法将150例健康者按结核暴露程度分成4级,采用Elispot技术检测其外周血单个核细胞(PBMC)结核菌抗原特异性IFN-γ分泌水平;其中111例进行结核菌素皮试(PPD皮试);39例采用全血干扰素试剂(Quantiferon-TB-Gold,QFT-G)进行IFN-γ分泌水平的平行检测。结果采用Elispot检测结果显示体外IFN-γ应答反应水平与结核菌暴露程度成正相关(r=0.4155,P<0.0001),不同暴露程度分级的IFN-γ应答阳性率分别是:4级(55.6%)、3级(33.3%)、2级(16.7%)、1级(6.8%)。不同暴露程度分级与PPD皮试结果的相关性没有统计学意义(r=0.1206,P=0.2073);不同暴露程度分级的PPD皮试反应阳性率分别为4级(33.3%)、3级(27.8%)、2级(11.1%)、1级(22.0%)。对Elispot检测结果与QTF-G检测结果进行平行比较分析,两种方法检测结果没有统计学差异(χ2=0.125,P=0.7237)。结论外周血结核抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)应答反应水平与结核菌暴露程度成正相关,Elispot检测体外IFN-γ应答反应在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值优于PPD皮试,可以用于对潜伏感染者的筛查。
王森[8]2012年在《新型结核诊断抗原和生物标志物的筛选及其在结核病诊断中的应用》文中研究指明建立在细胞免疫基础上的γ干扰素释放实验(IFN-gamma release assays, IGRAs)近年来获得了较快的发展,IGRAs通过对结核分枝杆菌特异性的抗原刺激后的IFN-γ释放进行检测来判断机体是否存在结核菌的感染。目前商品化的IGRAs共有两种,一种为QuantiFERON TB Gold In-Tube test (QFT; cellestis, Carnagie, Australia),另一种为T-SPOT.TB test (Oxford Immunotech, Abingdon, UK)。IGRAs在结核病的临床检测中获得了一定程度的应用,与传统的结核菌素试验(Tuberculin skin test, TST)相比较,IGRAs在BCG广泛接种地区具有较低的假阳性率并且与结核病的高危因素具有较高的相关性。但现有的IGRAs仍然存在诸多缺陷,限制了其在结核病诊断中的应用,主要集中在敏感性仍然有待提高,以及会出现较多无法判定的结果,特别是在重症结核和伴有免疫抑制的结核病患者中。此外,目前的IGRAs只能够检测结核杆菌的感染,而不能够区分活动性结核和潜伏性结核感染。在结核病高流行的地区和国家,由于潜伏性结核感染的比率较高,使IGRAs的在临床诊断中的应用受到了极大地限制。为了改进现有的IGRAs诊断方法,一方面可以增加结核杆菌特异性的抗原,另一方面可以检测除IFN-γ以外的其它诊断标志物。本研究首先在结核杆菌基因组的RD区中筛选新的结核杆菌特异性抗原。结核杆菌基因组的RD区(Region of differentiation)在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌中是缺失的,RD区是结核杆菌免疫诊断特异性抗原筛选的首选区域。在前期研究中,通过对RD2及RD11抗原的体外表达和纯化得到RD2区和RD11区抗原的重组蛋白,对其诊断价值进行了初步的筛选。本研究对其中具有最高诊断价值的抗原Rv1985c和Rv3425进行了的T细胞抗原表位的作图和分析。应用基于全血的IFN-γ释放实验,我们以覆盖Rv1985c和Rv3452氨基酸序列全长的多肽作为抗原,在活动性结核病人,潜伏性结核感染者和BCG接种的健康对照中对其表位进行了筛选,从中选取特异性抗原表位多肽组成多肽混合物,并进一步进行验证。结果表明在我们所选取的多肽混合物中,Rv1985cpool2, Rv1985cpool4和Rv3425pooll均具有较高的诊断价值,敏感性最高为53.9%,特异性为95.5%。将这些多肽混合物与QFT联用能够提高诊断的敏感性从86.4%到96.2%,而不影响诊断的特异性。因此,本部分研究的结果表明应用表位作图方法筛选出的特异性Rv1985c和Rv3425的抗原表位多肽对结核病具有较高的诊断价值,可以在BCG接种人群中应用于结核病的诊断。