顾继杰[1]1996年在《神经生长因子低亲和力受体克隆，表达及其诱导细胞凋亡的分子机制研究》文中提出细胞凋亡的研究最近几年成为生物医学领域人们关注的新热点之一，它是脊椎动物发育过程中组织成形和细胞数目维持稳态的中心机制，细胞凋亡与有机体的很多重要的生理和病理过程关系密切，它为某些人类疾病的控制与治疗提供了一种崭新的思路，细胞凋亡是区别于细胞坏死而言的，坏死是细胞遭遇有害环境和有毒物质而发生的一种病理过程，坏死的细胞从形态上看首先发生细胞器特别是线粒体的肿胀，细胞器的裂解和质膜的破裂最终导致了胞内物质外泄从而引起炎症反应，核的变化很小，从生化特征看，坏死的细胞DNA被降解成连续大小的碎片，电泳分析呈现模糊的一片，而细胞凋亡则是一种主动的细胞死亡形式，形态上首先发生核和胞质的浓缩，继而染色质着边。合并成一块或几块，最终被降解为膜包裹的染色质碎片即凋亡小体，通常不引起炎症反应，从生化特征看，染色体DNA被降解成核小体单位的整数倍，电泳分析DNA呈现180-200bp整数倍的梯形带 在脊椎动物的神经系统发育过程中，大约50％的感觉神经元和交感神经元由于得不到足够的神经营养因子，形成不了正确的突触连接而死亡，死亡细胞呈现凋亡细胞的特征：(1) 它可以被神经营养因子或传入的电输入所阻止。(2) DNA被降解成200bp整数倍大小的片断。(3)在细胞死亡过程中，至少是部分细胞死亡过程中观察到了凋亡细胞的形态变化。(4) 大分子合成抑制剂如放线菌素D或环已酰胺可以阻止细胞的死亡，细胞凋亡广泛地发生在神经系统的其它细胞中，它也可在有丝分裂后的神经细胞中由一系列刺激因子而引发，最近研究表明某些亚群的神经元细胞的死亡可能与神经系统的退行性病变有关。因此研究神经系统的凋亡机制有助于我们理解神经网络是如何形成的。以及神经退行性病变和大脑衰老是如何发生的。为最终治疗某些神经系统
高鹏, 王欣, 陈虹, 黄秉仁[2]2003年在《神经生长因子低亲和力受体(p75NTR)的模拟配基的筛选》文中指出人神经生长因子低亲和力受体 (p75NTR)转染R2细胞而建立的R2L1细胞 ,在去血清培养时发生凋亡 ,该作用可被神经生长因子 (NGF)所抑制 .用R2L1和R2两种细胞差式筛选噬菌体随机 7肽库和 1 2肽库 ,获得和p75NTR特异结合的噬菌体 .测定DNA序列后得到有关多肽的氨基酸序列 .7肽库共有序列为C (H D)LP(K M)HPM C ;1 2肽库优势序列为TLPSPLALLTVH .化学合成相应的 2个短肽 .用细胞结合法和ELISA方法证实阳性噬菌体和合成短肽能与p75NTR结合 ,并证实了它们对R2L1细胞去血清培养后的凋亡有抑制作用
李博[3]2017年在《神经生长因子对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及相关机制研究》文中提出卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌,严重危害女性的生命健康。卵巢癌是高度异质性肿瘤,组织学亚型较多,不同类型的卵巢癌在形态特征、临床表现、遗传改变、肿瘤行为等方面均表现出一定的差异,且难以在早期发现,易发生转移、化疗耐药、复发,使卵巢癌的诊断和治疗都面临着极大的挑战。卵巢癌的致病机理十分复杂,至今仍未完全阐明。一般的观点认为卵巢癌的发生既与卵巢特殊的解剖结构、机械刺激等有关,也与卵巢微环境中生长因子、黏附因子、免疫炎性反应因子等的功能失调而导致细胞内信号分子发生异位、突变、丢失、结构重排等使细胞的正常生长、增殖、分化、凋亡失控而引起细胞恶性转化相连。神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种多效性的肽类激素,通过与靶细胞表面的高亲和力受体TrkA和低亲和力受体P75结合来调控细胞的存活、生长、分化、凋亡等生理活动,对机体正常生理状态和病理发展有重要的影响。近年来的大量研究发现:NGF及受体(Nerve growth factor receptors,NGFRs)在乳腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤等恶性肿瘤中广泛表达,异常表达的NGF/NGFRs影响肿瘤的发生、生长、增殖、分化、侵袭、转移、预后等过程。NGF/NGFRs在正常卵巢组织中低表达,能调节垂体分泌卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)及卵巢上皮表面FSH受体水平、卵泡发育、排卵等卵巢正常生理功能,异常表达的NGF/NGFRs会引起卵泡刺激素分泌紊乱,导致上皮性卵巢癌的启动和发生。但NGF/NGFRs参与卵巢癌的启动、发生、发展及作用机理等方面的知识了解甚少,作用机制尚未完全阐明。因此,深入了解NGF/NGFRs对卵巢癌细胞生物学行为的影响及相关分子机制,对卵巢癌的预防、诊断、治疗、预后等有重要意义。本文的主要研究内容包括:(1)考察NGF/NGFRs在卵巢癌细胞系中的表达。采用定量RT-PCR和Western blot法检测常规培养(含10%胎牛血清的完全培养基)条件下NGF/NGFRs在卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3、CAOV3中的表达情况。结果显示:NGF/NGFRs均同时在这几种卵巢癌细胞中表达,内源性的NGF在OVCAR3、CAOV3细胞中表达水平较高,为后续实验奠定了细胞学基础。(2)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡的影响。