李永清[1]2004年在《禽流感病毒M2基因克隆、表达及其重组马立克氏病病毒的构建》文中研究指明禽流感(Avian Influenza, AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种高度接触性传染病，几乎所有的野生及家养禽类都可感染，该病经常给养禽业造成严重的经济损失。M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白，含有高度保守的抗原表位，是理想的交叉保护性疫苗的候选抗原。本研究对禽流感病毒M2基因进行了克隆、跨膜区缺失以及原核表达，探讨了金刚烷胺对M2蛋白原核表达的影响；并以该重组蛋白为免疫原制备出抗M2的单克隆抗体；将禽流感病毒M2基因与绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联连接后，插入MDV CVI988的非必需区基因US片段中，构建带标记的重组质粒，利用同源重组的方法，构建和筛选出能表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒，初步分析了表达M2基因的重组马立克氏病病毒免疫对禽流感病毒的保护性。 采用RT-PCR扩增出H9N2亚型禽流感病毒的M2基因，用OE-PCR的方法缺失了M2跨膜区(27-49aa)，利用原核表达载体分别构建出M2全长基因及缺失跨膜区的M2基因的重组表达载体；将重组质粒转化大肠杆菌(BL21／DE3)诱导表达；表达产物经SDS-PAGE，Western-blotting检测，并用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱纯化蛋白；以纯化蛋白免疫小鼠制备的血清与感染H5N1亚型AIV毒株的MDCK细胞进行免疫荧光试验。结果表明，缺失跨膜区的M2基因得到了高效表达，重组蛋白表达量约达22％，表达产物在大肠杆菌中以可溶性形式存在；重组蛋白可与H5N1亚型AIV阳性血清特异性地结合，以重组蛋白制备的小鼠血清又能与感染了H5N1亚型AIV的MDCK细胞特异反应，表明重组蛋白具有良好的抗原性。 金刚烷胺可抑制禽流感病毒M2蛋白的毒性。将含重组全长M2基因及缺失跨膜区的M2基因的原核表达质粒的大肠杆菌(BL21／DE3)分别诱导表达。在IPTG诱导的同时，加入不同浓度的金刚烷胺。结果表明，融合表达缺失跨膜区的M2蛋白的大肠杆菌BL21／DE3生长受到抑制。金刚烷胺既不能促使含M2全长基因的重组质粒在大肠杆菌中表达，也不能增强含缺失跨膜区的M2基因重组质粒的表达工程菌的生长能力。 利用纯化的融合蛋白免疫Balb／c小鼠，以M2融合蛋白和GST分别作为ELISA抗原然后选择M2融合蛋白抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆筛选，制备出4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3和5D2。ELISA结果表明，制备的单抗能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应，而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应。IFA和免疫组化试验表明，制备的M2单抗能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞、鸡胚成纤维细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合。 将禽流感病毒M2基因与绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联连接后，插入鸡马立克氏病病毒CVI 988／Rispens株的非必需区US基因中，获得带标记的重组质粒，采用同源重组的方法，构建并筛选到表达禽流感病毒M2基因的重组MDV。采用PCR、Dot-blotting,Western-blotting等分析表明，禽流感病毒M2基因正确插入到MDVCVI988基因组中并获得表达。表达M2基因的重组MDV免疫1日龄SPF鸡后21天，用ELISA方法可检测到M2蛋白的特异性抗体。
李永清, 杨敬, 罗长保, 周雪媚, 张莉[2]2007年在《表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建》文中提出将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDVCVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、dot blotting,Western blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1(CVI988)基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIVA/Chicken/Guangdong/00(H9N2)攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。