另一方面为了筛选新的诊断生物标志物,我们应用高通量的悬液芯片技术,在28例活动性结核病人,34例潜伏性结核感染者及26例健康对照者中,对外周全血受结核特异性抗原刺激及基础分泌水平的27种炎症因子谱进行了分析和筛选。结果表明结核特异性抗原刺激后的IFN-γ,EP-10,IL-2,MCP-1,IL-1RA,IL-15和未受抗原刺激的VEGF,IP-10,IL-12,MCP-1,MIP-1b释放量在结核感染组(包括活动性结核和潜伏性结核感染)中均明显高于健康对照组。在27种炎症因子中,基础分泌水平的VEGF,PDGF,IL-12,IP-10和结核特异性抗原刺激后的IFN-γ和PDGF在活动性结核组中明显高于潜伏性结核感染组。当联合应用VEGF,IL-12和PDGF能够区分活动和潜伏性结核感染,其敏感性和特异性分别为79.4%和92.9%。这些结果表明,建立在现有IGRAs基础上通过对VEGF,IL-12和PDGF等进行检测可以作为一种新的快速诊断方法,能够应用于区分活动性结核病和潜伏性结核感染。接下来本研究选取前期筛选出的具有较高诊断价值的标志物IP-10和IL-2,进一步验证并评价其在结核高流行,BCG广泛接种地区诊断结核病的表现。我们共收集了活动性结核病人66例,潜伏性结核感染者73例和健康对照77例,对其外周全血受结核特异性抗原刺激后的IP-10和IL-2释放量进行了检测。结果表明,IFN-γ,IP-10和IL-2在活动性结核组中诊断的阳性率分别为86.4%,89.4%和86.4%,在潜伏性结核感染组中为38.4%,57.5%和39.7%,在健康对照组中为17.1%,18.4%和14.5%。在活动性结核病人的密切接触者中,与TST相比较,IP-10和IL-2与结核感染的高危因素具有较高的相关性。此外IP-10和IL-2的联用可以降低出现无法判定结果的几率。IP-10和IL-2与QFT联用可以将敏感性提高到95.5%而并不影响特异性,无法判定结果比率下降为0.4%。此外,我们还发现IL-2/IFN-γ能够区分活动性结核病和潜伏性结核感染,其敏感性为77.2%,特异性为87.2%。综上所述,本研究一方面确定了Rv1985c和Rv3425两个抗原的特异性的T细胞表位多肽,并证实了其在诊断结核病中应用价值和对现有抗原的补充作用。另一方面,本研究也通过悬液芯片技术筛选出了能够区分活动性结核病和潜伏性结核感染的新型诊断生物标志物。此外本研究也系统评价了IP-10和IL-2在结核病诊断中的应用,证实其与现有IGRAs联用能够增加诊断的敏感性并降低出现无法判定结果的比率。这些新型的抗原和诊断标志物均能够极大地改进现有的基于细胞免疫的结核病诊断方法,使其能够更好地应用于结核病的诊断。
李海[9]2012年在《酶联免疫斑点法快速诊断活动性结核病的临床应用研究》文中进行了进一步梳理[目的]评估基于6KD早期分泌靶抗原(early secreting antigen target 6KD, ESAT-6)和10KD培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10KD, CFP-10)抗原肽的酶联免疫斑点技术(Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISPOT)在高发病率国家诊断活动性结核病的真实性、可靠性和诊断价值。探讨ELISPOT快速诊断痰液结核分枝杆菌培养和痰涂片抗酸杆菌检查(Acid Fast Bacilli,AFB)阴性结核病、儿童结核病和肺外结核病的可行性。[方法]整群选取在2011年3月至8月期间到广西南宁市第四人民医院医院住院治疗的痰液细菌学培养阳性或组织病理学确诊的活动性结核病人140例作为结核病组,其中细菌学培养阳性90例,阴性36例。整群选取同期到该医院住院治疗的非结核病人98例作为对照组。收集研究对象的外周血单核细胞进行ELISPOT (T SPOT.TB; OxfordImmunotec Ltd., Abingdon, UK)检测,同时进行结核菌素皮肤试验(Tuberculin skin test, TST)。结合最终临床诊断和微生物学的诊断,应用灵敏度、特异度、阳性预测值(Positive predictive value, PPV),阴性预测值(Negative predictive value,NPV)、阳性似然比(Positive Likelihood Ratio)、阴性似然比(Negative Likelihood Ratio)、约登指数、诊断OR值和ELISPOT和TST的检测结果一致性等指标评价ELISPOT和TST在常规临床实践中诊断活动性结核病的真实性、诊断价值和可靠性。