采用细胞行为学观察实验、定量RT-PCR、Western blot等方法检测NGF/NGFRs对卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡相关基因和蛋白表达的影响。通过特异性的NGF/NGFRs抑制剂阻断NGF/NGFRs的作用,考察NGF/NGFRs在卵巢癌细胞存活、生长、增殖、细胞周期、生长节律、凋亡中的作用。结果显示:NGF下调CAOV3和OVCAR3细胞中SIRT1(Sirtuin1)、Survivin的表达水平,减弱卵巢癌细胞的存活能力;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中Ki67、PPARδ,下调PCNA的表达水平,抑制卵巢癌细胞的增殖能力;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中Cyclin E1、P21,下调Cyclin D1的表达水平,影响卵巢癌的周期调控,促进卵巢癌细胞的凋亡;NGF下调CAOV3和OVCAR3细胞中Clock、FBXL3的表达水平,影响卵巢癌细胞的生长节律,但具体的生物学效应还需要进一步深入研究;NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中P53、BCL2、Caspase9,下调Caspase3、Caspase7的表达水平,上调CAOV3细胞中CYCS的表达而下调OVCAR3细胞中的CYCS,下调CAOV3细胞中BAX的表达而上调OVCAR3细胞中的BAX,影响卵巢癌细胞的凋亡过程。(3)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞粘附能力的影响。采用细胞粘附实验、定量RT-PCR、Western blot等方法检测NGF/NGFRs对卵巢癌细胞粘附能力、紧密连接相关基因m RNA和蛋白表达的影响。结果显示:NGF上调CAOV3和OVCAR3细胞中紧密连接蛋白CLDN3、CLDN4的表达水平,下调CAOV3细胞中紧密连接蛋白CLDN1的表达而上调OVCAR3细胞中的表达水平,影响卵巢癌细胞间的连接状态,NGF/NGFRs的抑制剂能阻断这种作用。结果表明:NGF/NGFRs能通过调节卵巢癌细胞间的紧密连接状态而参与卵巢癌细胞成团、运动能力的调节。(4)考察NGF/NGFRs对卵巢癌细胞迁移能力的影响及分子机制。利用Transwell小室及本实验室自行构建的微流控芯片考察NGF对卵巢癌细胞迁移行为的影响;通过定量RT-PCR、Western blot法检测NGF对WNT/β-catenin信号通路中的关键因子β-catenin及下游靶基因CD44、C-myc、MMP2、MMP7、TIMP2等表达的影响,考察NGF影响卵巢癌细胞迁移能力变化的分子机制。结果显示:不管是在二维培养还是三维培养条件下,NGF均能影响CAOV3和OVCAR3的迁移能力;NGF对经典WNT/β-catenin信号中的关键分子及下游靶基因的表达有影响,NGF可通过激活或调控WNT/β-catenin信号通路影响卵巢癌细胞的迁移。NGF对不同卵巢癌细胞迁移变化的影响有一定的差异性,说明NGF对卵巢癌细胞的生物学效应有细胞特异性。综上所述,我们得出以下结论:NGF/NGFRs在选择的这几种上皮性卵巢癌细胞系中均表达;NGF能调节卵巢癌细胞的存活、生长、凋亡相关基因的表达水平,影响卵巢细胞的周期和生长节律;NGF能调节卵巢癌细胞中紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4的表达,影响卵巢癌细胞之间的连接状态,参与卵巢癌细胞的转移过程;NGF可通过经典的WNT/β-catenin信号通路介导卵巢癌细胞的迁移行为。以上实验结果表明:NGF/NGFRs对卵巢癌的生物学行为有重要的调节作用,深入研究NGF/NGFRs对卵巢癌细胞的影响有助于阐明生长因子、细胞因子在卵巢癌发生和发展中的作用机制,提高卵巢癌的诊断、治疗水平和预后效果。
陈新[4]2006年在《NGF对肝纤维化大鼠HSCs的促凋亡作用及p75受体的研究》文中指出肝纤维化的形成,主要是由于肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)生成过多、降解相对不足,在肝内大量沉积所致。HSCs是肝纤维化形成过程中合成ECM的最主要细胞。HSCs的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节。因此,抑制HSCs增殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要策略。正常肝和各种肝病均存在不同程度的细胞凋亡和增殖。肝纤维化时,HSCs数量显著增多,肝纤维化恢复期,凋亡的HSCs显著增多,凋亡与增殖保持着机体相对稳定的对立统一,在肝纤维化的形成和逆转中起关键作用。肝纤维化的形成是一缓慢而复杂的过程,肝脏受到外界刺激后引起细胞因子释放,细胞因子-细胞-细胞外基质间相互作用,使肝脏ECM代谢紊乱,在Disse间隙过度沉积,继之,肝窦毛细血管化,是肝纤维化的分子病理学基础。近年来,Trim等将100ng/mL NGF与HSCs共同培养24小时后,发现凋亡HSCs数量显著增加,呈剂量依赖关系,而对HSCs增殖不产生影响,指出NGF对体外培养活化的HSCs凋亡有诱导作用,提示其作用机制可能包括NGF及p75的作用。但在HSCs与NGF、p75的关系和作用机制以及NGF在肝组织的表达和促HSCs凋亡作用方面,国内尚无报道;在寻找新的HSCs增殖抑制剂并与NGF联合应用及其机制方面,国内外均未见报道。我们结合整体和离体实验,对肝纤维化患者和大鼠,在细胞、分子和蛋白水平上,从NGF在大鼠纤维化肝组织的动态表达、NGF受体p75在HSCs的表达分布、NGF促HSCs凋亡的作用机制以及寻找新的HSCs增殖抑制剂并与NGF联合应用及其作用机制等方面进行研究。实验内容主要包括以下三部分:第一部分大鼠肝纤维化组织NGF及p75的表达分布与HSCs增殖、凋亡的关系目的:探讨大鼠肝纤维化形成过程中NGF及p75的表达分布与
