【摘要】 中国药典2005年版未规定检查维生素C原料药中的细菌内毒素[1]，而新版药典2015年版要求检查该原料的细菌内毒素[2]。方法：每1mg维生素C综合含毒素的量应小于0.02EU。此方法中的碳酸钠适量，是要让操作者根据自己的实际情况摸索出一个科学合理的加量，为此，我们进行了如下实验，来摸索碳酸钠所加量的真实值。结果：供试品称量为0.5g碳酸钠取0.2g，能保证较好的试验结果。结论：该批原料药维生素C细菌内毒素符合规定。
在试验中，首先要明确碳酸钠加入维生素C原料中的作用，它一个使调节溶液的pH值，另一个使起缓冲剂的作用；再者要求加入碳酸钠的供试液不能与所用的鲎试剂有干扰，否则试验将失败。
【关键词】原料药；细菌内毒素。
【中图分类号】R961 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）11-0391-01
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分[3]，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。内毒素通过注射等方式进入血液时会引起不同的疾病。内毒素小量入血后不造成机体损害。但大量进入血液就会引起发热反应—简称“热原反应”。因此，注射用药剂、疫苗类、化学药品类、生物制品类、抗生素类、放射性药物、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
自1982年美国药典修订1980年(20)版首次收载的细菌内毒素试验，内毒素单位(EU)被正式引入，明确指出美国内毒素参考标准品每瓶含10000EU。1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。USP版ng跟EU通过RSE/CSE的比率进行转化。其比率附在COA证书中。CSE与所使用的鲎试剂一一对应。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。本实验利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素[4]，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。本实验就用凝胶法检查维生素C原料药中的细菌内毒素。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价[5]，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。为确保试验过程无其他微生物污染，试验所用的器皿需经干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
1.仪器与试药
1.1 仪器
分析天平（常州电子天平厂），37℃恒温水浴箱（北京永光明医疗器械厂），漩涡混合器（江苏海门其林医用仪器厂）。
1.2 试药
鲎试剂（灵敏度0.025 EU/ml,批号：1511021）、检查用水（批号：1509150）、内毒素标准品（批号：150601-201580），以上试剂由广东湛江安度斯生物有限公司；碳酸钠（分析纯）、维生素C（批号：1160272032-085 ，石药集团维生素药业有限公司/陕西博华医药有限公司）。
2.方法与结果
2.1 供试品细菌内毒素检查法
凝结限量法。
2.2 供试品溶液的制备
原料药维生素C的细菌内毒素限值L为0.02 EU/mg，原料药最大有效稀释倍数MVD取1，根据MVD=CL/λ,计算出供试品最小稀释浓度C=λ/L=0.25/0.02=12.5(mg/ml)。
精密称取维生素C0.5g，分别加N个Xg碳酸钠置于三角瓶中(170℃加热4小时以上)，加水2ml溶解至完全，按照下式稀释制备供试品溶液。
250mg/ml → 25mg/ml → 12.5mg/ml
2.3 结果
结果如表2.1所示。
表2.1 维生素C原料药中细菌内毒素的检查结果
3.分析与讨论
3.1 从试验结果看，供试品称量为0.5g碳酸钠取0.2g，能保证较好的试验结果。
3.2 在试验中，溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振摇，以避免产生气泡；由于凝集反应是不可逆的，在试验中观察结果时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液应同时进行，并在实验有效的情况下，才能进行计算和判断。
3.3 实验操作应在洁净环境中进行（最好在万级环境），以防止微生物的污染。
【参考文献】
[1]《中华人民共和国药典2005版第二部》.
[2]《中华人民共和国药典2015版第二部》.
[3]胡文滨.无菌产品细菌内毒素的控制[J].河北省科学院学报，2010年.
[4]田祥学.细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用[J].中国医药指南，2015年.
[5]易辉君.人类外周血免疫细胞体外培养标准操作规程的建立和个体化差异研究[J].中南大学，2013年.
论文作者:师宇
论文发表刊物:《医药前沿》2017年4月第11期
论文发表时间:2017/5/3
标签：内毒素论文; 细菌论文; 碳酸钠论文; 试剂论文; 维生素论文; 原料药论文; 药典论文; 《医药前沿》2017年4月第11期论文;