刘文波[1]2005年在《表达ILTV gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgY重链恒定区基因重组鸡痘病毒免疫效力的研究》文中提出传染性喉气管炎(Infectious laryngotractheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各地，被OIE列为B类传染病。上世纪60年代，我国也发现本病。此后，相继在许多省市流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失。目前国内外主要使用弱毒疫苗预防本病，但它们都存在着疫苗株毒力偏强、潜伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株无法鉴别的缺点，从而不利于ILT的根除。随着分子生物学的发展，利用基因工程疫苗预防ILT已成为人们的共识。禽痘病毒载体是继痘苗病毒以后发展起来的又一动物病毒载体。由于禽痘病毒具有宿主范围窄，可插入较大的外源基因，在动物体内能产生一过性感染，却能诱发保护性免疫应答，易于工业化生产等优点，使其从众多的活病毒载体中脱颖而出，成为当前重组病毒载体疫苗研究的热点，并且在人和许多动物重要传染病重组疫苗的研制中得到广泛应用。本研究利用鸡痘病毒弱毒疫苗株282 E4株为载体，构建了表达ILTV烟台株gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgY重链恒定区基因的重组鸡痘病毒，并检测了其对鸡抵抗ILTV强毒株攻击的免疫保护作用。研究主要包括以下几个方面： 1．传染性喉气管炎病毒烟台株TK基因的序列测定及TK蛋白结构功能初步分析 根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)美国632株TK基因序列设计并合成1对引物，以烟台分离株为模板扩增了TK基因并对其进行了序列测定。结果表明，该基因包括1个1089 bp的完整开放阅读框架，可编码363个氨基酸组成的多肽。核苷酸序列比较分析发现，不同ILTV毒株之间TK基因相对保守，但与其他疱疹病毒之间同源性则比较低。氨基酸序列分析还发现，尽管与其他疱疹病毒的TK蛋白同源性较低，但ILTV TK蛋白也具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列：-DGXXGXGK-(ATP结合结构域)和-DRH-(核苷酸结合结构域)，以及5个保守的Cys残基。这些Cys残基可能是通过形成二硫键来维持TK蛋白氨基酸的功能构象，使ATP结合结构域与核苷酸结合结构域在空间上相互重迭，并与底物靠近发生反应，从而发挥TK蛋白的功能。 2．传染性喉气管炎病毒烟台株gE基因的序列测定及gE蛋白结构功能初步分析 根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)美国标准攻毒毒株gE基因序列设计并合成1对引物，以烟台株为模板，PCR法扩增出1条1.5 kb的gE基因片段，并将其克隆至
廖仲磊[2]2008年在《鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因核酸疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫效力观察》文中指出鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病,呈全球性流行,是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强,可以在鸡体内潜伏感染,而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此,研制更安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除ILT。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低,还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击,因此,本研究采用PCR技术从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,构建gB基因重组真核表达质粒,并将其与鸡IL-18基因重组真核表达质粒联合免疫SPF鸡,探索ILTV HN1株gB基因的免疫原性以及鸡IL-18的免疫增强作用,以期为更好地防制ILT提供新的思路。研究内容如下：1.根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列(M64927)设计、合成了1对引物,以ILTV HN1株基因组DNA为模板,从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了ILTV HN1株gB基因,全长为2629bp,包含一个完整的开放阅读框,共编码873个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,ILTV HN1株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV HN1株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28-32位5个氨基酸的移码突变。