李巧玉[5]2011年在《神经生长因子在人脑胶质瘤中的表达特点及其临床意义》文中指出研究目的：观察神经生长因子(NGF)在星形胶质瘤组织及脑脊液标本中的表达特点,探讨其在胶质瘤诊断及预后判断中的临床意义。并利用NGF在胶质瘤中特异性核转位的现象,以NGF为“载体”,125Ⅰ为“弹头”,制备细胞核靶向抗胶质瘤药物125Ⅰ-NGF并评价其对U251细胞的杀伤作用。研究方法：(1)收集94例星形胶质瘤组织及术前脑脊液标本,通过免疫组织化学染色观察NGF在胶质瘤细胞中的核阳性表达,并采用ELISA法定量检测胶质瘤组织及脑脊液中NGF的表达水平,进一步通过免疫印迹分析,观察胶质瘤组织及脑脊液中所表达的NGF的分子形式。收集患者临床资料,随访患者预后,分析NGF的核阳性表达与胶质瘤病理分级及预后的相关性。(2)为了探讨NGF的核阳性表达是否具有胶质瘤细胞特异性,进一步对颅内最常见的良性肿瘤——脑膜瘤进行NGF免疫组织化学染色并随访患者的复发情况。探讨NGF核阳性表达与Ki67和PR阳性表达及患者预后的相关性。(3)采用联结标记法将俄歇电子发射体125Ⅰ与NGF进行偶联得到125Ⅰ-NGF。通过平板克隆形成试验观察给药后U251细胞的增殖能力、流式细胞仪检测各细胞周期细胞比例、彗星试验及微核形成试验观察胶质瘤细胞DNA损伤情况,评价125Ⅰ-NGF对U251细胞的杀伤作用。研究结果：(1)NGF在星形胶质细胞瘤中高表达,分布于细胞浆及细胞核。在对照组脑组织中NGF主要定位于细胞浆。(2)Ⅲ-Ⅳ级星形胶质瘤中NGF和核阳性率为70.0%,显著高于Ⅰ-Ⅱ级星形胶质瘤(28.6%,P<0.05)。NGF核阳性率与胶质瘤病理分级正相关(r=0.307,P<0.05)。NGF核阳性率与Ki67阳性率正相关(r=0.526,P<0.05)。生存分析结果提示：在Ⅰ-Ⅱ级星形胶质瘤患者中,NGF核阳性及NGF核阴性表达患者的中位无进展生存期(PFS)分别为25和42月(P<0.05)。在Ⅲ-Ⅳ级星形胶质瘤患者中,NGF核阳性及NGF核阴性表达患者的PFS分别为7和24月(P<0.05)。(3)胶质瘤组织及脑脊液中NGF表达水平高于对照组,高级别胶质瘤中NGF表达水平高于低级别。在胶质瘤组织中存在13和36 kDa两种分子形式的NGF表达,但脑脊液中仅有单一分子形式的36 kDaNGF表达。NGF核阳性率与脑脊液中NGF表达水平正相关(r=0.755,P<0.01)。(4)NGF核阳性率与脑脊液中36 kDa NGF的表达量呈正相关(r=0.755,P<0.01)。NGF核阳性率与胶质瘤组织提取液中NGF含量无显著相关(r=0.159,P=0.125)。(5)Cox回归分析结果：胶质瘤病理分级、NGF核阳性表达及脑脊液中NGF表达量与胶质瘤患者预后显著相关(P<0.01)。(6)对脑膜瘤组织的NGF免疫组织化学染色结果表明：NGF在脑膜瘤中亦存在核阳性表达,NGF核阳性率与Ki67阳性率正相关(r=0.741,P<0.01),与PR阳性率呈负相关(r=-0.59,P<0.01)。NGF核阳性及NGF核阴性组患者的PFS分别为36±2.484和59±2.295月,差异具有显著性(P<0.01)。(7)通过联结标记法将放射性核素125Ⅰ与NGF偶联得到的产物125I-NGF在体外性质稳定,对U251细胞的最低有效浓度为：592kBq/ml。在此浓度下,125Ⅰ-NGF可以进入细胞核,损伤靶细胞DNA。125I-NGF处理组U251细胞克隆形成率(0.02±0.01)显著低于对照组(0.33±0.02)(P<0.01)。流式细胞仪分析结果提示：125I-NGF处理组U251细胞S期细胞比例为10.69±0.02,较对照组35.47±0.02显著下降(P<0.01)。结论：(1)尽管NGF核阳性表达不具有胶质瘤细胞特异性,在脑膜瘤等良性脑肿瘤中亦呈核阳性表达,但NGF核阳性表达均与Ki67阳性率正相关,与患者不良预后密切相关。NGF核阳性表达作为反映肿瘤细胞增殖活性的指标。(2)胶质瘤患者脑脊液中NGF表达水平与NGF核阳性表达及患者预后密切相关。由于脑脊液取材方便,可以反复取材。结合影像学检查结果,动态监测脑脊液中NGF表达水平可以反映胶质瘤病情活动性及治疗效果。(3)根据NGF在胶质瘤、脑膜瘤等高增殖肿瘤细胞中特异性核表达的特点,以NGF为“载体”,偶联俄歇电子发射体125Ⅰ为“弹头”制备的细胞核靶向化疗药物125I-NGF可以特异性杀伤S期U251细胞。