应用单因素和多因素非条件Logistic回归模型分析ELISPOT和TST灵敏度和特异度的影响因素。[结果](1)ELISPOT斑点形成细胞(Spot forming cells, SFCs)分布：①结核组ESAT-6形成的SFCs数的中位数(74个/2.5×105PBMCs)显着高于对照组(11个/2.5×105PBMCs)(P<0.001),结核组CFP-10形成的SFCs数的中位数(100个/2.5×105PBMCs)也显着高于对照组(9个/2.5×105PBMCs)(P<0.001)。②涂阳和涂阴结核组ESAT-6形成的SFCs数的中位数(92个和74个/2.5×105PBMCs)均高于对照组(11个/2.5×105PBMCs),差异有统计学意义(P<0.001),涂阳和涂阴结核组CFP-10-ELISPOT形成的SFCs数的中位数(150个和100个/2.5×105PBMCs)均高于对照组(9个/2.5×105PBMCs),差异有统计学意义(P<0.001)。③结核病例ESAT-6和CFP-10抗原肽形成SFCs数与年龄、BMI指数和抗结核治疗时间等影响因素存在关联(P均<0.05),与性别、BCG接种、既往结核病史、家庭接触结核病人和免疫抑制等其他影响因素均无关联(P均>0.05)。(2)TST硬结直径分布：①病例组和对照组TST硬结直径中位数分别为7.00mm(0～27.00mm)和4.50mm(0～15.00mm),差异有统计学意义(P=0.007)。涂阳结核病组TST的硬结直径中位数是8.0mm(0～14.0mm),涂阴结核病组硬结直径中位数是7.0mm(0～27.0mm),对照组TST的硬结直径中位数是4.5mm(0～15.0mm),叁组病人TST硬结直径分布比较,差异有统计学意义(χ2=7.912,P=0.023)。涂阳和涂阴结核病组TST硬结直径分布差异无统计学意义(P>0.05),涂阳结核病组和涂阴结核病组硬结直径均大于对照组,分布差异有统计学意义(P值均<0.05)。②在14例儿童结核病例和16例儿童对照者中,病例组TST的硬结直径中位数是10.8mm(0～21.0mm),对照组TST的硬结直径中位数是3.5mm(2.0～15.0mm),病例组的硬结直径显着大于对照组(P=0.008)。(3)ELISPOT与TST总体诊断真实性与诊断价值：①ELISPOT诊断结核病的总体灵敏度为89.3%(95%CI：83.1-93.4),特异度为82.7%(95%CI：74.0-88.9),约登指数为0.72,PPV为88.0%(95%CI：81.7-92.4),NPV为84.4%(95%CI：75.8-90.3)。②TST(≥5mm)诊断活动性结核病的总体灵敏度为68.3%(95%CI：59.6-75.9),特异度为51.0%(95%CI：41.3-60.7),约登指数为0.193,PPV为63.6%(95%CI：55.2-71.4),NPV为56.2%(95%CI：45.8-66.0)。TST(≥10mm)诊断结核病的总体灵敏度为35.8%(95%CI：27.9-44.6),特异度为91.8%(95%CI：84.7-95.8),约登指数为0.276,PPV为84.6%(95%CI：72.5-91.2),NPV为53.3%(95%CI：45.7-60.6)。痰涂片抗酸染色检查的灵敏度为22.1%(95%CI：15.9-29.7)。③ELISPOT的灵敏度、特异度、PPV和NPV均显着高于TST(≥5mm)(P值均<0.001),ELISPOT的灵敏度和NPV显着高于TST(≥10mm)(P<0.001),特异度低于TST(≥10mm), PPV高于TST(≥10mm),但差异均无统计学意义(P>0.05)。④LISPOT、TST(≥5mm)和TST(≥10mm)阳性检测结果的活动性结核病诊断OR值分别为39.71(95%CI：18.78-83.93)、2.24(95%CI：1.30-3.88)和6.27(95%CI：2.78～14.11)。(4)菌阳和菌阴结核病人ELISPOT和TST诊断灵敏度：①菌阳结核病人中,ELISPOT和TST诊断灵敏度分别为97.8%(45/46,95%CI：88.7-99.6)和90.0%(27/30,95%CI：74.4-96.5),差异无统计学意义(P=0.33)。