2.根据真核表达载体pcDNA3.1(+)和ILTV gB全基因核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切获得的gB基因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB(简称pgB)。将pgB质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),RT-PCR表明转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测表明目的蛋白在CEF中得到了表达。3.通过RT-PCF技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接从罗曼鸡脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增鸡IL-18全基因,并克隆和测序。结果表明,鸡IL-18基因全长为597bp。与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,罗曼鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致。将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18(简称pIL-18)。经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ叹酶切、PCR扩增和基因测序,证实鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3.1(+)真核表达质粒上；将pIL-18质粒转染Cos7细胞,转染细胞中含鸡IL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。4.为了检测这2个质粒是否可以诱导动物机体产生特异性免疫,分别用这2个重组质粒和载体质粒pcDNA3.1(+)以及减毒疫苗免疫接种21日龄SPF鸡,免疫分组(A)pgB,(B)pIL-18,(C)pgB和pIL-18,(D)减毒疫苗和pIL-18,(E)减毒疫苗,(F)pcDNA3.1(+),(G)Control。免疫2次,间隔为2周,每次每只鸡的免疫剂量为100μg。以MTT法检测鸡外周血淋巴细胞经丝分裂原ConA刺激后的增殖反应活性,Real-time PCR检测细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平、流式细胞术检测外周血CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞的变化及间接ELISA法检测血清抗体水平。结果表明,ILTV gB基因免疫诱导机体产生了较强的淋巴细胞增殖反应,免疫组外周血中CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞明显高于对照组,含IL-18基因的两组(C和D)诱导了高水平的IFN-γ和IL-2表达,载体质粒和空白对照组没有变化,血清抗体在免疫后第2周发生阳转,而对照组无相应变化。这是ILTV基因gB基因和鸡IL-18基因免疫研究的首次报道。第2次免疫后3周,所有鸡以ILTVHN1株强毒0.4mL进行攻毒。攻毒后,非免疫鸡全部发病,并在第2天出现死亡,免疫组部分发病,ILTV HN1株gB基因单独或与鸡IL-18基因联合免疫的保护率分别为79%、86%,而对照组仅为7%。这表明ILTV HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合免疫提供了较强的免疫保护,这为ILTV的防制开辟了新的途径。
杨明凡[3]2008年在《表达鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与鸡IL-2基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病,本病给养鸡业造成较大的经济损失。目前主要应用致弱的喉气管炎病毒作为弱毒疫苗,但是由于鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗株也能引起潜伏感染,并在鸡群与鸡群之间传播过程中毒力会返强,从而成为新的感染源,因此,研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。本文将ILTV河南长葛株的gD基因与鸡IL-2基因重组禽痘病毒转移载体,得到一株重组病毒。试验研究主要从以下几个方面展开:1.ILTV河南长葛株分离鉴定及其gB、gC和gD基因的克隆与序列分析鸡胚尿囊膜接种和琼脂扩散试验对分离病毒进行鉴定,结果表明所分离病毒为ILTV,从而获得一株ILTV河南长葛株。