李东朋[6]2016年在《昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变及NGF治疗影响的实验研究》文中研究表明研究背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)发病率,致死率及致残率高,给社会带来极大的负担。根据TBI病理生理过程分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤在损伤后立即导致脑组织挤压变形,脑血流中断或者改变、神经元和胶质细胞毁损而死亡,这些损伤无法通过临床措施实施干预,只能加强预防。继发性损伤在原发性损伤后立即开始直至持续数月,局部神经化学变化引起一系列生化改变,细胞损伤与修复,增殖与凋亡,代谢改变相互作用进而出现细胞生命终结事件。继发性脑损伤的病理生理机制复杂,深入理解影响脑损伤的病理因素,对于TBI的病理理解及治疗将会带来新的启示。研究证实自然界哺乳动物血压、神经内分泌激素分泌、睡眠觉醒周期、体温、尿量变化、褪黑素及生长因子、进食等各种生理、生化、代谢过程都遵循着大约24小时的周期性变化,称为昼夜节律(circadian rhythms)。昼夜节律是各种生物对环境因素循环变化长期适应和演化的结果,其广泛存在各种有机生命中,是自然界中重要的生命现象。昼夜节律基因调控包括神经干细胞在内的多种细胞增殖,参与修复重建、参与细胞周期进程、影响神经递质释放及神经可塑性。目前越来越多的流行病学和遗传学数据显示昼夜节律紊乱与多种疾病发生、发展及药物治疗效果密切相关,这些疾病包括认知功能障碍、痴呆及帕金森、心血管系统心绞痛、脑血管意外发生、代谢综合征及胰岛素抵抗、乳腺癌及药物治疗抵抗等。在脑损伤后患者面临环境及病理损坏的影响,昼夜节律紊乱经常发生。动物实验及临床研究表明脑损伤后昼夜节律基因表达失衡,因此我们推测昼夜节律调控大脑神经功能,参与病理损伤过程,但是如何参与及潜在的病理机制尚不明确;同时研究发现昼夜节律参与细胞周期进程,影响胰岛素,糖皮质激素及抗肿瘤药物的药物空间分布及药理效果。在神经保护治疗措施中,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)能够促进神经细胞生长、分化,促进损伤细胞修复,NGF发挥生物学效应必须经过其自身特异性受体介导,迄今主要发现两种NGF受体:高亲和力受体(Trk A)和低亲和力受体(p75)。NGF与高亲和力受体Trk A结合,发挥正性调节作用,维持神经元生长、发育、分化,促进损伤神经元修复;与低亲和力受体p75结合发挥负性调节作用,诱导细胞凋亡。研究发现Trk A和p75在脑组织中的表达受到昼夜节律的调控,呈现24h节律模式。但是在昼夜节律紊乱环境下,对NGF治疗影响鲜见报道,我们提出假设在脑损伤状态下昼夜节律紊乱影响Trk A、p75受体表达进而影响NGF治疗效果。因此本研究将探讨昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变及对NGF治疗效果的影响。我们首先建立大鼠脑损伤动物模型,采用灯光持续照射导致大鼠昼夜节律紊乱,连续干扰14天,观察大鼠行为学、学习记忆能力的变化,观察对细胞生存及神经再生的影响;在脑损伤昼夜节律紊乱的基础上给与NGF治疗,检测NGF受体表达及凋亡信号基因蛋白改变,明确星形胶质细胞及小胶质细胞在昼夜节律紊乱下对炎症因子分泌的影响。本研究为通过外界环境影响脑损伤的预后,为我们临床治疗提供新的思路,同时也对NGF治疗效果优化有重要启示。第一部分昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变的影响目的:观察昼夜节律紊乱对脑损伤病理改变及海马神经再生的影响材料与方法:制备大鼠颅脑损伤模型,采用正常明暗环境(Light/Dark,LD)和灯光持续照射(Light/Light,LL)两种环境模式(即正常昼夜节律与昼夜节律紊乱),连续干预14天。实验大鼠随机分为4组:正常对照组(Sham/LD)、昼夜节律紊乱对照组(Sham/LL)、脑损伤/正常昼夜节律组(TBI/LD)、脑损伤/昼夜节律紊乱组(TBI/LL),造模后采用Brdu50mg/kg连续注射7天。采用神经功能评分观察大鼠行为学改变;平衡木平衡实验及行走实验检测大鼠运动及平衡能力;水迷宫检测大鼠学习记忆能力改变;14天取脑组织标本,计算脑损伤灶体积;Nissl染色观察损伤区域周围皮质及海马区神经元生存细胞数量;采用Brdu标记新生存活细胞、Ki-67标记增殖细胞、DCX标记新生未成熟神经元细胞,免疫组化测定海马DG区14天时新生细胞存活数量、细胞增殖情况及新生未成熟神经元数量。结果:1.对比各组大鼠体重、饮水及摄食量发现,14天时与Sham/LD组相比,Sham/LL组大鼠体重、摄食量明显增加(P<0.05),饮水量无差异(P>0.05);TBI/LD组与Sham/LD组相比,体重及神经功能评分降低(P<0.05);TBI/LL组与TBI/LD组相比体重、摄食及神经功能评分均降低(P<0.05)。2.平衡木实验及水迷宫实验结果显示与Sham/LL组相比,TBI/LD组平衡运动能力降低,学习记忆能力受到明显损害(P<0.05);TB/LL组大鼠较TBI/LD组大鼠平衡能力、运动协调及认知功能进一步下降(P<0.05)。3.经Nissl染色计算损伤灶体积结果显示TBI/LL组损伤体积明显大于TBI/LD组(34.33±1.58mm3 VS 23.97±2.94mm3,P<0.05);同时TBI/LL组脑损伤区域周围及海马CA1区神经元生存数量减少,但海马DG区细胞数量无明显差异。4.脑损伤后TBI/LD组与Sham/LD组相比,海马DG区Ki-67阳性细胞数量增加,同时Brdu标记新生细胞存活数量也增加(P<0.05);TBI/LL组海马DG区Ki-67阳性细胞数量及Brdu标记新生细胞存活数量较Sham/LD组和TBI/LD组明显减少(P<0.05)。5.用DCX阳性细胞标记未成熟神经元,TBI/LD组与Sham/LD组相比,海马DG区未成熟神经元数量增加,但TBI/LL组海马DG区未成熟神经元细胞数量明显减少(P<0.05)。大鼠脑损伤后伴随昼夜节律紊乱将使其体重减轻,神经功能损害症状加重,平衡运动能力及认知能力受到损害、大鼠脑损伤体积增加,同时脑内神经元生存数量及新生神经元数量减少。