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【摘要】目的：对利巴韦林颗粒应用2015年版中国药典中微生物限度检查法进行微生物限度检查的方法进行验证。方法：按设立的验证试验方法，采用3批样品独立进行平行试验，对微生物计数法和控制菌检查法进行验证。结论：利巴韦林颗粒的微生物计数法检查可采用倾注法；控制菌检查法采用常规法。
【关键词】利巴韦林颗粒；方法验证；微生物限度
[ 中图分类号 ]R2[ 文献标号 ]A[ 文章编号 ]2095-7165（2018）23-0235-03
1 引言
2015年版《中国药典》于2015年12月01日实施，微生物限度检验方法发生了重大的变化，充分借鉴美国药典、欧洲药典等成熟经验，从操作洁净区环境，计数方法、培养基种类，判断标准，方法学验证等方面做出了修订。为了确保该方法在实验室适应性。应对适用此方法的药品进行方法验证。
2 实验材料
2.1 实验材料
2.1.1 样品
利巴韦林颗粒。
2.1.2 验证试验菌种
铜绿假单胞菌，大肠埃希菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，黑曲霉。
2.1.3 试剂培养基
无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0），0.9%无菌氯化钠溶液，胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯固体培养基
2.1.4 实验器材与用具
万分之一电子天平、高压灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、洁净操作台、隔水式恒温培养箱、生化培养箱等。
3 实验方法与步骤
3.1 溶液制备
3.1.1 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释液）制备：
取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨l.00g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
3.1.2 0.9%无菌氯化钠的制备：
称取9g氯化钠，加水1000ml溶解后，湿热灭菌。
3.1.3 供试品溶液的制备
称取样品10g，加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀制成1：10均匀的供试品溶液。
3.1.4 菌液制备
临用前，将1.1ml0.9%无菌氯化钠中加入各种定量菌株瓶中(每颗含500-1000cfu)，盖上瓶盖，静置约30s，漩涡震荡5-10s，即得。
3.2 需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数方法验证(平皿法之倾注法)
3.2.1 试验组：取供试品溶液9.9ml五份，至试管中，分别加入金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，白色念珠菌、黑曲霉试验菌液0.1ml
3.2.2 菌液对照组：取:稀释液替代供试品溶液，按试验组操作
3.2.3 供试品对照组：取制好的供试品溶液，以稀释液代替菌液同试验组操作
3.2.4 取上述3组溶液各1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45℃的相应培养基中，混匀，凝固，将金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉置于胰酪大豆胨琼脂培养基中，在30-35℃培养不超过3天；将白色念珠菌、黑曲霉置于沙氏葡萄糖琼脂培养基，在20-25℃培养不超过5天。每种菌株每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。
3.2.5 结果判断：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，则符合试验结果，可按此方法进行微生物限度测定；试验中试验组的菌数比值若不在0.5～2范围内，则不符合试验结果要求，应建立新的方法消除供试品的抑菌性并重新进行试验。
3.4 控制菌(大肠埃希菌)检查方法验证
3.4.1 试验组：按控制菌检査法取规定量供试品溶液10ml及不大于100cfu 的大肠埃希菌菌液注人100ml胰酪大豆胨液体培养基中30-35℃培养18-24h。
3.4.2 阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，加至约100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30-35℃培养18-24h。
3.4.3 阳性对照组：取不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，加至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，30-35℃培养18-24h。
3.4.4 检查：取上述培养物lml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42?44℃培 养24?48小时。取麦康凯液培养物划接种于麦康凯琼脂培养基平皿上，30?35°C培养 18?72小时。
3.4.5 结果判断：上述试验若检出试验菌，按此供试品溶液制法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验 。如果供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，受抑制的微生物不易存在于供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
4 结果与分析
4.1 平皿法用于需氧菌总数计数验证结果
4.3 一般法用于控制菌总检查验证结果
5 结论
5.1 利巴韦林颗粒的微生物限度检查，其中需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数方法选用倾注法)，供试液（1:10）加入量为1ml。
5.2 大肠埃希菌检查可采用常规法进行，供试液（1:10）加入量为10ml。
参考文献：
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版(四部)北京:中国医药科技出版社,20l5.06：140-149.
[2]严佳，钟桂香，贺全山.我国药品微生物限度检查的发展历程.药学实践杂志,2010：28(3)
论文作者:彭正英,莫列云
论文发表刊物:《医师在线》2018年23期
论文发表时间:2019/4/9
标签：培养基论文; 氯化钠论文; 方法论文; 微生物论文; 溶液论文; 蛋白胨论文; 琼脂论文; 《医师在线》2018年23期论文;