并分别克隆其gB、gC和gD基因,测定其核苷酸序列,将其核苷酸与GenBank公布的ILTV相应序列进行分析和同源性比较,结果长葛分离株ILTV的gB、gC和gD基因3个序列分别与GenBank登录的ILTV gB、gC和gD基因序列存在很高的同源性,其同源性在99.7%～99.9%之间,说明ILTV的gB、gC和gD基因序列相对保守。2.ILTV长葛株gB、gC和gD基因真核表达载体的构建及其免疫效果研究将ILTV长葛株gB、gC和gD基因插入pcDNA3.1中,构建了真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC和pcDNA-gD。间接免疫荧光检测结果表明,叁种重组质粒均能够在PK-15细胞中表达。以SPF鸡为试验动物,肌内注射构建的pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和pcDNA3.1空载体进行免疫接种。微量血清中和试验检测结果显示,构建的真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和活疫苗均能够诱导机体产生较高的抗体水平;MTT法检测表明构建的真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD及活疫苗对照均能够诱导淋巴细胞增殖,同时也能够诱导强的CTL细胞的增殖。表明构建的载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和弱毒疫苗均能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。3.ILTV长葛株gD基因的表达及间接ELISA检测方法的初步建立将ILTV gD基因插入到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET28-gD。将pET28-gD转化到宿主表达菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达目的蛋白大小为55ku,Western-blotting表明表达产物具有良好的免疫原性。表达的蛋白产物经纯化后作为ELISA包被抗原,初步建立了间接ELISA诊断方法,并确定了抗原最佳包被浓度为24.5μg·mL;最佳血清稀释度为1∶320,初步确定ELISA判定标准为OD_(450)≥0.25判为阳性,小于0.25为阴性。试验证明建立的间接ELISA具有很强的特异性和较高的敏感性且与多种病毒抗原无交叉反应。用初步建立的ELISA和微量血清中和试验检测临床送检的84份血清样品。结果两种方法的阳性符合率为96.5%(28/29),阴性符合率为98.2%(55/56),表明建立的方法可用于临床上ILT的检测。4.表达ILTV长葛株gD基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验将ILTV长葛株gD基因同源重组到禽痘病毒基因组中,得到能高效表达ILTV gD基因的重组禽痘病毒(rFPV-ILTV-gD)。将rFPV-ILTV-gD和ILT弱毒疫苗同时免疫试验鸡,同时设非免疫对照鸡群。血清中和抗体检测结果表明:疫苗组与重组病毒组差异不显着(p＞0.05),而重组病毒组和疫苗组与空白对照组差异均显着(p＜0.05)。免疫42d攻毒试验表明,重组病毒组和疫苗组对ILTV强毒攻击的保护率均为96.67%,而空白对照组为6.67%。说明该重组病毒作为弱毒疫苗能够抵抗ILTV强毒的攻击,对免疫鸡群有较好的保护作用。5.ILTV河南长葛株gD基因与鸡IL-2串联重组禽痘病毒的构建及免疫效力试验将ILTV长葛株的gD基因与鸡IL-2串联到禽痘病毒表达载体中,转染后获得一株重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD,该重组病毒能够高效表达ILTV gD基因。将重组病毒rFPV-ILTV-gD、rFPV-IL2-ILTV-gD和ILT弱毒疫苗免疫试验动物;同时设空白对照。免疫后ELISA检测结果表明疫苗组与重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组、重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD与重组病毒rFPV-ILTV-gD抗体效价相比差异不显着(p＞0.05),而重组病毒组rFPV-IL2-ILTV-gD、重组病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗组与空白对照组抗体效价相比,差异均显着(p＜0.05)。免疫28d攻毒后每组鸡的发病情况表明重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组、重组病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96%、92%和96%,而空白对照组为8%。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD与商品弱毒疫苗的免疫效力相当,能够较好的保护免疫鸡群。