结论:第二部分昼夜节律紊乱对NGF治疗影响的机制研究目的:探讨昼夜节律紊乱对NGF治疗效果的影响及分子机制材料与方法:制备大鼠颅脑损伤模型,采用正常明暗环境(Light/Dark,LD)和夜晚灯光持续照射(Light/Light,LL)两种环境模式(即正常昼夜节律与昼夜节律紊乱),连续干预14天。实验大鼠随机分为3组:正常对照组(Sham/LD)、脑损伤正常节律加NGF治疗组(TBI/LD/NGF)、脑损伤昼夜节律紊乱加NGF治疗组(TBI/LL/NGF)。NGF治疗按32ug/kg剂量肌肉注射,连续注射14天。采用神经功能评分观察大鼠行为学改变;平衡木平衡实验及行走实验检测大鼠运动及平衡能力;水迷宫检测大鼠学习记忆能力改变;实时定量PCR大鼠脑组织中NGF受体Trk A和p75(NTR)通路相关基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2、BAX、JNK、Caspase-3 m RNA在转录水平的相对表达;Westernblot测定NGF受体信号通路Trk A、p75(NTR)、JNK、Caspase-3、AKT、NFKβ、NCo R、PARP蛋白含量;免疫荧光观察Trk A、p75(NTR)受体表达及星形胶质细胞增殖、小胶质细胞活化情况;TUNEL法检测脑损伤区域凋亡细胞数量;Elisa法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-β在血清和脑组织中的含量。结果:1.对各组大鼠神经功能评分及平衡木实验结果显示,TBI/LL/NGF组大鼠神经功能损害恢复明显延迟于TBI/LD/NGF组,损伤后14天时平衡木平衡时间明显缩短,同时行走时间延长(P<0.05)。2.水迷宫试验中,定位巡航阶段,TBI/LL/NGF组由于昼夜节律紊乱,潜伏期延长,学习能力低于TBI/LD/NGF组(P<0.05);在空间探索阶段,TBI/LD/NGF组空间探索时间及穿越平台次数明显多于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。3.实时定量PCR显示TBI/LD/NGF组在昼夜节律正常情况下NGF高亲和力受体Trk A、及细胞生长、分化相关基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表达增高,低亲和力p75及凋亡相关基因BAX、JNK、Caspase-3表达降低;相反在昼夜节律紊乱条件下Trk A、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表达降低,p75及凋亡相关基因BAX、JNK、Caspase-3表达呈增高趋势。同时Westernblot结果也与m RNA表达相一致。4.免疫荧光发现在TBI/LD/NGF组Trk A受体阳性细胞明显多于TBI/LL/NGF组(P<0.05),但是p75(NTR)阳性细胞少于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。TUNEL染色显示TBI/LD/NGF组凋亡细胞数量明显少于TBI/LL/NGF组(P<0.05)。5.免疫荧光对GFAP阳性星形胶质细胞标记显示在TBI/LL/NGF组星形胶质细胞反应性增生明显多于TBI/LD/NGF组(TBI/LL/NGF:466.90±65.10/field VS339.56±48.37/field,P<0.05);同时由于昼夜节律紊乱小胶质细胞活化也呈增多趋势(TBI/LL/NGF:115.60±23.62/field VS 65.40±12.55/field,P<0.05)。6.在血清及脑组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-β分泌TBI/LL/NGF组也明显高于TBI/LD/NGF组(P<0.05)。结论:在昼夜节律紊乱条件下,NGF对脑损伤治疗作用下降。与NGF在正常节律条件下相比,神经功能障碍及认知损害加重、细胞凋亡数目增多、炎症因子释放增加,可能与昼夜节律紊乱后激活低亲和力受体p75介导凋亡信号通路表达有关。
李雁[7]2010年在《神经生长因子在子宫腺肌病疼痛中的作用及其相关机制研究》文中认为子宫腺肌病是一种子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层,伴随子宫局灶或弥漫性增大的良性疾病。此病多发生于40岁以上的经产妇,患病率为5%-70%,子宫切除后腺肌病灶的检出率约为30%-60%。临床表现主要为经量增多和经期延长,以及逐渐加剧的进行性痛经。子宫腺肌病患者的痛经率高达64.8%-77.8%,此外还可以出现慢性盆腔痛、排便痛及性交痛。疼痛严重影响了女性的生殖健康和生活质量,但其机制尚未完全明确。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是一类在疼痛过程中起到关键调节作用的神经因子,主要通过低亲和力的P75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)与高亲和力的酪氨酸激酶受体A (tyrosine kinase A, trkA)发挥生物学作用,参与疼痛发生、发展的各个环节。研究表明NGF在内异症患者异位内膜高表达,且与疼痛相关,可能成为内异症及腺肌病疼痛研究中的关键环节。本课题检测NGF在腺肌病患者或动物模型子宫及脊髓背根神经节的表达变化,研究NGF表达与腺肌病本身及疼痛程度的关系,分析可能诱发NGF变化的原因,并通过检测NGF相关的神经植入、疼痛受体、局部炎症、中枢敏感性的变化,及NGF对腺肌病灶内膜间质细胞增殖、凋亡、雌激素合成关键酶表达的作用,探讨NGF参与子宫腺肌病疼痛的机制。