马诚太[3]2014年在《不同启动子和插入位点表达AIV-H9 HA抗原的重组马立克氏病病毒的构建和比较研究》文中研究说明马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus, MDV) GX0101株是我们实验室在2001年从广西某鸡场中分离到一株带有禽网状内皮组织增生症病毒（REV）长末端重复序列（LTR）的1型MDV GX0101，其致病型为超强毒。将该毒株构建成细菌人工染色体（BAC）克隆，并在此传染性克隆的基础上进行了一系列的研究。其中敲除了GX0101两个致肿瘤基因Meq，构建了Meq缺失株GX0101ΔMeq，通过动物实验证明该突变株不仅失去了鸡群的致病性和免疫抑制，而且还可以对鸡群起到很好的保护性免疫作用，其保护效果要超过CVI988疫苗。本研究在GX0101ΔMeq的基础上，将该突变株作为载体表达H9N2禽流感病毒的HA基因，构建了不同的重组病毒并对这些重组病毒进行了体外和体内的研究。1抗H9N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H9N2-HA真核表达载体的构建本研究中构建了9株以GX0101ΔMeq为载体表达H9N2-HA的重组病毒。为了验证重组病毒中HA基因在体外的表达，首先制备了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗体，用于后续研究中HA基因在重组MDV表达的检测。然后又构建表达H9N2-HA的重组病毒，首先我们需要构建能够在真核系统中表达HA基因的真核表达质粒。将整段HA基因的ORF克隆到以CMV为启动子的真核表达载体pcDNA3.1（-）中，并将该真核表达质粒转染CEF细胞，以上述制备的HA抗体作为一抗用IFA验证真核表达质粒中HA在CEF中的表达。结果显示,IFA可以检测到CEF细胞中HA蛋白的存在，证明本研究中构建的HA真核表达质粒能够成功表达HA基因，可以用于后续研究。2应用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统以两步重组法构建一株以GX0101ΔMeq为载体表达H9N2-HA基因的重组病毒rGX-CMV-HA本部分研究主要解决构建重组MDV的方法学问题。我们的研究先后尝试了不同方法用于构建重组MDV，这些方法包括真核细胞上的同源重组、在BAC系统中的RedE/T重组（应用Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒）、在BAC中利用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统，经过近1年半的时间对构建重组MDV的方法学的探索，我们建立一种非常方便的构建重组MDV的方法。首先在HA基因表达盒前引入Kanr抗性筛选基因，然后利用RedE/T重组系统在大肠杆菌EL250中将这段带有抗性筛选基因的HA表达盒作为外源插入片段整合到GX0101ΔMeq载体质粒上，再利用Flp/FRT重组系统在L-阿拉伯糖的诱导下将Kanr抗性筛选基因从重组子中敲除掉。将通过验证完全敲除了Kanr抗性筛选基因的重组质粒prGX-CMV-HA从EL250大肠杆菌中提取出来，转染CEF细胞拯救病毒，并通过IFA验证重组病毒中HA基因的表达。结果表明，通过这种两步重组法，我们成功获得了重组病毒rGX-CMV-HA，并且IFA验证HA基因在重组病毒感染的CEF中成功表达。3以GX0101ΔMeq为载体的重组MDV中不同启动子转录H9N2-HA基因的活性比较为了研究不同的启动子在重组MDV中转录HA基因的活性，本研究中以GX0101ΔMeq为载体，利用前期探索的两步重组法，在已经构建好的重组病毒rGX-CMV-HA的基础上又构建了4株不同的重组病毒。这些重组病毒分别用了5个不同的启动子转录HA基因，这5个启动子包含3个内源启动子和2个外源启动子，内源启动子是来自GX0101ΔMeq载体自身的gB基因启动子(gB)和另一个来自GX0101ΔMeq载体自身的位于PP38和1.8kb RNA转录子之间的双向启动子的两个方向，即PP38方向（pPP38）和1.8kb RNA转录子方向（p1.8kb）。外源启动子分别为CMV启动子和SV40启动子。我们对这5个不同的重组病毒进行了体外和体内的比较研究，结果显示，在细胞培养中,重组病毒rGX-CMV-HA中HA基因转录水平最高， rGX-SV40-HA和rGX-p1.8kb-HA两者转录外源基因的能力几乎在同一水平，其他两个内源启动子pPP38和gB在重组病毒中转录HA基因的水平较低，其中rGX-pPP38-HA处在最低的水平。双向启动子的两个方向pPP38和p1.8kb的转录水平差异较大，rGX-p1.8kb-HA的转录水平要明显超过rGX-pPP38-HA转录HA的水平。动物实验证明，5个重组病毒均可以在体内复制，但均不能诱发机体产生抗体， rGX-CMV-HA， rGX-SV40-HA，rGX-p1.8kb-HA均不能对鸡群起到保护效果。而重组病毒rGX-gB-HA的有25%的鸡得到保护，重组病毒rGX-pPP38-HA可以给感染鸡提供50%的保护。