郑海洲[4]2004年在《鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及表达的研究》文中研究表明鸡传染性喉气管是一种遍布世界各地的急性接触性呼吸道传染病，由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起，以呼吸困难、咳嗽、常咳出带血渗出物为发病特征。ILTV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，目前多用鸡传染性喉气管炎的弱毒疫苗进行预防，其中大部分弱毒疫苗株具有温和的致病性，因此可能有毒力返强的危险。 近年，ILTV基因组的大部分序列及其功能已经确定，这为基因工程疫苗的研制奠定了基础。研究表明ILTV属于疱疹病毒D型基因组，gB基因编码205KD糖蛋白复合物，能诱导体液免疫和细胞免疫，是该病毒的主要保护性抗原基因，也是研究基因工程疫苗的首选目的基因，表达gB糖蛋白是预防传染性喉气管炎的新方法。 本论文以疫苗株ILTV基因组为模板扩增出gB基因片段连接到载体DGEM-T Vector，对目的片段gB基因进行了序列测定和同源性分析，与英国Thome V882毒株、美国ILTV632毒株、澳大利亚SA 2毒株gB基因的核苷酸同源性分别为100％、100％和99.4％，氨基酸同源性分别为99.8％，99.9％和98.7％，说明它是十分保守的。然后将gB基因定向克隆于原核表达载体pBV221中构建了重组质粒pBV-gB，将其转化到受体菌DH5α中，菌株DH5α(pBV-gB)经温控诱导后，SDS-PAGE电泳可见表达的特异蛋白条带。ELISA检测说明gB基因在大肠杆菌中的表达产物具有很好的反应原性，但是鸡胚中和试验结果表明该重组菌株仅能部分中和1个EID_(50)剂量的北京株ILTV强毒。 原核表达的目的蛋白缺少生物活性和免疫原性，活载体疫苗可以克服这一缺点，因此本论文又构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pRR-α-gB，并将其电转化至耻垢分枝杆菌，ELISA检测表明重组菌株M．smegmatis mc~2 155(pRR-α-gB)的表达产物具有很好的反应原性。Western blot检测说明ILTV的gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和1个EID_(50)剂量的ILTV强毒，能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击。它在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒。此外，该重组菌株免疫的鸡可以通过血清学方法与自然感染ILTV的鸡加以区别。因此本实验研究的工程菌M．smegmatis mc~2 155(pRR-α-gB)将有希望取代现用的ILTV弱毒疫苗，彻底改变ILT防制现状。
张晶[5]2004年在《传染性喉气管炎病毒gB基因片段的高效表达及tgB-ELISA方法的建立》文中进行了进一步梳理传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是鸡的一种病毒性呼吸道传染病，可引起鸡死亡或者产蛋下降而造成生产的严重损失。对传染性喉气管炎病毒（ILTV）的gＢ蛋白进行抗原性分析，设计引物扩增免疫原性较强片段，并在片段上引入EcoRI、SalI酶切位点。将目的片段分别插入表达载体pET30a(+)后，得到重组表达质粒pET-tgB,再将其转化大肠杆菌BL21中，经过IPTG诱导后分子量约为37ku的带有6个His标签的融合蛋白His-tgB得到了高水平的表达,薄层扫描确定融合蛋白His-tgB的表达量约为菌体蛋白的40.6%,Western blotting检测表明，His-tgB具有免疫学反应性。用纯化后的His-tgB蛋白免疫4月龄健康新西兰兔，制备了多克隆血清。对重组蛋白His-tgB过柱纯化后，作为抗原包被聚苯乙烯微量反应板，初步建立了ILTV抗体的间接ELISA检测法，其抗原最适包被量为5μl/ml。血清最适工作浓度为1:100。在最适工作条件下检测90份SPF鸡血清，统计学分析后确定本试验的判定标准为OD值≥0.15时，即判定为阳性。用该方法检测SPF鸡血清及其它鸡疫病阳性血清均为阴性。用该方法对传染性喉气管炎全病毒处理的阳性血清在1∶100稀释时，测定OD值下降了47.2%；而且，对其他疾病阳性血清的检测全部为阴性，证明该方法与其他疾病血清没有交叉反应性。该方法与ILTV全病毒抗原ELISA共同检测已知样品，其结果显示二者的符合率可达99.6%。目前，我们对400多份临床样品进行了检测，结果表明该方法可以检测免疫后的抗体变化曲线，因而可以用于ILTV感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测。