第一部分子宫腺肌病患者腺肌灶NGF表达与神经植入及疼痛程度的关系目的研究NGF在子宫腺肌病患者病灶内膜的表达及其与患者疼痛评分及病灶局部神经植入密度的关系。方法选择2009年3月-10月在复旦大学附属妇产科医院院行子宫切除的腺肌病患者45例,子宫切除且否认疼痛的宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ期及子宫肌瘤患者共26例,所有病例均经病理组织学确诊。于术中取腺肌病患者病灶内膜或子宫肌瘤及CIN患者在位内膜,免疫组化法显示神经生长因子(NGF)表达；免疫荧光法显示蛋白基因产物9.5(PGP9.5)阳性神经纤维植入；视觉评分系统(VAS)评测腺肌病患者痛经、慢性盆腔痛及性交痛的程度。结果腺肌病疼痛组患者病灶NGF表达强度及PGP9.5阳性神经纤维植入密度高于腺肌病无痛组及对照组(p<0.05)；腺肌病痛经重痛组NGF表达强度及PGP9.5阳性神经纤维植入密度高于腺肌病痛经轻中痛组及对照组(p<0.05)；NGF表达强度及PGP9.5阳性神经纤维植入密度与腺肌病患者是否出现慢性盆腔痛及性交痛无关；腺肌病患者病灶NGF表达强度与PGP9.5阳性神经纤维密度变化具有相关性(r=0.31,p<0.05)。结论腺肌病患者病灶处NGF高表达可能参了患者痛经的发生机制,而促进病灶内膜神经纤维植入是其机制之一。第二部分NGF及其受体在子宫腺肌病小鼠子宫及脊髓背根神经节的表达目的使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宫腺肌病模型并鉴定；检测NGF及其受体在腺肌病小鼠模型子宫及脊髓背根神经节(DRGs)的表达随动情周期及病情进展的变化。方法新生ICR小鼠连续4d滴喂他莫昔芬为造模组,并与同龄对照小鼠分别于42 d、85-95 d、135-145 d、185-195 d、235-245 d龄处死(每组4-5只),取双子宫及T13至L2脊髓背根神经节。使用苏木素-伊红染色检测子宫病理改变；阴道脱落细胞法检测动情周期变化；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测子宫缓激肽受体1(BKR-1)、神经激肽1受体(NK1-R)的基因表达；免疫组化补体31(CD31)染色计算子宫微血管的密度、直径及所占面积比；免疫组化PGP9.5及SP染色计算神经纤维密度；免疫组化检测NGF及其受体在子宫的表达；蛋白印迹(Western-bolt)检测子宫NGF及其受体蛋白水平随动情周期及鼠龄增加的变化；实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT PCR)检测DRGs中NGF受体mRNA水平随鼠龄增加的变化。结果使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宫腺肌病模型的造模率为100%,且疾病严重程度随鼠龄增加进展；85-95d及135-145d龄造模小鼠子宫肌层微血管密度和面积比均高于对照小鼠(p<0.05)；135-145d造模小鼠子宫内膜及肌层PGP9.5阳性神经纤维、内膜SP阳性神经纤维植入密度高于对照组(p<0.05)；135-145d造模小鼠子宫BKR-1、NK1-R的基因表达较对照组明显升高(p<0.05)；免疫组化结果显示NGF在小鼠子宫内膜上皮细胞和间质细胞表达,p75NTR在子宫内膜间质细胞表达,trkA在子宫内膜上皮细胞及神经纤维表达；Western-bolt结果表明135-145d腺肌病鼠及对照鼠子宫NGF及其受体的表达随动情周期变化波动,NGF及p75表达水平在动情前期达高峰,trkA在动情期达高峰(p<0.05)；85-95d腺肌病小鼠NGF及其受体表达强度与对照组无差异,135-145d腺肌病小鼠子宫出现NGF前体及p75NTR表达增高(p<0.05),且随鼠龄增长腺肌病鼠子宫NGF、NGF前体及NGF受体的蛋白水平(p<0.05), DRGs中trkA的mRNA水平均增高(p<0.05),对照鼠未见此变化。结论口服他莫昔芬法可有效建立ICR小鼠子宫腺肌病模型,模型小鼠出现腺肌病特征性病理改变及血管、神经、炎症、疼痛相关受体的表达异常,病情随鼠龄进展；腺肌病及对照小鼠子宫NGF及受体的表达受动情周期调节,随疾病进展增强；腺肌病小鼠DRGs中trkA表达增强可能是中枢神经敏感性增强的原因之一；腺肌病子宫NGF表达与BKR-1及NK1-R所反映的局部组织、神经炎症变化一致。第三部分腺肌病患者异位内膜间质细胞NGF表达的影响因素及其对间质细胞的调控作用研究目的研究影响腺肌病患者子宫内膜间质细胞NGF表达的因素及NGF对子宫内膜间质细胞增殖、凋亡、雌激素合成的作用。方法选择2009年5月-10月在复旦大学附属妇产科医院院行子宫切除的腺肌病患者为实验组,子宫切除宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ期及子宫肌瘤患者为对照组。于术中取实验组病灶内膜或对照组在位内膜分离子宫内膜间质细胞(ESC)并行原代培养。免疫组化法显示ESC的NGF及其受体表达；于培养体系中分别加入不同浓度17β-雌二醇、肿瘤坏死因子(TNF)及氯化钴(CoCl2),western-bolt检测实验组及对照组ESC合成NGF蛋白水平的变化；于培养体系中加入不同浓度NGF, MTT法检测两组ESC增殖变化,real time RT-PCR与western-bolt法分别检测两组ESC合成芳香化酶的：mRNA及蛋白水平变化；培养体系中加入H2O2或CoCl2诱导ESC凋亡并加入不同浓度NGF, MTT法检测ESC凋亡变化。结果腺肌病及对照组ESC均表达NGF及其受体p75NTR,均不表达trkA。外源性17β-雌二醇可促进腺肌病ESC合成NGF,但对对照组ESC无此作用；外源性TNF可促进腺肌病组与对照组NGF的合成；CoCl2缺氧可降低对照组ESC合成NGF,但对腺肌病ESC无此作用；外源性NGF可明显促进腺肌病ESC增殖及芳香化酶的合成,但对对照组ESC无此作用；外源性NGF对两组ESC H2O2及CoCl2诱导的凋亡均无保护作用。结论17β-雌二醇与TNF均可促进腺肌病患者ESC表达NGF; NGF可促进腺肌病患者ESC增殖及雌激素合成关键酶的表达。