4重组病毒中GX0101ΔMeq载体上的不同插入位点对表达HA外源基因的影响为了研究GX0101ΔMeq载体上的不同插入位点对表达HA外源基因的影响，我们根据不同启动子在重组GX0101ΔMeq中转录HA基因活性大小的研究结果，选择处于中等转录活性强度的双向启动子的1.8kb转录子方向（p1.8kb）作为启动子转录HA基因，同时选择了GX0101ΔMeq载体上病毒复制非必须区US2、US10、Meq以及BAC骨架上的gpt基因位点作为靶位点，分别将HA表达盒整合到这些区域，将这些构建的重组病毒rGX-US2-HA，rGX-US10-HA，rGX-Meq-HA和rGX-gpt-HA感染CEF细胞，利用ELISA和荧光定量RT-PCT分别研究这些病毒在细胞培养上表达HA蛋白水平和转录mRNA水平的差异。通过接种鸡的实验研究这些不同重组病毒对鸡群的保护效果。结果显示，在细胞培养上，在GX0101ΔMeq载体上的不同位点表达外源HA基因无论是在蛋白水平还是在mRNA水平上都有差异，在US2区表达外源基因的活性最强，其次是US10和Meq区，我们所选择的外源插入gpt位点表达HA基因的能力最弱。体内试验结果显示，4株重组病毒均可以在体内复制，但是都不能诱发可检测到的血清中针对H9N2的抗体。重组病毒rGX-US2-HA、rGX-US10-HA和rGX-gpt-HA对SPF鸡没有任何保护效果，但重组病毒rGX-Meq-HA对H9N2人工感染鸡有60%的保护作用。
张振杰[4]2014年在《共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较》文中进行了进一步梳理马立克氏病毒(Marek′s disease virus, MDV)是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR)的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)克隆，并构建了敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒。该基因缺失性MDV不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本文利用敲除meq基因的GX0101株MDV作为载体表达AIV-H9N2和NDV主要保护抗原基因，构建了2株敲除meq致肿瘤基因且同时表达2种不同外源基因的重组MDV。通过体内和体外连续传代分析这些重组MDV在细胞水平和动物体内的复制能力、探讨插入片段在重组MDV基因组中的稳定性、通过免疫SPF鸡这些重组MDV在体内诱导鸡的免疫应答的能力，从而为研发用于预防MDV和H9N2更好的疫苗提供候选疫苗株及相关的技术支持。研究主要从以下几个方面展开:1.荧光定量PCR检测1型MDV在不同感染阶段各组织中病毒含量的变化和分布。感染马立克病毒的鸡持续携带病毒一段时间后，可以增加器官肿瘤的发生率和提高横向传播的能力。鸡的马立克病毒含量与恶性肿瘤的发生率和作为感染性病毒的颗粒的唯一来源的羽毛囊上皮细胞中病毒传播水平呈有正相关的关系。本研究建立了一种SYBR Green双重实时荧光定量PCR的方法，通过选择病毒的meq基因和管家基因-鸡卵铁转蛋白ovo来检测和量化发病鸡的马立克病毒的含量和不同组织病毒的分布。研究中分别用马立克基因组的BAC克隆，BAC-GX0101和携带管家基因-鸡卵铁转蛋白特异性基因片段的质粒(pMD18T-ovo)来定量病毒和宿主基因组。该方法具有1-8logs动态变化范围，其变化的平均值的批间和批内系数小于2%，并且MDV最小的检测含量为10拷贝。利用该方法绝对定量检测感染1000PFU的SDWJ1302菌株发病鸡的分别于7、14、21、28、40、60和90天取不同样品组DNA，空白组的鸡也作同样处理，并与常规的PCR检测方法的灵敏度进行比较。结果表明，感染鸡的免疫器官在感染7天后就可以检测到马立克基因的拷贝数，鸡的血液和不同器官在感染28天后是检测到马立克基因拷贝的高峰期，但40天后逐渐下降。在淋巴细胞，肝脏和脾脏的病毒载量水平均高于其它器官，并且在不同阶段羽毛囊上皮细胞的含量最高。研究数据进一步证明涉及病毒感染的多器官和免疫器官的主要分布，从而导致免疫抑制和免疫细胞的转化。这是首次对早期潜伏感染和发病后阶段的不同组织和器官的马立克基因组的拷贝数进行了绝对定量，应用此方法能有利于促进我们对马立克氏病的发病机机理、传播、诊断、遗传特性和疫苗控制的进一步认识。2.共表达H9N2-NA和NDV-F的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究本实验室以前的研究报道表明，在马立克氏病病毒(MDV)基因组的pp38基因和1.8kb mRNA之间的305bp是一个双向启动子，分别启动MDV的1.8kb mRNA转录子和pp38基因的表达（两个方向作用的启动子分别P1.8kb和Ppp38表示），该双向启动子可被MDV自身表达的pp38/pp24二聚体作为反式转录因子激活。