姬向波[6]2006年在《传染性喉气管炎（ILTV）重组鸡痘病毒（rFPV-gB-gD-IgG）和DNA（pcDNA-gB）疫苗对鸡免疫效果的研究》文中进行了进一步梳理传染性喉气管炎(Infectious laryngotractheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各地，被OIE列为B类传染病。上世纪60年代，我国也发现本病。此后，相继在许多省市流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失。目前国内外主要使用弱毒疫苗预防本病，但它们都存在着疫苗株毒力偏强、潜伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株无法鉴别的缺点，从而不利于ILT的根除。随着分子生物学的发展，利用基因工程疫苗预防ILT已成为人们的共识。其中重组病毒活疫苗由于其自身优势，成为防制传染病的研究热点；而核酸疫苗也越来越受到研究者的关注。本研究利用鸡痘病毒弱毒疫苗株282 E4株为载体，构建了表达ILTV烟台株gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgG重链恒定区基因的重组鸡痘病毒；并构建了包含ILTV主要抗原基因的DNA疫苗，检测了两种疫苗单独或联合使用时，诱导鸡产生的体液免疫和细胞免疫情况。研究主要包括以下几个方面： 1．传染性喉气管炎病毒烟台株gB基因的克隆和DNA疫苗的构建 以传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株基因组DNA为模板，根据已发表的ILTV SA-2株基因序列设计并合成1对引物，在上下游分别添加KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点，PCR扩增出一条2.7kb的片段，测序结果表明：gB基因长2619bp，包含完整的阅读框架，编码873个氨基酸。将该片段亚克隆到pcDNA3.5真核表达载体中，酶切分析表明成功构建了真核表达质粒pcDNA-gB。参照《分子克隆》大量提取质粒pcDNA-gB转染cos-7细胞，间接免疫荧光表明该蛋白获得表达，为下一步DNA免疫奠定了基础。 2．目的片段的选取及重组鸡痘病毒转移载体pEF-gB-gD-IgG的构建 以传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株基因组DNA为模板，根据已发表的ILTV SA-2株基因序列设计并合成2对引物，分别扩增其gB和gD的主要抗原表位基因，同时人工合成IgG重链恒定区第900～1400基因。在gB上游引物5’端添加ATG GCG，gD上游引物5’端设计一个9个氨基酸的linker(-GSLAGALGL-)，在合成的IgG重链恒定区基因3’端添加TAA，使gB及gD主要抗原表位基因与IgG重链恒定区基因连接后形成一个完整的阅读框架。将gB和gD片段分别亚克隆到pBluescript Ⅱ SK(+)中，得到重组质粒pSK-gB-gD。然后将从重组质粒pSK-gB-gD酶切回收得到的gB-gD
黄海琼[7]2013年在《表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建》文中研究指明鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的急性呼吸道疾病。该病具有急性爆发和潜伏感染的特点,给养禽业造成巨大的经济损失。由于ILTV弱毒疫苗能引起潜伏感染,并且在鸡群中的传播会造成毒力返强,从而成为新的感染来源；因此,迫切需要研制安全、高效的新型ILT疫苗。本研究以马立克氏病毒(MDV) CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,构建表达ILTV保护性抗原gB糖蛋白的重组病毒,并分别评价重组病毒对ILT和马立克氏病的免疫效果。本研究以CVI988/Rispens疫苗毒株基因组短独特区的sorf1和sorf2作为ILTV gB基因插入位点,以网状内皮增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)为启动子、绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,构建转移载体质粒pMDV-gB-GFP。用磷酸钙共沉淀法将pMDV-gB-GFP和CVI988/Rispens基因组DNA共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,获得带有EGFP标志的重组病毒；经有限稀释法纯化、筛选,获得带有EGFP标志的重组病毒rMDV-gB-GFP。用Cre重组酶去除rMDV-gB-GFP的EGFP基因,得到重组病毒rMDV-gB。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot试验鉴定,证明重组病毒rMDV-gB基因组中插入了ILTV gB基因,并能表达ILTV gB糖蛋白。本研究评价了rMDV-gB对ILTV强毒株攻击的免疫保护效果。