李红梅[8]2011年在《人类膜蛋白p75NTR/BNIP3L与p75NTR/BFAR相互作用及其生物学功能的初步研究》文中进行了进一步梳理神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是神经营养因子家族成员之一,与神经系统的发育、分化和生存密切相关。NGF有两种受体,分别是高亲和力受体TrkA和低亲和力受体p75NTR,两者都是Ⅰ型单跨膜蛋白,分布在多种细胞表面。TrkA是酪氨酸蛋白激酶(tyrosine kinase)家族成员之一,与NGF发生特异性结合,调控细胞的发育、增殖和分化。p75NTR是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员,其胞外区包含四个Cys富集结构域,胞内区含有一个死亡结构域。p75NTR可与神经营养因子家族中的所有成员(NGF。BDNF、NT3、NT4、NT5)结合。p75NTR能够与高亲和力受体TrkA协同作用促进细胞存活,另一重要功能是诱导细胞凋亡,通过与细胞内配体结合,介导死亡信号,目前p75NTR下游配体研究还不是很清楚,其是如何行使诱导凋亡的机制还有待进一步研究。神经生长因子是神经系统的正常发育所必需的分子,其是通过与细胞膜表面的受体结合而起作用的,进而维持神经系统的健康。本研究以p75NTR为主要对象,为了更好的发现p75NTR新的相互作用蛋白,采用新型膜蛋白酵母双杂交系统—DUALmembrane system筛选人胎脑cDNA文库,初步发现了38个与p75NTR相互作用的蛋白,并构建了膜蛋白酵母双杂交筛选平台。DUALmembrane system是利用蛋白泛素化降解的特点和可分离的泛素两部分互补来检测膜蛋白相互作用的,含有三个报告基因(HIS3、ADE2和LacZ),最突出的特点是可用于筛选或检测整合蛋白、膜相关蛋白间的相互作用,并且可以检测发生翻译后修饰的蛋白间相互作用。新发现的互作蛋白中,BNIP3L和BFAR引起了我们的关注,接下来我们对p75NTR与BNIP3L及p75NTR与BFAR这两对相互作用进行了深入研究。BNIP3L (Bcl-2/EIB19kDa-interacting protein3-like),是Bcl-2家族成员,BNIP3的同族体。分布在内质网膜上,含有两个功能结构域,凋亡效应结构域(bcl-2homologue3, BH3)和跨膜结构域(transmembrane, TM),属于BH3only促凋亡家族,能与Bcl-2、Bcl-xL、E1B19K等抗凋亡蛋白相互作用,促进细胞凋亡我们通过膜蛋白酵母双杂交共转试验、GST-PULL DOWN和CO-IP试验证实p75NTR与BNIP3L在体外、体内能够发生相互作用,发现p75NTR胞内区是与BNIP3L发生相互作用的关键区域,p75NTR胞外区则不与BNIP3L发生相互作用。BNIP3L与p75NTR可共定位于细胞质中。同时,在双荧光素酶检测试验中发现PC-12细胞中转染BNIP3L后p53信号通路活性上调了4.5倍。没有NGF存在情况下,p75NTR和BNIP3L共转染PC-12细胞能够促进凋亡反应发生；NGF刺激PC-12后大大消弱凋亡信号。RNAi BNIP3L能降低p75NTR诱导的细胞凋亡作用。由此我们推测BNIP3L可能是p75NTR基因行使凋亡功能的过程中能与其结合的一个配体。研究p75NTR与BNIP3L这对蛋白间相互作用对揭示p75NTR诱导凋亡的分子机理具有一定提示作用。双功能凋亡调节子(Bifunctional apoptosis regulator, BFAR)是一个能够抑制凋亡信号通路的蛋白,它是一个多结构域的蛋白,包含4个可识别结构域(RING、 SAM、DED、TM),功能主要是阻碍Fas介导外部凋亡通路和Bax诱导的内部凋亡通路。BFAR能够对抗凋亡从而起到保护细胞的作用。我们通过膜蛋白酵母双杂交共转验证试验、GST-PULL DOWN和CO-IP试验对p75NTR与BFAR在体外、体内能够相互作用的特异性进行了验证,荧光共定位试验发现两者可共定位于细胞质中。此外,荧光素酶检测试验中我们发现在PC-12细胞中高表达BFAR能够抑制NF-KB和JNK信号通路。cell cycle试验中发现转染BFAR使细胞周期中G2/M期细胞含量增多,S期细胞减少。FACS检测细胞凋亡试验中发现p75NTR和BFAR共转染组与对照组相比没有促进凋亡的作用。BFAR与p75NTR是一对功能拮抗的相互作用蛋白,进一步研究BFAR与p75NTR互作是如何介导神经细胞自我保护的机制,可能可以提供一个治疗神经退行性疾病药物靶点的新线索。