为了构建能同时表达禽流感病毒H9N2株的NA基因和鸡新城疫病毒(NDV)的F基因的meq基因缺失型重组I型MDV，首先以真核表达性质粒pcDNA3.1为骨架，构建了重组表达性载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。在该质粒中，NDV-F基因位于双向启动子上游，由P1.8kb启动；AIV-NA基因位于该双向启动子下游，由Ppp38启动。为了提供作为反式转录因子pp38/pp24二聚体，将重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F与包含pp38/pp24表达质粒pBud-pp38-pp24共转染CEF。用针对NDV-F和AIV-NA的小鼠血清，对转染细胞做间接免疫荧光反应（IFA），证明了在重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F中该双向启动子确实可同时调控这两个外源基因的表达。为了将NA和F基因共表达盒插入MDV US2的非必要区，分别将MDV插入位点两侧序列并作为同源重组的两同源臂整合到NA和F基因共表达盒的两侧，构建成转基因重组载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。PCR扩增同源重组大片段，将敲除了meq基因的GX0101(GX0101Δmeq)作为亲本病毒,在EL250大肠杆菌中通过同源重组将NA和F基因共表达盒插入GX0101Δmeq的US2非必要区，构建并筛选到重组MDV (MZC13NA/F)。IFA、ELISA和免疫印迹分析表明，重组病毒MZC13NA/F可在双向启动子的控制及MDV自身pp38/pp24二聚体激活下同时表达NDV-F和AIV-NA基因。MZC13NA/F的体外生长特性也说明，MZC13F/NA与其亲本病毒GX0101的CEF无显着差异。同时也表明,在1.8-kb mRNA转录方向的启动子活性高于pp38基因方向。用MDV的这个自身双向启动子构建并成功同时表达二个外源基因的重组MDV，不仅表明它可以作为一个有潜在利用价值的启动子，而且可在构建的重组MDV中减少外源DNA的插入。3.共表达H9N2-HA和-NA的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究为了构建能够表达来源于低致病性禽流感H9N2HA和NA，将野毒株GX0101作为亲本毒，通过同源重组的方法将强启动子CMV和SV40分别启动HA和NA共表达的串联大片段插入到GX0101基因组的meq位点取代meq基因，得到的病毒命名为MZC12HA/NA。体外进行rMDV和亲本毒GX0101生物学活性比较发现MZC12HA/NA与GX0101在CEF细胞的生长动态无明显差异。Southern bolt表明共表达盒成功插入到meq基因的双拷贝位点，meq基因完全被敲除。RT-qPCR显示HA和NA的mRNA转录水平显着高于MDV自身pp38mRNA的转录。ELISA检测显示HA和NA蛋白的表达也远远高于pp38蛋白的表达。IFA和western bolt分析表明HA和NA能够同时表达，且检测不到meq基因的表达。结果表明，作为AIV-H9N2与MDV重组得到的MZC12HA/NA致肿瘤meq基因被删除，且能够高水平表达H9N2的抗原基因HA和NA。4.同时表达AIV-H9N2的HA和NA基因的MZC12HA/NA重组MDV的免疫原性MZC12HA/NA免疫SPF和海兰褐鸡，在鸡体内均能良好地复制，但复制能力弱；重组病毒免疫SPF鸡后能诱导滴度为2.0左右的H9N2抗体；重组病毒和H9N2对海兰褐的免疫应答有明显协同作用；免疫后SPF鸡H9N2的排毒实验，对H9N2的保护率为30%-35%，所以该重组病毒将来可能应用于抵抗MDV和H9N2感染的重组疫苗的筛选。
叶染枫[5]2012年在《八种禽类病毒基因芯片检测技术初步研究》文中提出家禽养殖是我国畜牧业的重要支柱,随着养殖业的快速发展,各种禽类疾病特别是传染性的病毒疾病不断出现,严重的困扰着我国家禽养殖业的健康发展。新城疫、禽流感、禽传染性支气管炎、禽传染性法氏囊病、禽白血病、马立克氏病、禽痘以及减蛋综合症是禽养殖业中八种重要的病毒性疾病。建立这八种病毒的检测技术,来加强对这些病毒引起的禽病的流行动态及分布研究,对于有效的预防这些病毒性疾病,促进家禽养殖的健康发展,减少其经济损失具有极为重要的意义。DNA微阵列是上世纪90年代出现的一种基于核酸杂交的检测技术,具有具有高通量,快速,微量化,平行化等其他技术无法比拟的特点,被广泛的应用于致病微生物的快速诊断上。本论文希望针对这八种禽类病毒建立DNA微阵列检测技术,为禽病的防治和诊断提供有效手段和技术措施。本论文首先根据马立克氏病毒、禽痘病毒以及减蛋综合症病毒这叁种DNA病毒的基因保守序列,设计引物,PCR扩增叁种病毒基因保守片段并克隆后,将单酶切产物作为捕捉探针。将捕捉探针以高温烘烤结合紫外交联的方式固定在尼龙膜上。再通过多重PCR掺入Cy5-dCTP对待检标本中叁种DNA病毒进行标记。与固定在尼龙膜上的捕捉探针进行杂交。杂交完毕后再用Odyssey近红外成像系统中检测结果。结果表明叁种病毒检测灵敏度在104拷贝至105拷贝之间。该方法不仅可以对单一病毒进行检测,而且对两种病毒或叁种病毒混合感染也能同步进行检测。再根据新城疫病毒、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒这五种RNA病毒的基因保守序列,设计引物,RT-PCR扩增五种病毒基因保守片段并克隆后,将单酶切产物作为捕捉探针。将捕捉探针以高温烘烤结合紫外交联的方式固定在尼龙膜上。再通过多重RT-PCR掺入Cy5-dCTP对待检标本中五种RNA病毒进行标记。与固定在尼龙膜上的捕捉探针进行杂交。杂交完毕后再用Odyssey近红外成像系统中检测结果。结果表明该方法不仅可以对单一病毒进行检测,而且对两种到五种病毒的混合感染也能同步进行检测。