将90只1日龄SPF鸡随机分成4组：rMDV-gB免疫组、rMDV-gB与ILTV弱毒疫苗联合免疫组、ILTV弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组。前两组的试验鸡1日龄时分别颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的rMDV-gB;第二组和第叁组的试验鸡于21日龄时接种1羽份的ILTV弱毒疫苗；42日龄时,各组试验鸡均用105EID50/鸡的ILTV强毒株攻击。观察试验鸡的症状表现,并于攻毒后第10天进行剖检和病理组织学检查。结果显示,在ILTV强毒株攻击后,rMDV-gB免疫组的保护率为65%,而ILTV弱毒疫苗组的保护率为41%,rMDV-gB的保护效力明显高于ILTV弱毒疫苗。本研究还发现,在1日龄雏鸡接种rMDV-gB后,再于21日龄接种ILTV弱毒疫苗,并不能提高对ILTV强毒株攻击的保护作用；表明1日龄雏鸡接种rMDV-gB后就能建立起针对ILTV的有效免疫力。本研究还评价了rMDV-gB对MDV RB1B超强毒株攻击的免疫保护效果。将60只1日龄SPF鸡随机分为3个试验组：rMDV-gB免疫组、CV1988/Rispens免疫组、攻毒对照组,每组20只试验鸡；rMDV-gB免疫组和CVI988/Rispens免疫组的试验鸡分别于1日龄时颈皮下接种5000PFU/鸡的相应疫苗；7日龄时,所有试验鸡经腹腔接种500PFU/鸡的MDV RB1B超强毒株。连续观察90天,记录各试验组鸡的发病和死亡情况。经统计,攻毒对照组90%的鸡死于马立克氏病,而rMDV-gB免疫组和CVI988/Rispens疫苗组的保护率均为100%,表明rMDV-gB可对MDV超强毒株的攻击能产生足够的保护。
张绍杰[8]2000年在《表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中研究表明鸡传染性喉气管炎 （Infection Lnyngotrcheitis Vrus，ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各国，我国在50年代发现本病，现己在许多省份流行。目前国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫茵，但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点：（l）由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关，因此，现用的疫苗毒力普遍偏强，接种后反应大；（2）与ILTV强毒一样，其弱毒疫由株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终主带毒；（3）疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡，鸡群与鸡群之间传插过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；（4）到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。因此，研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。 糖蛋白 gB是ILTV的主要保护性抗原，它能诱导机体产生体液和细胞介导的保护性免疫应答，是该病毒感染复制必需的蛋白。根据已经发表的ILTV SA。疫苗株的gB基因序列，设计了一对特异性引物，然后通过PCR方法扩增了ILTV中国王岗株的gB基因，并克隆到PUC质粒的EcORI位点中。序列分析结果表明克隆的PCR片段含有2619hp核昔酸，包含了完整的gB基因阅读框架。序列比较分析结果显示，ILTV王岗株（强毒株）的gB基因核昔酸序列与英国的Throne 882株和美国的632株（二者均为强毒株）的 gB基因核昔酸序列完全一致，而与澳大利亚 SAZ株（弱毒株）的gB基因核昔酸的同一性为99．8％，氨基酸的同一性为98．4％。叁株ILTV强毒和弱毒比较，弱毒 gB基因在第 89位和第 102位分别发生了一个碱基的插入和缺失，结果导致5 个氢基酸的移码突变，即由强毒的“川＊－C卜11eJie－＊印”变成弱毒的“GIy·切－Asn·Asn－Ser。 将克隆到pUCllg中的ILTV糖蛋白gB基因再亚克隆至杆状病毒转移载体pVL1393中，形成重组质粒甲VLgB。将pVLgB与杆状病毒线性DNA（BAC－N－BlueDNA）共转染Sffi昆虫细胞，经叁轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒pVL－ILTVgB。通过PCR方法鉴定证明gB基因被正确插人到杆状病毒基因组中；直接免疫荧光试验结果也表明 ILTV gB基因在重组秆状病毒感染的 Sfg昆虫细胞中被表达。表达的糖蛋白gB作为亚单位疫苗用于下一步的免疫试验。 将克隆在pUCllg中的gB基因和大肠杆菌的L。