高强[9]2004年在《转神经生长因子基因诱导神经母细胞瘤分化的研究》文中研究说明目的：采用酶消化法体外培养出纯净的人神经母细胞瘤细胞系，用神经特异烯醇化酶染色、软琼脂克隆形成实验来进一步鉴定细胞，为下一步的实验做好细胞的准备工作。 方法：无菌条件下，取本院住院手术的神经母细胞瘤病人的新鲜标本．选取肿瘤未坏死部分，放入盛有DMEM培养液的无菌瓶内，瓶周围放置冰块，迅速送至细胞净化培养室。通过消化培养法培养细胞，将神经母细胞瘤细胞放入DMEM培养液，补加10％胎牛血清及青、链霉素，置于37℃、5％CO_2、100％湿度的二氧化碳培养箱内培养；将培养的细胞通过机械刮除法和选择性酶消化法进行分离与纯化，建立细胞系，作为细胞模型。采用细胞形态学、NSE免疫组化染色、软琼脂单克隆形成实验对所培养细胞进行检测鉴定。 结果：消化培养方法效果好，当天即可见从肿瘤标本上消化下来的细胞，全部为小圆形细胞，第2天即可见细胞的形态变化，成小梭形。分离纯化后的肿瘤细胞形态基本一致，成一端或两端胞浆突起的短梭形细胞，NB细胞呈小梭形，部分呈泪滴状，少数呈三角形，这种为幼稚型细胞。有些细胞胞浆突起延长，被视为成熟型细胞。NSE染色及软琼脂克隆形成实验结果证实所培养细胞为神经母细胞瘤细胞。 结论：本实验用酶消化法将NB肿瘤病人的新鲜肿瘤标本建成了神经母细胞瘤细胞系。
马岚[10]2002年在《猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究》文中研究说明本论文以猕猴胚胎干细胞为主要研究对象,在猕猴胚胎干细胞的分离、培养及鉴定方面、猕猴胚胎干细胞体外持续培养体系的建立及优化方面、应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究LIF对介导胚胎着床的滋养层细胞分化的影响效应方面、以及应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究三种光敏药物的光敏毒性以及光敏生物活性方面进行了研究。研究主要获得了以下结果:1、通过猕猴卵母细胞体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外培养技术,由4只超排的成年猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个于HECM-10培养体系培养后,获得了6个高质量的猕猴囊胚,由此自然孵出的囊胚中分离得到6个内细胞团,并由此最终获得1株具有高核仁/胞质比,具有明显的核仁,集落边界清楚,其内的细胞明晰的,具有胚胎干细胞特征的猕猴类ES细胞——RS5细胞。经5个月的连续传代后,RS5细胞仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目与正常猕猴的一样,均为42条。碱性磷酸酶组织化学染色,结果表明为阳性,说明此细胞为未分化态的原始类胚胎干细胞。由胚胎干细胞多能性分化的初步研究结果来看,在高密度和解除抑止的状态下,此RS5细胞是能进一步发展为多种分化细胞的。2、建立了猕猴胚胎干细胞RS366.4体外持续培养、扩增及冻存培养体系。3、白血病抑制因子(LIF)在胚胎着床中起着重要作用??LIF可通过参与人滋养层细胞分化而介导胚泡着床。已有的关于LIF与滋养层细胞分化间关系的研究结果是相互矛盾的。为避免由早期胚胎标本或胎盘来源的细胞滋养层细胞模型的不足,本实验选用由猕猴RS366.4 ES细胞来源的早期分化滋养层细胞为模型进行研究。细胞流式仪结果表明低浓度的LIF可促进绒毛合胞体滋养层的分化,高浓度的LIF可促进绒毛外侵入性滋养层细胞的分化。细胞免疫组化结果则显示经LIF处理后,侵入性绒毛滋养层细胞的标志物之一?? Fibronectin呈阳性。4、北醌化合物为性能优良的光敏剂。本研究首次以R366.4 ES细胞为模型,测试了EA的光敏毒性,并首次报道了EA的光敏生物活性。经不同光照时间处理后,低浓度的光敏化的EA对R366.4细胞均无细胞毒性作用。在此浓度范围内,对于Hce-8693细胞,EA,HA及HB则均以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡,其光敏抑制效应顺序为HA > EA > HB。对于B16细胞,EA也以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡。这些结果表明EA、HA及HB均有较显著的光敏抑癌生物活性。
参考文献：
[1]. 神经生长因子低亲和力受体克隆，表达及其诱导细胞凋亡的分子机制研究[D]. 顾继杰. 中国协和医科大学. 1996
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[3]. 神经生长因子对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及相关机制研究[D]. 李博. 重庆大学. 2017
[4]. NGF对肝纤维化大鼠HSCs的促凋亡作用及p75受体的研究[D]. 陈新. 河北医科大学. 2006
[5]. 神经生长因子在人脑胶质瘤中的表达特点及其临床意义[D]. 李巧玉. 江苏大学. 2011
[6]. 昼夜节律紊乱对大鼠脑损伤病理改变及NGF治疗影响的实验研究[D]. 李东朋. 郑州大学. 2016
[7]. 神经生长因子在子宫腺肌病疼痛中的作用及其相关机制研究[D]. 李雁. 复旦大学. 2010
[8]. 人类膜蛋白p75NTR/BNIP3L与p75NTR/BFAR相互作用及其生物学功能的初步研究[D]. 李红梅. 复旦大学. 2011
[9]. 转神经生长因子基因诱导神经母细胞瘤分化的研究[D]. 高强. 青岛大学. 2004
[10]. 猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究[D]. 马岚. 中国科学院研究生院（昆明动物研究所）. 2002
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