②菌阴结核病人中,ELISPOT和TST诊断灵敏度分别为86.7%(78/90,95%CI：78.1-92.2)和59.6%(53/89,95%CI：49.2-69.2),差异有统计学意义(P<0.001)。(5)肺外结核病人ELISPOT和TST诊断灵敏度：28例肺外结核病例中,ELISPOT阳性灵敏度(85.7%)高于TST(70.8%),差异无统计学意义(P=0.19)。4例结核性脑膜炎患者的ELISPOT结果都是阳性(100%),但只有2例(50%)TST阳性。(6)儿童结核病人ELISPOT和TST诊断真实性与诊断价值：①14个儿童活动性结核病例和16个儿童对照中,ELISPOT灵敏度为85.7%(95%CI：60.1～95.0),特异度为93.8%(95%CI：71.7～98.9)；②TST灵敏度为71.4%(95%CI：45.4～88.3),特异度为56.3%(95%CI：33.2～76.9)。③LISPOT的灵敏度高于TST,但无统计学意义(P>0.05)；ELISPOT的特异度显着高于TST(P<0.05)。(7)ELISPOT和TST诊断结果一致性：①LISPOT和TST总一致性较差(κ=0.24)。在活动型结核病组中,ELISPOT和TST一致性较差(κ=0.071),类似地,在对照组中,ELISPOT和TST一致性也较差(κ=0.15)。不一致的检测结果在结核病组中常见ELISPOT阳性而TST阴性(33例),而在对照组中常见于ELISPOT阴性而TST阳性(36例)。②在14个儿童活动型结核病例和16个儿童对照者中,ELISPOT和TST,总一致性较差(κ=0.35)。在结核病组中,ELISPOT和TST一致性较差(κ=0.18),类似地,在对照组中,ELISPOT和TST一致性也较差(κ=0.16)。不一致的检测结果在病例组中常见ELISPOT阳性而TST阴性(3例),而在对照组中常见于ELISPOT阴性而TST阳性(7例)。(8)ELISPOT和TST灵敏度影响因素：①多因素分析显示,ELISPOT灵敏度未受研究对象性别、年龄、BMI指数、接种卡介苗、既往结核病史、家庭接触结核病人、免疫抑制等因素的影响(P值均>0.05)。②多因素分析显示BMI指数<18.5(0R=0.22,95%CI：0.08～0.59)、接种卡介苗(OR=4.36,95%CI：1.25～15.26)、家庭接触结核病人(OR=6.61,95%CI：1.69～25.93)、有免疫抑制(OR=0.076,95%CI：0.016～0.37)等4个因素(P值均<0.05)是TST灵敏度的独立影响因素。提示营养不良、有免疫抑制更易使TST灵敏度降低,而接种卡介苗和家庭接触结核病人更易使TST灵敏度升高。(9)ELISPOT和TST特异度影响因素：①多因素分析显示,ELISPOT假阳性率未受研究对象性别、年龄、BMI指数、接种卡介苗、免疫抑制等因素的影响(P值均>0.05)。但既往结核病史(多因素分析OR=7.89,95%CI：1.15-54.02)、家庭接触结核病人(多因素分析OR=12.71,95%CI：2.56～63.22)是ELISPOT假阳性率的影响因素(P值均<0.05)。提示家庭接触结核病人和既往结核病史更易使ELISPOT特异度降低。②多因素分析显示BMI指数<18.5(OR=0.18,95%CI：0.04～0.82)、接种卡介苗(OR=12.73,95%CI：3.49～46.50)、既往结核病史(OR=83.85,95%CI：6.77～1038.38)、家庭接触结核病人(OR=21.69,95%CI：2.24～210.29)等4个因素(P值均<0.05)是TST假阳性率的独立影响因素。提示营养不良更易使TST特异度升高,而接种卡介苗、既往结核病史和家庭接触结核病人更易使TST特异度降低。[结论](1)基于ESAT-6和CFP-10抗原肽的ELISPOT技术在高发病率背景下诊断活动性结核病具有较高的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断OR值,ELISPOT诊断活动性结核病的真实性、可靠性和诊断价值均高于TST。TST诊断灵敏度与特异度均较低,对活动性结核病的诊断的参考意义有限。(2)ELISPOT的灵敏度不受研究参与者年龄、卡介苗接种、结核病接触史、既往结核病史和免疫抑制状况的显着影响,特异度也未受接种卡介苗的影响而降低,检测结果比TST更为可靠。(3)ELISPOT也有明显的缺点,例如不能很好区分活动性结核病患者和潜伏性结核感染者,家庭接触结核病人和既往结核病史更易使ELISPOT特异度降低；由于人类白细胞抗原限制性,无法完全排除假阴性结果；T-SPOT-TB试剂盒价格较昂贵,难以在经济发展水平较低的地区推广应用,用于大规模普查结核病也是不现实的。对于TST硬结直径≥10mm、痰涂片抗酸杆菌检查阳性结核病人可不做ELISPOT检测。(4)ELISPOT适合作为高发病率背景下临床实践中诊断活动性结核病,特别是涂阴结核病、肺外结核病和儿童结核病的可靠的辅助诊断手段,这有助于病例得到更快速的诊断和治疗,减少病人痛苦和不必要的医疗费用。