赵冬凤[6]2008年在《表达H_5N_1亚型禽流感病毒HA及NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建》文中指出禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起禽类的一种急性,烈性传染病,它的流行与暴发给养禽业造成了巨大的经济损失。寻找安全有效的AIV疫苗是众多学者研究的热点,近年来随着基因工程的研究进展,基因工程疫苗已经成为防治该病的主要手段。本研究根据GenBank已经发表的H_5N_1亚型禽流感病毒(Aivan influenza virus,AIV)具有免疫原性的血凝素(haemagglutini,HA)基因和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因序列,设计合成引物,利用RT-PCR方法扩增出了HA和NA基因,将其克隆于表达质粒T_(md)-CMV-IRES-EGFP中,从而得到新的质粒T_(md)-CMV-HA-IRES-NA-EGFP,使HA和NA基因位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联。从感染火鸡疱疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)的次代鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总基因组,选择病毒的非必须区US_(10)区为外源片段的插入区域,根据GenBank已经发表的US_(10)区基因序列,分别设计同源臂两侧的引物,以HVT的总基因组为模板用PCR的方法获得US_(10)~1和US_(10)~2片断。按照PMD18-T载体的说明将US_(10)~1和US_(10)~2分别克隆到PMD18-T载体中,从而得到新的质粒PMD18-T-US_(10)~1和PMD18-T-US_(10)~2.将质粒PMD18-T-US_(10)~1和PMD18-T-US_(10)~2分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切,将US_(10)~1克隆于PMD18-T-US_(10)~2中,从而得到新的质粒命名为pUS_(10).将上述质粒T_(md)-CMV-HA-IRES-NA-EGFP和pUS_(10)用限制性内切酶StuⅠ和BssHⅡ酶切,将串联基因CMV-HA-IRES-NA-EGFP插入到HVT基因的非必需区(US_(10))中,从而构建了带标记的重组转移质粒并命名为pUS_(10)-CMV-HA-IRES-NA-EGFP.将该转移载体质粒与感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取的全细胞DNA,利用脂质体转染的方法共同转染次代CEF,待病毒蚀斑出现后,铺营养琼脂进行培养,利用挑斑和有限稀释的方法筛选带有绿色荧光的病毒蚀斑,进行数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。本实验运用回收,转化,质粒提取等多种分子生物学实验技术获得了表达禽流感HA和NA基因的重组火鸡疱疹病毒,为今后禽流感基因工程苗的研究奠定了坚实的基础。
参考文献：
[1]. 禽流感病毒M2基因克隆、表达及其重组马立克氏病病毒的构建[D]. 李永清. 中国农业大学. 2004
[2]. 表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建[J]. 李永清, 杨敬, 罗长保, 周雪媚, 张莉. 中国生物工程杂志. 2007
[3]. 不同启动子和插入位点表达AIV-H9 HA抗原的重组马立克氏病病毒的构建和比较研究[D]. 马诚太. 山东农业大学. 2014
[4]. 共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较[D]. 张振杰. 山东农业大学. 2014
[5]. 八种禽类病毒基因芯片检测技术初步研究[D]. 叶染枫. 华中师范大学. 2012
[6]. 表达H_5N_1亚型禽流感病毒HA及NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建[D]. 赵冬凤. 河北农业大学. 2008
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