Z基因分别亚克隆到禽痘病毒转移质粒中然后将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S－FPV－017 t苗株感染的SPF I张扭杰双达传贝佐顺气管炎间写怵蠢困且阑禹区们＠的构巨及江免沤戮力研灾Zboo年6月鸡胚成纤维细胞中，通过蓝斑筛选出重组鸡痘病毒（rFPV－ILTVgB），并对其进行了 6轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明，其基因组中含有完整的ILTV gB基因：“巾悦＊＿．M删实验也证明了该重组病毒在其感染的sPr 4胚成纤维细胞中表达了ILTV f蛋白gB。 用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种6周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立7组（每组】0只鸡）：第1组用商品化V弱毒疫苗点眼免疫：第2组用rFPV－ILTVgB翅皮下注射免疫；第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射兔疫；第车组用rFPV－ILTVgB免疫2次，间隔2周；第5组用rFPV－ILTVgB一免，2周后用重组杆状病毒表达的 ILTV gB蛋白二免；第 6组用含 ILTV gB基因的重组质粒一免，2周后用 rFPV－ILTVgB二免；第7组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后 4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种6周龄的商品鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组（每组20只鸡）：第1组用两品化n下V弱毒疫茵点眼兔疫；第2组用：FPV－f VSB翅皮下注射免疫：第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射免疫；第4组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含rFPV－ILTVgB免疫组的SPF鸡或商品鸡均100％保护而免于死亡；！LTV弱毒疫苗免疫的SPF鸡也获100％保护，但ILTV弱毒疫苗免疫的商品鸡在攻毒后有15％死亡；攻毒后SPF鸡对照组死亡率为90％，商品鸡对照组死亡率为60％；所有二次免疫组没有表现明显的免疫增强作用。免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV－ILTVgh诱导的抗ILTV抗体水平与 ILTV弱毒疫苗相当；攻毒后进行的 ILTV分离和 PCR检测结果表明 ILTV弱毒疫苗免疫的SPF 鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染，但在商品鸡上不如rFPV－ILTVgB ti。 综合以上实验结果，重组鸡疽病毒rFPV－ILTVgB不仅能诱导体液免疫，也能诱导机体产生针对ILTV的细胞免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病霉与现用弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒。此外，该重组鸡疽病毒免疫的鸡可以通过血清学方法与自然感染ILTV的鸡加以区别。因此，本实验研究的rFPV－ILTVgB疫苗将有希望从根本上取代现用的ILTV弱毒疫苗，彻底改变ILT防制现状。
胡文玮[9]2008年在《表达禽流感病毒HA、NA基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建》文中提出鸡痘病毒（Fowlpox virus，FPV）是重要的动物病毒表达载体，在疾病的控制中起到了重要的作用，以鸡痘病毒为载体已经研制出许多种重组病毒疫苗，其中有的已经商业化。构建表达多个病原体基因的重组鸡痘载体疫苗对于面临多种疾病威胁的养禽业来说尤其具有重要的意义。禽流感(Avian influenza，AI)、传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）和鸡痘（Fowlpox）是均能引起感染禽呼吸道疾病，给养禽业造成了严重的经济损失。目前传统方法制备的疫苗对防制这些疾病起到了有效的作用。但常规疫苗的使用存在一些难以克服的缺陷，如影响疫情监测、生产成本高等，需要能够区分野毒感染的、生产成本高的新型疫苗来替代常规疫苗。本试验分别将H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的HA和NA基因、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）的gB基因插入到鸡痘病毒转移载体早晚期启动子LP2EP2之下，构建同时含有HA、NA和gB基因以及报告基因LacZ（晚期启动子P11控制之下）鸡痘病毒转移载体。利用脂质体转染技术将转移载体导入到事先感染鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞中，经过6轮蓝斑纯化获得了包含了AIV的HA和NA基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒，称为rFPV-HA/NA/gB。PCR检测证明，rFPV-HA/NA/gB基因组中含有完整的AIV的HA、NA基因和ILTV的gB基因；间接免疫荧光试验和Western-blot试验证明，AIV的HA、NA蛋白和ILTV的gB蛋白在rFPV-HA/NA/gB感染的CEF细胞中均能获得表达。