杨新婷[10]2009年在《全血γ干扰素释放实验在菌阴肺结核和结核性胸膜炎中的诊断价值》文中研究指明目的:探讨IFN-γ释放试验(ELISA)法在菌阴肺结核和结核性胸膜炎诊断与鉴别诊断中的临床应用价值。方法:受试者共234例,包括35例健康对照者、初诊肺结核患者106例(菌阳肺结核患者44例、菌阴肺结核患者47例、陈旧性肺结核15例)、初诊结核性胸膜炎患者37例、肺癌患者43例,肺部其他疾病患者13例,恶性胸腔积液患者32例。用ELISA法对上述受试者早期抗原靶(ESAT-6)、ESAT-6/滤过培养蛋白(CFP-10)融合抗原、PPD抗原、刺激后的血浆中γ-干扰素(IFN-γ)的含量进行测定。结果:1.经ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD抗原刺激后,活动性肺结核和结核性胸膜炎患者血浆IFN-γ含量明显高于健康对照组(P<0.01)。2观察影响因素显示:(1)叁个抗原刺激后的血浆IFN-γ含量在不同年龄组、菌阳组和菌阴组间、合并糖尿病和未合并糖尿病组间以及影像学显示有空洞组和无空洞组间均无显著性差异(P>0.05)。(2)陈旧性肺结核患者ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD抗原刺激后血浆IFN-γ含量低于菌阳肺结核(P<0.01),PPD抗原刺激后血浆IFN-γ含量低于菌阴肺结核(P<0.05);影像学显示病变累及四个肺段以上的肺结核患者ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原刺激后的血浆IFN-γ含量明显高于病变累及四个肺段以下的肺结核患者(P<0.05);淋巴细胞计数≥1.0×109患者各抗原刺激后血浆IFN-γ含量高于淋巴细胞计数<1.0×109的患者(P<0.01)。3.菌阴肺结核患者各抗原刺激后血浆IFN-γ含量明显高于肺癌及其它肺部疾病患者(P<0.01),结核性胸膜炎患者各抗原刺激后血浆IFN-γ含量明显高于恶性胸腔积液患者(P<0.01)。4.选择ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD叁种抗原刺激后血浆IFN-γ分别为>31pg/ml、>1458pg/ml、>2068pg/ml作为全血γ干扰素释放试验阳性的标准,活动性肺结核和结核性胸膜炎患者的阳性率高于健康对照组(P<0.01);除了PPD外,其它两种抗原刺激后,菌阴肺结核患者的阳性率高于肺癌及其它肺部疾病患者(P<0.01),结核性胸膜炎患者的阳性率高于恶性胸腔积液患者(P<0.01)。此外,菌阳肺结核和菌阴肺结核患者的阳性率相接近(P>0.05)。5.以ESAT-6或ESAT-6/CFP-10融合抗原任一抗原刺激后血浆IFN-γ异常增高作为评价指标,对菌阴肺结核诊断的敏感性为83.0%、特异性为74.3%、诊断准确率为79.3%,对结核性胸膜炎诊断的敏感性为78.4%、特异性为74.3%、诊断准确率为76.4%,均高于ADA,但与抗结核抗体(LAM)相接近。全血γ干扰素释放试验与LAM联合检测可使菌阴肺结核诊断的敏感性提高至93.6%、使结核性胸膜炎诊断的敏感性提高至86.5%。结论:全血γ释放试验可用于活动性肺结核患者的筛查、菌阴肺结核的诊断和鉴别诊断、良恶性胸腔积液的鉴别诊断。可选择ESAT-6或ESAT-6/CFP-10任一抗原刺激后血浆IFN-γ异常增高作为评价指标。全血IFN-γ释放试验联合结核抗体检测,可获得较高的敏感性和诊断准确率。为此,全血IFN-γ释放试验可在临床推广,作为菌阴肺结核和结核性胸膜炎的辅助诊断方法。
参考文献：
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