孟松树[10]2000年在《传染性喉气管炎病毒基因免疫的研究》文中研究指明鸡传染性喉气管炎（ILT）是由传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的一种鸡急性上呼吸道传染病，呈全球性流行，是危害养禽业的重要疫病之一。目前ILT的防制都是使用减毒活疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强，可以在鸡体内潜伏感染，而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此，研制更安全而有效的疫苗，将有利于彻底控制乃至根除ILT。gB是ILTV的主要免疫原，已经证实α疱疹病毒的gC和gD在诱导机体免疫应答方面也有重要作用。因此，本研究在构建了表达ILTV主要抗原基因的真核表达质粒的基础上进行了ILTV基因免疫的效力及CpG佐剂作用的研究，为ILTV的防制探索新的途径。 根据已发表的ILTV SA2疫苗株的gB、gD基因序列设计了两对引物，以ILTV王岗株DNA为模板，通过PCR方法分别扩增了ILTV王岗株的gB、gD基因，扩增产物经EcoRI酶切后克隆至真核表达载体质粒pCR3-Uni中，得到重组真核表达质粒PgB和PgD。对PgB、PgD进行序列分析，结果表明，ILTV王岗株gB基因的编码序列全长2619bp，与英国的Throne882和美国的632强毒株的gB基因序列完全一致，与SA2株相应序列的核苷酸同一性为99.8％。ILTV王岗株gD基因的编码序列全长1134bp，与SA2株相应序列的核苷酸同一性为97％。将已克隆的王岗株gC基因亚克隆至真核表达质粒pCR3-Uni，得到重组质粒PgC。序列分析结果表明，ILTV王岗株gC基因编码序列全长1245bp，与SA2株相应序列的核苷酸同一性为99％。 将重组质粒PgB、PgC、PgD及空载体质粒大量纯化后进行动物免疫试验。试验分组如下：（A）生理盐水；（B）空载体质粒；（C）减毒疫苗；（D）PgB；（E）PgB+PgC+PgD。质粒组（B、D、E）的免疫剂量为100ug/羽，E组叁种质粒的剂量各为100ug/羽，用前混匀，质粒四点肌肉注射SPF鸡，叁周龄时第一次免疫，五周龄时第二次免疫，C组五周龄时滴眼接种减毒疫苗。以MTT法测定免疫后不同周龄各组鸡胸腺、法氏囊淋巴细胞的增殖反应活性，以间接ELISA法测定血清抗体水平。对免疫鸡九周龄时以致死剂量的ILTV王岗株攻击，统计攻毒后的发病、死亡、保护情况及病毒检测结果。实验结果表明，ILTV基因免疫诱导了较强的淋巴细胞增殖反应，攻毒后血清抗体在免疫后第二周发生阳转，并在加强免疫后达到高峰，而对照组无相应变化。攻毒后各组鸡的存活率为，重组质粒组（D和E组）79％，减毒疫苗组（C组）100％，对照组（A和B组）14％，这一结果表明ILTV基因免疫产生了较强的保护作用。孟松树传染性喉气管炎肩毒基因兔疫的研究2000年6月 将！LTV ＆因疫苗即由或PgB＋PgC＋PgD与宫含CpG序列的细菌DNA联合免疫SPF鸡，检测免疫后不同周龄鸡胸腺、法氏羹淋巴细胞的增殖反应活性及血清抗体水平，并观测攻毒后的免疫保护惰况。结果表明，与不加 CpG DNA的基因兔疫组相比，CpG DNA槽强了胸腺、法氏羹淋巴细胞的增殖活性，血清抗体水平有所提高，发病串和死亡率明显降低，攻毒后存活串有 79％提右到 86％，这表明 CpG DNA对 ILTV基因免疫效果有明显的增强作用。 本研究是IW ＄因免疫的首次报道，为ILTV新型疫苗的研制奠定了基础。
参考文献：
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[5]. 传染性喉气管炎病毒gB基因片段的高效表达及tgB-ELISA方法的建立[D]. 张晶. 内蒙古农业大学. 2004
[6]. 传染性喉气管炎（ILTV）重组鸡痘病毒（rFPV-gB-gD-IgG）和DNA（pcDNA-gB）疫苗对鸡免疫效果的研究[D]. 姬向波. 南京农业大学. 2006
[7]. 表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建[D]. 黄海琼. 扬州大学. 2013
[8]. 表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 张绍杰. 中国农业科学院. 2000
[9]. 表达禽流感病毒HA、NA基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建[D]. 胡文玮. 中国农业科学院. 2008
[10]. 传染性喉气管炎病毒基因免疫的研究[D]. 孟松树. 中国农业科学院. 2000